Исследование функциональных комплексов рибосомы методом криоэлектронной микроскопии

Прорывы в той или другой области знаний часто связаны с созданием принципиально новых методов исследования. Одним из ярких примеров является электронная микроскопия, оказывающая большое влияние на развитие химии и биологии. Человек всегда хотел быть богом, он хотел творить и создавать, а как можно что-либо создавать, не познав, как оно устроено?! Поэтому современная наука старается понять строение всего живого, понять, как все организовано и из чего состоит. Мы все дальше и дальше проникаем в суть процессов, которые идут в клетке элементарной единице всего живого. Мы уже знаем многое о строении клетки и клеточных органелл, и кажется, что осталось дело за малым понять, как же устроены отдельные молекулы внутри клетки, а узнав их строение, попробовать понять, как эти сложные молекулярные ансамбли работают вместе. В данной работе показаны возможности одного из современных методов исследования структуры макромолекул криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения структуры и функции макромолекул на примере рибонуклеопротеидного комплекса рибосомы. Большая часть обзора литературы посвящена описанию этого метода. Прокариотическая рибосома, седиментирующая как 70S частица, состоит из двух субъединиц большой, с коэффициентом седиментации 50S, и малой, с коэффициентом седиментации 30S. Каждая из субъединиц на 60% (по массе) состоит из РНК. Малая содержит декодирующий центр, координирующий правильные взаимодействия между матричной РНК (мРНК) и транспортной РНК (тРНК), что определяет аминокислотную последовательность синтезируемого на рибосоме белка. Большая субъединица катализирует образование пептидной связи. Рибосома была открьгга в 50-х годах, и тогда никого не удивило, что помимо РНК она содержит еще и белки. Поскольку она катализирует биосинтез белка, а ферменты являются белками, то все было ясно роль рибосомных белков заключается в катализе образования пептидной связи. Представления о роли и функции рибосомной РНК (рРНК) и белков были, по мере накопления биохимических данных, пересмотрены. После установления структуры рибосомы и ее субчастиц с атомным разрешением стало понятно, что рибосома является рибозимом, в то время как белки помогают поддерживать компактную структуру рРНК. Тем не менее, знания структуры рибосомы явно не достаточно для понимания механизма трансляции. Дело в том, что процесс синтеза белка многостадиен, причем в каждую стадию вовлечены определенные белковые факторы. Как же работают эти факторы, как они взаимодействуют между собой?! Получить ответ на этот вопрос с помощью рентгеноструктурного анализа (PCА) в большинстве случаев не удается. В то же время криоэлектронная микроскопия формирует отдельное направление в изучении молекулярных ансамблей биологических молекул, которые часто бывают либо слишком велики, либо слишком лабильны для иззения их методом РСА. Важно, что крио-ЭМ позволяет характеризовать перестройки в макромолекулярных комплексах и таким образом изучать динамику биологических процессов. Примеры таких исследований для рибосомных комплексов рассматриваются в обзоре литературы и этому посвящена диссертационная работа. Криоэлектронная микроскопия «одной частицы» в исследовании структуры макромолекул 4.1 Метод криоэлектронной микроскопии «одной частицы» и его перспективы Все больше и больше структур белков решается методом рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Использование баз данных позволяет определять структурно-функциональные домены в белке, что в свою очередь ведет к возможности связать структуру белка с его функцией. В то же время внимание ученых сейчас смещается в область изучения взаимодействия макромолекул внутри клетки. Представляется важным и интересным отследить образование комплекса макромолекул, взаимодействие компонентов комплекса, определить места посадки лигандов, для чего приходится привлекать новые подходы. Рентгеноструктурный анализ мощный метод определения трехмерной структуры отдельных белков имеет ряд ограничений, когда мы переходим к изучению крупных макромолекулярных комплексов: 1. Зачастую крупный комплекс не удается Зсжристаллизовать вовсе, или это удается сделать только после того, как из него удалены наиболее конформационно лабильные компоненты- 2. Условия кристаллизации чаще всего далеки от таковых в клетке, что может вызвать перестройку всего комплекса или отдельных его компонентов- 3. Чем больше комплекс, тем больше нужно данных, для того чтобы точно описать трехмерную структуру. Кроме того, в кристаллографии приходится преодолевать также фазовую проблему. Информация о строении кристалла при рентгеноструктурном анализе представлена в виде дифракционной картины. Молекула белка упакована в кристаллической решетке определенным образом и чтобы определить от какой части молекулы происходит тот или иной рефлекс (сигнал) приходится применять сложные вычисления или вводить в строго определенные места молекулы тяжелоатомные производные. Криоэлектронная микроскопия «одной частицы» не имеет этих ограничений. Данный метод позволяет изучать молекулы без получения кристаллов. Исследование комплексов проводят в условиях, приближенных к существующим в клетке. Крио-ЭМ дает возможность изучить различные функциональные состояния комплекса. Проблема криоэлектронной пространственном микроскопии разрешении. «одной Однако частицы» здесь на это ограничение в помощь приходит рентгеноструктурный анализ. Часто трехмерная структура отдельных компонентов комплекса или молекул, им гомологичных, оказывается известной. В этом случае в карту электронной плотности «низкого разрешения» вписьшают данные рентгеноструктурного анализа, что позволяет предсказать точки взаимодействий между компонентами комплекса. Часто для того чтобы быгь уверенными в своих предположениях, комплексы получают в системах in vitro, что, конечно же, уводит нас от внутриклеточных условий. Однако во многих случаях удается показать, что такие комплексы очень близки по своим свойствам к комплексам, существующим в клетке [см. например [1]]. 4.1.1. Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы» Как особый метод крио-ЭМ используется уже в течение 20 лет [[2]- [3]]. Сам же метод был изобретен около 40 лет назад Тэйлором и Глайсером (Taylor Glaeser). Изначально крио-ЭМ использовали только для изучения высоко упорядоченных образцов, таких, как скрученные белковые волокна (актин), двумерные кристаллы (например, кристаллы с одним или двумя липидными слоями), и высоко симметричньгх структур, таких, как вирусы. Только образцы такого рода позволяли получать результаты с хорошим разрешением. Хотя при исследовании вышеперечисленных объектов были достигнуты большие успехи, для белков с нормальными размерами рентгеноструктурный анализ был предпочтительней. При исследовании двумерных кристаллов метод крио-ЭМ столкнулся с непреодолимыми трудностями, такими какнарушения в структуре двумерных кристаллов и проблемы при использованием больших углов ячейки, используемой в криоэлектронной микроскопии в так называемой «серии углов» (tilt series). Наиболее перспективным для изучения методом крио-ЭМ оказались мембранные белки, но, к сожалению, лишь в нескольких работах удалось достичь атомарного разрешения. Для высокомолекулярных комплексов ф одинаково трудным оказалось получение как двумерных (пригодных для крио-ЭМ так и трехмерных (пригодных для РСА) кристаллов. Все попытки разрешить структуру рибосом, используя микроскопию двумерных кристаллов [[4], [5]], провалились из-за плохой упорядоченности кристаллов. Потенциально более широкая область применения крио-ЭМ бьша создана после разработки так назьшаемого метода реконструкции «одной частицы», для использования которого нужно иметь много копий одной молекулы. Этот метод [[6], Р [7], [8], [9]] и его предшественник [[10] [И], [12], [13], [14], [15], [16]] были разработаны изначально для образцов, приготовленных методом негативного контрастирования, но успех метода был ограничен артефактными включениями в процессе приготовления образца. При негативном контрастировании, которое использовалось до изобретения крио-ЭМ, водный образец смешивали с 1−2% раствором соли тяжелого металла и высушивали на воздухе. На микроскопической ячейке молекулы, приготовленные таким образом, были хорошо видны, а ионы тяжелого металла повышали контраст на электронной микрофотографии. Кнопка остановки uМеталлический стержень Направляющее кольцо щш, Т| Пинцет Крио-ячейка Пенопласт Рис. 1. А. Общая схема плунжерного устройства для быстрой заморозки образца. Б. Общий вид плунжерного устройства. В, Г. Мгновенная заморозка образца. Однако, кроме того, что при этом нельзя было увидеть разницу в электронной плотности внутри молекулы, негативное контрастирование вело и к изменению формы молекулы. В современном варианте метод предполагает быстрое охлаждение образца в жидком этане (рис. 1): Образец, нанесенный на ячейку для крио-ЭМ, висящую на самом кончике пинцета, быстро помещают в жидкий этан, находящийся при температуре жидкого азота (рис. 1). Этан обладает высокой теплопроводностью, поэтому образец замерзает мгновенно, благодаря чему образуется аморфный лед, 10 который обладает некоторыми общими оптическими свойствами с жидкой водой. Важно, что при этом не образуются кристаллы льда, которые могли бы повредить молекулу. Прогресс, достигнутый слиянием двух методов, крионегативного контрастирования и криоэлектронной микроскопии «одной частицы», может быть оценен при сравнении карт электронной плотности 70S рибосом E. coli, полученных методами негативного контрастирования и крио-ЭМ «одной частицы» [[17]]. В первом случее структура получилась рыхлой, без четкого межсубъединичного пространстватогда как во втором глобулярная и с четким.

1. Dubochet, J., et al., Cryo-electron microscopy of vitrified biological Trends Biochem. Sci., 1985.10: p. 143;

2. Lepault, J., F.P. Booy, and J. Dubochet, Electron microscopy of frozen suspensions. J Microsc, 1983.129 Pt 1: p. 89−102. specimens. biological Milligan, R.A. and P.N.T. Unwin, Location of exit channel for nascent protein in SOS ribosome. Nature (London), 1986. 319(6055): p. 693;

3. Yonath, A., K.R. Leonard, and H.G. Wittmann, A tunnel in the large ribosomal subunit revealed by three-dimensional image reconstruction. Science, 1987. 236(4803): p. 813−6. 6.

4. Radermacher, M., et al., A new 3-D reconstruction scheme applied to the SOS ribosomal subunit ofE. coli. J Microsc, 1986. 141 Pt 1): p. RPl;

5. Radermacher, M., et al. Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the SOS ribosomal subunit of Escherichia coli. J Microsc, 1987.146 Pt 2): p. 113−36. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

6. Radermacher, M., et al. Three-dimensional structure of the large ribosomal subunit from Escherichia coli. Embo J, 1987. 6(4): p. 1107−14. Van Heel, M., Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy, 1987. 21(2): p. 111;

7. Frank, J., Averaging of low exposure electron micrographs of non-periodic objects. Ultramicroscopy, 1975.1(2): p. 159;

8. Frank, J., et al., Reconstruction of glutamine synthetase using computer averaging. Ultramicroscopy, 1978. 3(3): p. 283;

9. Frank, J., A. Verschoor, and M. Boublik, Computer averaging of electron micrographs of 40S ribosomal subunits. Science, 1981. 214(4527): p. 1353−5. van Heel, M. and J. Frank, Use of multivariate statistics in analysing the images of biological macromolecules. Ultramicroscopy, 1981. 6(2): p. 187;

10. Verschoor, A., et al., Three-dimensional reconstruction of the 30 S ribosomal subunit from randomly oriented particle %W IBMs. J. Mol. Biol., 1984. 178(3): p. 677;

11. Boublik, M., et al. Structure of ribosomes and their components by advanced techniques of electron microscopy and computer image analysis. Struct., Funct., Genet. Ribosomes, [" Ribosome Conf." ], Meeting Date, 1985.

12. Frank, J., et al. New strategies for determining ribosomal subunit structure from electron micrographs by single particle. Biophys. J., 1986. 49(1): p. 9−11. 95.

13. Wagenknecht, Т., et al., Three-dimensional reconstruction Escherichia coli. Biophys J, 1989. 55(3): p. 455;

14. Boisset, N., et al. Three-dimensional 16−29. reconstruction of the ribosome from of Androctonus australis hemocyanin labeled with a monoclonal Fab fragment. J Struct Biol, 1995. 115(1): p. 19. 20. 21. 22. 23.

15. Frank, J., et al. Three-dimensional cryoelectron microscopy of ribosomes. RNA Ligand Interactions Pt A Structural Biology Methods, 2000. 317: p. 276;

16. Orlova, E.V., Structural analysis of non-crystalline macromolecules: the ribosome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56.(Pt 10): p. 1253;

17. Saibil, H.R., Macromolecular structure determination by cryo-electron Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56 P t 10): p. 1215;

18. Unwin, P.N. and R. Henderson, Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J Mol Biol, 1975. 94(3): p. 425;

19. Chiu, W., et al., Cryo-protection in electron microscopy. J. Mi-crosc, 1986. 141: p. 385;

20. Agrawal, R.K., et al., EF-G-dependent Biol, 1999. 6(7): p. 643−647. 25.

21. Frank, J. and R.K. Agrawal, A ratchet-like inter-subunit reorganization ribosome during translocation. Nature, 2000. 406: p. 318;

22. Kandror, O., et a l Trigger factor is involved in GroEL-dependent protein degradation in Escherichia coli and promotes binding of GroEL to unfolded proteins. Embo J, 1995.14(23): p. 6021−7. 27. 28. 29.

23. Rouiller, L, et al., A major conformational change in p97 AAA ATPase upon ATP binding. Mol Cell, 2000. 6(6): p. 1485;

24. Zhang, X., et al., Structure of the AAA ATPase p97. Mol Cell, 2000. 6(6): p. 1473;

25. Borland, L. and M. van Heel, Classification of image data in conjugate representation spaces. J. Opt. Soc. Am, 1990. A7: p. 601;

26. Frank, J., Three-dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies, in Three-dimensional electron microscopy of macromolecular a5. semW/e.s. 1996: New York. 31. 32. 33. 34. 35. van Heel, M., Classification of very large electron microscopial image data sets. Optik, 1989.82:p. 114;

27. Frank, J.a.W., Т., Automatic selection of molecular images from electron micrographs. Ultramicroscopic, 1984. 12: p. 169;

28. Lata, K. and P.a.F. Penczek, J. Automatic particle picking from electron micrographs, m Proceedings of the 52nd Annual Meeting MSA (New Orleans). 1994. San Francisco: San Francisco Press. 40. 41. 42.

29. Borland, L.a.v.H., M, Classification of image data in conjugate representation spaces. J.Opt.Soc.Am., 1990. A7: p. 601;

30. Ward, J.J., Hierarchical grouping to optimize an objective function. Am. Statist. Assoc, 1982. 58: p. 236;

31. Radermacher, M., et al., A new 3-D reconstruction scheme applied to the 50S ribosomalsubunit ofE.coli. J Microsc, 1986. 141: p. RPl;

32. Crowther, R.A., Procedures for three-dimensional reconstruction of spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci, 1971. 261(837): p. 221−30.

33. Penczek, P.A., J. Zhu, and J. Frank, A common-lines based method for orientations for N>3 particle projections simultaneously. 63(3−4): p. 205−218. 45. 46. 47. DeRosier, D.J.a.K., A., Reconstruction of three-dimensional structures from electron micrographs. Nature, 1968. 217: p. 130;

34. Goncharov, A.a.G., MS, Determitation ofmutaual orientation of indentical particles from their projections by the moments method. Ultramicroscopy, 1988. 25: p. 317;

35. Harauz, G. and F. Ottensmeyer, Direct 309−320.

36. Penczek, P.A., R.A. Grassucci, and J. Frank, The Ribosome at Improved Resolution New Techniques for Merging and Orientation Refinement in 3D 49.

37. Cryo-Electron biological Microscopy of Biological Particles. Ultramicroscopy, 1994. 53(3): p. 251;

38. Hoppe, W., et al. Three-dimensional electron microscopy of individual objects. I. Methods. Z. Natur-forsch, 1976. A31: p. 645;

39. Radermacher, reconstruction 51. M., et al., Cryo-electron microscopy and three-dimensional skeletal of the calcium release channel/ryanodine receptor from three-dimensional reconstruction for macromolecular complexes from electron micrographs. Ultramicroscopy, 1984. 12: p. determining Ultramicroscopy, 1996. muscle. J Cell Biol, 1994.127(2): p. 411;

40. Stewart, P.L., S.D. Fuller, and R.M. Burnett, Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. Embo J, 1993.12(7): p. 2589−99. 97.

41. Rossmann, M.G., Fitting atomic models into electron-microscopy Crystallogr D Biol Crystallogr, 2000. 56 Pt 10): p. 1341−9. maps. Acta Rayment, I., et al. Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science, 1993. 261(5117): p. 58;

42. Agrawal, R., et al. Visualization of elongation factor G on The Escherichia coli 70S ribosome: The mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. 95: p. 6134−6138. 55. 56. 57. 58.

43. Gabashvili, I.S., et al. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 angstrom resolution. Cell, 2000. 100(5): p. 537;

44. Stark, H., et al. Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal Ul small nuclear ribonucleoproteinparticle. Nature, 2001. 409(6819): p. 539;

45. Saibil, H., Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Curr Opin Struct Biol, 2000. 10(2): p. 251−8. van Heel, M. and H. G, Resolution criteria for three-dimensional Optik, 1986. 73: p. 119;

46. Bottcher, В., S.A. Wynne, and R.A. Crowther, Determination of the fold of the core protein of hepatitis В virus by electron cryomicroscopy. Nature, 1997. 386(6620): p. 88−91. reconstruction.

47. Malhotra, A., et al., E. coli JOS ribosome at 15 E resolution by 280: p. 103−116. cryo-electron microscopy: Localization offMet-tRNAJ and fitting of LI protein. J Mol Biol, 1998.

48. Orlova, E.V., et al. Structure of keyhole limpet hemocyanin type I (KLHl) at 15 A resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution. J Mol Biol, 1997. 271(3): p. 417−37.

49. Rosenthal, P.a.H.R., Optimal Determination of Particle Orientation, Absolute Hand, and Contras Loss in Single-particle Electron Cryomicroscopy. J.Mol.Biol., 2003. 333: p. 721−745. 63. 64. De Rosier, D.J., Electron cryomicroscopy. Who needs crystals anyway? Nature, 1997. 386(6620): p. 26;

50. Bremer, H. and P.P. Dermis, Modulation of chemical composition parameters of the cell by growth rate, in Escherichia 65. 66. and other coli and Salmonella, F.C. Neidhardt, et al., Editors. 1996, ASM Press: Washington D.C. p. 1553−1.

51. Bouadloun, P., D. Dormer, and C.G. Kurland, Codon-specific missense errors in vivo. EMBO J., 1983. 2: p. 1351−1.

52. Frank, J., et al. Three dimensional reconstruction of the 70S Escherichia 597−605.

53. Frank, J., et al., A Model of Protein Synthesis Based On Cryo-Electron Microscopy of the E-Coli Ribosome. Nature., 1995.376(6539): p. 441−444. coli ribosome in ice The distribution of ribosomal RNA. J. Cell Biol., 1991. 115(3): p. 98.

54. Stark, Н., et al., The 70S Echerichia coli ribosome at 23 E resolution: Fitting the ribosomal RNA. Structure, 1995. 3: p. 815;

55. Mueller, F. and R. Brimacombe, A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. II. The RNA-protein data. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 566−587.

56. Mueller, F. and R. Brimacombe, A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli I6S ribosomal RNA. L Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20. 1997.

57. Mueller, F. and R, Brimacombe, A New Model for the Three-dimensional Folding of Escherichia coli 16S Ribosomal RNA. П. The RNA-Protein Interaction Data. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 545−565.

58. Mueller, F., et al., A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. III. The topography of the functional centre. J. Mol. Biol., 1997. 271: p. 566−587.

60. Ban, N., et al. Placement of protein and RNA structures into a 5 Eresolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature, 1999. 400: p. 841;

61. Matadeen, R., et al. The Escherichia coli large ribosomal subunit at 7.5 A resolution. Structure with Folding Design, 1999. 7: p. 1575−1.

62. Valle, M., et al. Incorporation of aminoacyl-tRNA into the ribosome as seen by cryoelectron microscopy. Nat Struct Biol, 2003.10(11): p. 899−906. McCutcheon, J.P., et al. Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal subunit Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. 96(8): p. 4301−4.

63. Pioletti, M., et al. Crystal structures of complexes of the small ribosomal subunit with tetracycline, edeine andIF3. EMBO J., 2001. 20(8): p. 1829−1.

64. Potapov, A.P., A sterospecific mechanism for the aminoacyl-tRNA selection at the ribosome. FEBS Lett., 1982.146: p. 28;

65. Bourne, H.R., D.A. Sanders, and F. McCormick, The GTPase superfamily: conserverd structure and molecular mechanism. Nature, 1991. 349: p. 117;

66. Zavialov, A.V. and M. Ehrenberg, Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translational factors. Cell, 2003.114: p. 113;

67. Nissen, P., et al., The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science, 2000. 289(5481): p. 920;

68. Aevarsson, A., et al. Three-dimensional structure of the ribosomal 3677. 99 translocase: Elongation factor G from Thermus thermophilus. EMBO J., 1994. 13(16): p. 3669;

69. Czworkowski, J., et al. The crystal structure of elongation factor G complexed with GDP, at 2.7Eresolution. 123;

70. Fraser, СМ., et al., The minimal gene complement of Mycoplasma Science, 1995. 270: p. 397;

71. Hutchison, C.A., et al., Global transposon mutagenesis and a minimal genome. Science, 1999. 286(5447): p. 2165−2.

72. Inamine, J.M., et al. Evidence that UGA is read as tryptophan rather than stop by Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma gallisepticum. J. Bacteriol., 1990. 172: p. 504;

73. Mycoplasma genitalium. EMBO J., 1994. 13: p. 3661−3.

74. Valle, M., et al., Locking and Unlocking of Ribosomal Motions. Cell, 2003. 114: p. 90.

75. Osawa, S. and Т.Н. Jukes, On codon reassignment. J Mol Evol, 1995. 41(2): p. 247 249. OSullivan, J.M., J.B. Davenport, and M.F. Tuite, Codon reassignment 2001. 17(1): p. 20−2. and the evolving genetic code: problems and pitfalls in post-genome analysis. Trends Genet,.

76. Pel, H.J., et al. The yeast nuclear gene MRFl encodes a mitochondrial peptide chain release factor and cures several mitochondrial RNA splicing defects. Nucleic Acids Res, 1992. 20: p. 6339−6346. 93. 94. 95. 96.

77. Caskey, Т., et al. Peptide chain termination, codon, protein factor, and ribosomal requirements, in Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1969. p. 479;

78. Scolnick, E., et al. Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Nat. Acad. Sci., USA., 1968. 61: p. 768;

79. Caskey, СТ., et al. Cloning of the Escherichia coli release factor Bacterid., 1984.158(1): p. 365;

80. Weiss, R.B., J.P. Murphy, and J.A. Gallant, Genetic screen for cloned release factor genes. J. Bacteriol., 1984.158(1): p. 362;

81. Pel, H.J., M. Rep, and L.A. Grivell, Sequence Comparison of New Prokaryotic and Mitochondrial Members of the Polypeptide Chain Release Factor Family Predicts a 5-Domain Model for Release Factor Structure. Nucleic Acids Res, 1992. 20: p. 44 234 428.

82. Ito, K., et al., Conserved motifs in prokaryotic and eukaryotic polypeptide p. 5443−5448. 99.

83. Vestergaard, В., et al. Bacterial polypeptide release factor RF2 is structurally distinct from eukaryotic eRFl. Mol. Cell, 2001. 8(6): p. 1375−1.

84. Moffat, J.G., et al. Functional Domains in the Escherichia coli Release Factors Activities of Hybrids Between RF-1 and RF-2. Eur. J. Biochem., 1993. 213: p. 749 756. release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. 93(11): 2 gene. J. 100.

85. Klaholz, B.P., et al., Structure of the Escherichia coli ribosomal termination complex with release factor.

87. Rawat, U.B., et al., A cryo-electron microscopic study of ribosome-bound factor RF.

89. Beaudet, A.L. and C.T. Caskey, Mammalian peptide chain termination, II. Codon specificity and GTPase activity of RF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971. 68: p. 619 624. termination 105. 106. 107. 108.

90. Caskey, СТ., A.L. Beaudet, nd W. PvTate, Mammalian release factor: in vitro assay and purification. Methods Enzymol., 1974. 30: p. 293;

91. Konecki, D.S., et al. Characterization of reticulocyte release factor. J. Biol. Chem., 1977. 252: p. 4514−4.

92. Frolova, L., et al., A highly conserved eukaryotic protein family possessing of polypeptide chain release factor. Nature, 1994. 372: p. 701;

93. Bult, С J., et al. Complete genome sequence of the methanogenic Methanococcusjannaschii. Smith, D.R., et al. thermoautotrophicum Science, 1996. 273(5278): p. 1058−1.

94. Complete genome sequence of Methanobacterium J. analysis and comparative genomics. archaeon, properties deltaH: functional Bacterid., 1997.179(22): p. 7135−55. 110.

95. Klenk, H.P., et al. The complete genome sequence of the hyper thermophilic, sulphatereducing archaeon Archaeoglobus fulgidus. Nature, 1997. 390(6658): p. 364;

96. Dontsova, M., et al., Translation termination factor 472(2−3): p. 213−216.

97. Frolova, L., et al. Mutations in the highly conserved GGQ motif of class 1 polypeptide release factors abolish the ability of human eRFl to trigger peptidyl-tRNA RNA, 1999. 5: p. 1014−1020.

98. Song, H., et al., The crystal structure of human eukaryotic release factor eRFl Mechanism of stop codon recognition and peptidyl-tRNA hydrolysis. Cell, 2000. 100: p. 311−321. 114.

99. Bertram, G., et al. Terminating eukaryote translation: domain I of release factor eRFl functions in stop codon recognition. RNA, 2000. 6(9): p. 1236;

100. Tate, W., B. Greuer, and R. Brimacombe, Codon Recognition in Polypeptide Release Factor;

101. Nucleic Acids Res., 1990.18: p. 6537−6544.

102. Brown, C M and W.P. Tate, Direct recognition ofmRNA stop signals by Escherichia coli polypeptide chain release factor two. J Biol Chem, 1994. 269: p. 33 164−33.

103. Chain Termination Site Directed Crosslinking of Termination Codon to Escherichia coli hydrolysis. aRFl from the archaeon Methanococcus jannaschii is active with eukaryotic ribosomes. FEBS Lett., 2000. 101.

104. Poole, E., et al., Translational termination in Escherichia coli: three bases following the stop codon crossling to release factor 2 and affect the decoding efficiency containing signals. Nucleic Acids Res., 1998. 26: p. 954−960.

105. Ito, K., M. Uno, and Y. Nakamura, Single amino acid substitution in prokaryote polypeptide release factor 2 permits it to terminate translation at all three stop codons. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(14): p. 8165−9. 120. 121.

106. Ito, K., M. Uno, and Y. Nakamura, A tripeptide anticodon deciphers stop codons in messenger RNA. Nature, 2000. 403(6770): p. 680;

107. Nakamura, Y., K. Ito, and M. Ehrenberg, Mimicry grasps reality in translation termination. Cell, 2000. 101(4): p. 349;

108. Wilson, D.N., et al. Factor-mediated termination of protein synthesis: a welcome return to the mainstream of translation, Washington, DC. p. 495−508.

109. Pel, H.J., et al., Single Point Mutations in Domain-II of the Yeast 5308−5315. 124.

110. Askarian-Amiri, M.E., et al. Functional characterization release factor 1. J Biol Chem, 2000. 275(23): p. 17 241;

111. Wilson, D.N., et al., Protein synthesis Pept. Sci., 2002.3(l):p. 1−53. 126. 127.

112. Ogle, J.M., et al., Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science, 2001. 292(5518): p. 897;

113. Carter, A.P., et al., Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature, 2000. 407(6802): p. 340;

114. Fourmy, D., S. Yoshizawa, and J.D. Puglisi, Paromomycin binding induces a local conformational change in the A-Site ofl6SrRNA. 345. 129.

115. Fourmy, D., et al., Structure of the A-site of E. coli 16S ribosomal RNA complexed with an aminoglycoside antibiotic. Science, 1996. 274: p. 1367−1.

116. Lodmell, J.S. and A.E. Dahlberg, A Conformational Switch in Escherichia coli 16S Ribosomal RNA During Decoding of Messenger RNA. Science, 1997. 277: p. 12 621 267.

117. Inagaki, Y. and W.F. Doolittle, Class I release factors in ciliates with variant genetic codes. Nucleic Acids Res, 2001. 29(4): p. 921;

118. Lozupone, C.A., R.D. Knight, and L.F. Landweber, The molecular basis of nuclear genetic code change in ciliates. Curr Biol, 2001. 11(2): p. 65;

119. Velichutina, I.V., et al., Mutations in helix 27 of the yeast Saccharomyces p. 1174−1184. cerevisiae 18S rRNA affect the function of the decoding center of the ribosome. RNA, 2000. 6(8):

120. Uno, M., K. Ito, and Y. Nakamura, Functional specificity of amino acid at position 246 in the tRNA mimicry domain of bacterial release factor.

121. Biochimie, 1996. 78(11−12): p. 935−943.

122. Wilson, D.N., D. Guevremont, and W.P. Tate, The ribosomal binding and peptidyltRNA hydrolysis functions of Escherichia coli release factor 2 are linked through residue 246. RNA, 2000. 6(12): p. 1704−1713.

123. Dincbas-Renqvist, V., et al., A post-translational 19(24): p. 6900−7. modification in the GGQ motif of RF2 from Escherichia coli stimulates termination of translation. EMBO J, 2000. 138. 139.

124. Wilson, K.S., et al. Functional sites of interaction between release factor RFl and the ribosome. Nat. Struct. Biol., 2000. 7(10): p. 866;

125. Ban, N., et al., The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 E resolution. Science, 2000. 289: p. 905;

126. Wilson, K.S. and H.F. NoUer, Mapping the Position of Translational p. 131−139. 141. 142.

127. Wimberly, B.T., et al., Structure of the 308 ribosomal subunit. Nature, 2000. 407: p. 327;

128. Ramakrishnan, V. and S.W. White, The structure of ribosomal protein-SS reveals sites of interaction with 16SrRNA. Nature, 1992. 358: p. 768;

129. Seit-Nebi, A., et al. Class-1 translation termination factors: invariant GGQ minidomain is essential for release activity and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res., 2001.29(19): p. 3982−3987.

130. Seit Nebi, A., et al. Mutation of a glutamine residue in the universal tripeptide GGQ in human eRFl termination factor does not cause complete loss of its activity. Mol Biol (Mosk), 2000.34: p. 899−900.

131. Polacek, N., et al. The critical role of the universally conserved A2602 of 23S ribosomal RNA in the release of the nascent peptide during translation Mol. Ceil, 2003.11(1): p. 103−112.

132. Capecchi, M.R. and H.A. Klein, Characterisation of three proteins involved in polypeptide chain termination, in Cold Spring Harbor Symp Quant Biol. 1969, Cold Spring Harbour Laboratory of Quantitative Biology, p. 469−477. termination. Elongation Factor EF-G in the Ribosome by Directed Hydroxyl Radical Probing. Cell, 1998. 92: 103.

133. Milman, G., et al., Peptide chain termination. III. Stimulation of in vitro termination. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1969. 63: p. 183;

134. Mikuni, O., et al. Identification of the prfC gene, which encodes 5798−5802. peptide-chainrelease factor 3 of Escherichia coll Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 1994. 91(13): p.

135. Pavlov, M.Y., et al. Release factor RF3 abolishes competition between release factor RFl and ribosome recycling factor (RRF) for a ribosome binding site. J. Mol. Biol., 1997. 273(2): p. 389−401.

136. Freistroffer, D.V., et al., Release factor RF3 in E. coli accelerates the dissociation of release factors RFI and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J., 1997.16(13): p. 4126−4133.

137. Crawford, D.J., et al., Indirect regulation of translational termination efficiency at highly expressed genes and recoding sites by the factor recycling function of Escherichia coli release factor RF3. EMBO J, 1999. 18(3): p. 727−32.

138. Zavialov, A.V., R.H. Buckingham, and M. Ehrenberg, A posttermination Cell, 2001.107(1): p. 115−124. ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. 153. 154. 155.

139. Nagai, K., et al., Structure, function and evolution of the signal recognition particle. Embo J, 2003. 22(14): p. 3479−85. Gu, S.Q., et al. The signal recognition particle binds to protein L23 at the peptide exit of the Escherichia coli ribosome. Rna, 2003. 9(5): p. 566;

140. Yusupov, M.M., et al. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science, 2001. 292(5518): p. 883;

141. Tin, O.F., et al. Proteolytic fragmentation of polypeptide release factor I 765−72.

142. Kastner, В., C.N.A. Trotman, and W.P. Tate, Localization of the binding site of release factor-2 158. on the 70S ribosome by immuno-electron microscopy. Proc. Univ. Otago Med. Sch., 1986. 64: p. 41−42. Xu, W., F.T. Pagel, and E.J. Murgola, Mutations in the GTPase center of Escherichia coli 23S rRNA indicate release factor 2-interactive sites. J Bacteriol, 2002. 184(4): p. 1200−3. 159. 160. 161.

143. Wimberly, B.T., et al., A detailed view of a ribosomal active site: The structure of the LIl-RNA complex. Cell., 1999. 97(4): p. 491;

144. Conn, G.L., et al. Crystal structure of a conserved ribosomal protein-RNA Science, 1999. 284: p. 1171−1.

145. Yusupova, G.Z., et al. The path of messenger RNA through the ribosome. Cell, 2001. 106(2): p. 233;

146. Nissen, P., et al., Crystal structure of the ternary complex ofPhe-tRNA, EF-Tu, and a GTP analog. Science, 1995. 270: p. 1464−1472. 104 complex. ofThermus thermophilus and crystallization of the stable fragments. Biochimie, 2000. 82(8): p.

147. Inagaki, Y., et al. Convergence and constraint in eukaryotic release factor J (eRFl) domain 1: the evolution of stop codon specificity. Nucleic Acids Res, 2002. 30(2): p. 532−44. 165. 166. 167. 168.

148. Merkulova, Т.1., et al., C-terminal domains of human translation termination factors eRFl andeRF3 mediate their in vivo interaction. FEBS Lett., 1999. 443(1): p. 41;

149. Laurberg, M., et al. Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid binding site. J. Mol. Bioi., 2000. 303(4): p. 593;

150. Stark, H., et al., Visualization of Elongation Factor Tu On the Escherichia Ribosome. Nature., 1997. 389(6649): p. 403;

151. Stark, H., et al., Ribosome interactions ofaminoacyl-tRNA Stark, H., et al., Large-scale 301−309. and elongation factor Tu in G and extensive the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol., 2002. 15: p. 15−20. movement of elongation factor conformational change of the ribosome during translocation. Cell, 2000. 100(3): p. Coli 170.

152. Aevarsson, A., Structure-based sequence alignment of elongation factors Tu and G with related GTPases involved in translation. J Mol Evol, 1995. 41(6): p. 1096−1.

153. Mora, L., et al., Stop codon recognition and interactions with peptide release factor RF3 of truncated and chimeric RFI and RF2 from Escherichia coli. Mol Microbiol, 2003. 50(5): p. 1467−76.

154. Ito, K., K. Ebihara, and Y. Nakamura, The stretch of C-terminal acidic amino acids of translational release factor eRFl is a primary binding site for eRF3 of fission yeast. IWA, 1998. 4: p. 958−972. 173.

155. Kisselev, L., M. Ehrenberg, and L. Frolova, Termination of translation: interplay of mRNA, rRNAs and release factors? EMBO J., 2003. 22(2): p. 175;

156. Zavialov, A.V., et al., Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol. Cell, 2002. 10(4): p. 789 798. 175. van Heel, M., et al. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys, 2000. 33(4): p. 307−69. 105.