Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов

За последние годы представления о роли активных форм кислорода (АФК) в регуляции внутриклеточных процессов существенно расширились. Показано участие АФК в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки и экспрессии генов. АФК играют важную роль в таких процессах, как иммунные реакции, эмбриогенез, разнообразные патологии на организменном уровне.

Основным источником АФК в клетке являются трансмембранные ферментативные комплексы — КАБРН-оксидазы. Так известно, что при стимуляции тирозинкиназных рецепторов происходит активация КАБРН-оксидазы, которая продуцирует супероксид-анион и как следствие пероксид водорода (Н202).

Из всех АФК только Н202 обладает всеми необходимыми свойствами для выполнения функции вторичного мессенджера. Так, Н202 относительно стабилен по сравнению с другими АФК, благодаря маленьким размерам и отсутствию полярности Н202 способен легко диффундировать во внутриклеточной среде, в том числе сквозь липидные бислои. Н202 играет роль внутриклеточного вторичного мессенджера, действуя путем специфичного обратимого окисления небольшого числа активных тиоловых групп в остатках цистеинов тирозиновых фосфатаз и других белков-регуляторов процессов внутриклеточной передачи сигнала.

Предполагают, что внутриклеточные сигнальные эффекты Н202 осуществляются в соответствии с моделью компартментализованной окислительно-восстановительной передачи сигнала, когда белок-мишень и источник Н202 находятся в непосредственной близости друг от друга. Действительно, в настоящий момент известны специфические сайты локализации ИАОРН-оксидаз и их регуляторных белков в различных внутриклеточных компартментах, а также важное значение таких сайтов для процессов клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки. Однако до сих пор не удавалось визуализировать локальную продукцию Н202 в клетке и выявить внутриклеточные мембранные компартменты, ответственные за продукцию Н202 при активации сигнальных каскадов.

Изучение динамики и локализации продукции Н202 в ходе разнообразных клеточных процессов представлялось невозможным до недавнего времени. Благодаря появлению в арсенале генетически кодируемых сенсоров на основе флуоресцентных белков стало возможным проводить исследования сигнальной роли Н202 на уровне индивидуальных живых клеток. По сравнению с химически синтезированными флуоресцентными красителями, генетически кодируемые сенсоры имеют ряд преимуществ. Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекциииспользование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить подобные индикаторы в различные компартменты живой клеткитакже могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие генетически кодируемые сенсоры в определенных тканях в определенный период времени. Особый научно-практический интерес представляет собой возможность использования таких индикаторов для изучения внутриклеточной локальной продукции и динамики изменения концентрации Н202, что не удавалось исследовать с помощью химических индикаторов.

Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием Н202 разработка новых подходов использования генетически кодируемых индикаторов представляется актуальной задачей. Не менее важным является изучение базовых принципов организации окислительно-восстановительной передачи сигнала в клетке.

Продукция Н202 специализированными ферментативными системами является частью сложных сигнальных каскадов, в которых задействовано множество ферментов и вторичных мессенджеров. Так, например, окислительно-восстановительная передача сигнала тесно взаимосвязана с продукцией липидных мессенджеров — фосфорилированных форм фосфатидилинозитола. Поэтому важной задачей является разработка методов одновременной регистрации активностей нескольких сигнальных систем в одной клетке.

Нарушения нормальной внутриклеточной продукции Н202 связаны с тяжелыми нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, с патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного Н202 в клеточных процессах важно как для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала, так и для биомедицинских исследований.

Выводы.

1. На основе биосенсора НуРег созданы локализованные флуоресцентные индикаторы РБСРЯ-НуРег, ЕвРЯ-НуРег и НуРег-ТА для детекции Н2О2 в близком окружении рецепторов РБОРЯ и ЕвРЯ, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума.

2. С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н2О2 в клетке в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов. Установлено, что в клетках эпителиальной линии НеЬа-Куо1о продукция Н2О2 происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии МН-ЗТЗ продукция Н202 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н202.

3. Диффузия Н2Ог в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1−2 МКМ, ТО есть мишенью Н2О2 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

4. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор В1кРН-Е41К-НуРег для одновременной детекции Н202 и активности фосфатидилинозитол-З'-киназы. На клетках линии ШН-ЗТЗ продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием В1кРН-Е41 К-НуРег впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукция Н2О2 в области иммунологического синапса в СБ4+ Тн-лимфоцитах.

Заключение

.

В настоящей работе предложен новый подход к исследованию распределения и динамики изменения концентрации Н202 в различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки с помощью локализованных вариантов белка-индикатора НуРег.

С помощью индикатора ЕОРЯ-НуРег в стимулированных эпидермальным ростовым фактором клетках НеЬа-КуоШ впервые было показано, что значительная продукция Н202 происходит на эндосомах, а не на плазматической мембране. Таким образом, эндосомы, содержащие интернализованный ЕвРЯ и продуцирующие Н202, играют важную роль в поддержании каскада фосфорилирования: активный рецептор фосфорилирует субстраты, а продуцирующийся здесь же Н202 ингибирует РТР, создавая, таким образом, петлю положительной обратной связи. Кроме того, использование ЕОРЯ-НуРег позволило определить, что в цитоплазме клеток свободная диффузия Н202 в значительной степени ограничена (до 1−2 мкм).

В фибробластах линии МН-ЗТЗ с помощью индикатора РБОРЯ-НуРег была показана продукция Н202, локализованная преимущественно на плазматической мембране. В отличие от клеток НеЬа-КуоШ, активация ЫА1) РН-оксидаз на плазматической мембране в фибробластах свидетельствует о возможных внеклеточных мишенях Н202, продуцируемого в ответ на активацию РБвРЯ.

С помощью индикатора НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и ШН-ЗТЗ была показана продукция Н202, быстро активирующаяся на эндоплазматическом ретикулуме в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов. Такой быстрый рост концентрации Н202 на эндоплазматическом ретикулуме сразу после стимуляции клеток может быть необходим для немедленного ингибирования фосфатазы РТР-1 В на мембране эндоплазматического ретикулума. Окисление НуРег-ТА после активации и ЕвРЯ и РБОРЯ может служить моделью для изучения роли ингибирования РТР-1 В пероксидом водорода.

Таким образом, используя данный подход, удалось впервые визуализировать локальную продукцию Н202 в индивидуальных живых клетках в ответ на физиологическую стимуляцию ростовыми факторами. Полученные данные подтверждают гипотезу о компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации, а также позволяют лучше понять роль Н202 в клетках в нормальном физиологическом состоянии.

Для исследования взаимосвязи продукции Н202 и активации Р1-ЗК был создан «двойной» индикатор В1кРН-Е41К-НуРег, позволяющий одновременно следить за изменением концентраций Н202 и фосфатидилинозитол-3,4,5-фосфата. Тестирование работы индикатора в фибробластах МН-ЗТЗ в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов показало возможность одновременной детекции продукции Н2О2 и Р1Р3. В СБ4+ Тн-лимфоцитах с помощью В1кРН-Е41 К-НуРег удалось впервые показать локальную активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукцию Н2О2 в области иммунологического синапса. Важно заметить, что преимуществом «двойного» индикатора является возможность использования всего одной экспрессионной конструкции для детекции двух параметров в клетке. Другим очевидным преимуществом является то, что спектральные свойства В1кРН-Е41 К-Нурег позволяют одновременно независимо наблюдать также за другими флуоресцентными белками, которые имеют спектр, неперекрывающийся со спектром белка НуРег, что позволяет добавить еще один параметр для исследования в той же клетке.

Полученный индикатор В1кРН-Е41 К-НуРег может быть использован как прототип для создания других подобных индикаторов с комбинированными свойствами. Подобные многопараметрические генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы могут быть востребованы в широком круге задач системной биологии.