Исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействия р50 субъединицы NF-кВ с ДНК-дуплексами в растворе

Одним из наиболее важных и необходимых процессов жизнедеятельности клетки, который обеспечивает начальный этап передачи генетической информации от нуклеиновых кислот к белкам, является транскрипция. Многие биологические процессы регулируются на уровне экспрессии генов. Изучение генетических процессов на молекулярном уровне позволило выявить важнейшую роль белковых факторов в регуляции генной экспрессии на различных ее этапах. Одним из ключевых эукариотических факторов транскрипции является ядерный фактор транскрипции NF-кВ. Этот белок впервые был описан в 1986 году как специфический ядерный фактор В-клеток, ответственный за экспрессию гена к-иммуноглобулина [1].

В клетке NF-кВ участвует в процессах инициации транскрипции генов, кодирующих различные белки, в том числе сигнальные белки и белки иммунного ответа, поэтому главным следствием участия белка NF-кВ в регулировании активности большого числа генов является повышение защитных функций организма.

К настоящему времени известно, что многие вирусы, включая ВИЧ-1, используют NF-кВ для транскрипции собственных генов. Кроме того, предпринятые исследования молекулярных механизмов онкогенеза нормальных клеток в опухолевые, мультилекарственной резистентности опухолевых клеток и программируемой клеточной гибели, позволили установить важнейшую роль транскрипционного фактора NF-кВ в развитии этих явлений. В опухолевых клетках наблюдается высокий уровень экспрессии NF-кВ, который запускает в них целый каскад реакций, ведущих к активации транскрипции онкогенов. В связи с этим в настоящее время уделяется большое внимание поиску эффективных путей модуляции активности NF-кВ в опухолевых клетках человека.

Создание регуляторов активности фактора транскрипции NF-кВ как нуклеотидной, так и белковой природы представляет собой одно из основных направлений фармакотерапии, поэтому актуальной задачей является изучение тонкой структуры комплекса ДНК-NF-kB в растворе при физиологических условиях.

Па сегодняшний день известно около десяти кристаллических структур фактора транскрипции с различными ДНК и РНК-лигандами, а также ингибирующими белками 1кВа и 1кВр. Для самих белков семейства NF-кВ вне комплекса структуры с высоким разрешением пока не получены. На данный момент закристаллизованы только С-концевые димеризационные домены белков р50 и р65 NF-kB [2]. Поскольку кристаллические структуры являются отражением лишь одного из состояний молекулы в растворе и не полностью отражают функциональные особенности белка, их нельзя использовать для прогнозирования точного поведения фактора транскрипции в клетке. Следовательно, важным элементом при исследовании фактора транскрипции NF-кВ является изучение его физико-химических и биологических характеристик в растворе.

Настоящая работа посвящена исследованию структурных особенностей р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ человека, ответственной за связывание с ДНК, и ее комплексов с ДНК-дуплексами в растворе.

В данной работе впервые с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния проведено исследование конформации белка р50 NF-кВ в растворе. Метод малоуглового рентгеновского рассеяния позволяет описать форму молекулы на основе модельных вычислений. Основной вклад в кривую рассеяния вносят общие размеры частицы и их форма. Из кривой рассеяния в этой области можно извлечь информацию об электронном радиусе инерции, молекулярном весе, объеме, площади поверхности, гидратации молекулы и ряде других интегральных характеристик объекта. До настоящего времени исследования структурных особенностей белка р50 в растворе практически не проводилось. Были получены лишь некоторые данные о молекулярной массе образующегося в растворе белкового ассоциата и степени гомогенности белка методом равновесной седиментации [3,4]. Кристаллическая структура для белка р50 вне комплекса с лигандами еще не получена.

Методом малоуглового рентгеновского рассеяния также впервые изучены конформационные изменения в белке р50, происходящие при его комплексообразовании с ДНК.

Для исследования изменений в геометрии центра связывания белка при введении единичных замен как в структуру ДНК-связывающего центра белка р50, так и в структуру участка узнавания белка в ДНК впервые использован метод региоселективного ковалентного связывания [5,6], разработанный в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Метод региоселективного ковалентного связывания базируется на создании с помощью химического лигирования синтетических ДНК-дуплексов, содержащих в одной из цепей вместо природной межнуклеотидной фосфатной группы химически активную тризамещенную пирофосфатную фосфатную группу (ТЗПГ). Такие ДНК-дуплексы являются эффективными фосфорилирующими агентами в водной среде и способны образовывать ковалентную связь с нуклеофильными группами аминокислотных остатков Lys, Туг или His НК-связывающих белков в составе специфического комплекса НК-белок. Необходимым условием образования ковалентной связи между белком и ДНК является стерическая сближенность реагирующих группировок. Ковалентное связывание белка с серией модифицированных ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в одной из позиций участка узнавания, позволило прозондировать Д1 IK-связывающий центр белка. В сочетании с методом сайт-направленного мутагенеза белка в работе исследовано влияние замены ряда ключевых аминокислот в белке р50 NF-kB, участвующих во взаимодействии с фосфатными группами ДНК, на центр связывания белка. Кроме того, с помощью набора ДНК-дуплексов, содержащих химически активную группу в различных позициях кВ-участка узнавания белка, проведено сравнение контактов нуклеофильных аминокислотных остатков с фосфатными группами ДНК, реализующихся в составе комплекса белка с ДНК, содержащими участки узнавания из разных генов. Изученная возможность картирования центра связывания белков с помощью метода региоселективного ковалентного связывания может найти применение и для других НК-связывающих белков.

Используемые в работе ТЗПГ-содержащие ДНК-дуплексы могут быть предложены в качестве специфичных ингибиторов NF-кВ благодаря их свойству селективно и необратимо связываться с белком в условиях in vitro. Для анализа специфичности их взаимодействия с NF-кВ в опухолевых клетках в работе проведено ковалентное связывание модифицированных ДНК-дуплексов с клеточным пулом NF-кВ в ядерных и цитоплазматических фракциях лизатов клеток карциномы кишки человека НСТ-116. Показано, что подобные ДНК-реагенты связываются специфично с NF-кВ в лизатах, не затрагивая другие компоненты клетки, что подтверждено иммуноблоттингом с антителами к р50 и р65 субъединицам NF-кВ. Кроме того, сделаны предварительные эксперименты по доставке флуоресцентно-меченного модифицированного ДНК-реагента в опухолевые клетки, и исследована его способность к ковалентному связыванию с NF-кВ в клетке. Методом конфокальной сканирующей микроскопии показано, что такие ДНК-дуплексы проникают через цитоплазматическую мембрану и локализуются, в основном, по периферии клетки. При воздействии на клетки фактора некроза опухоли, а (TNF-а), приводящего к запуску сигнальных путей активации NF-кВ, ДНК мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с NF-кВ. Обработка клеток НСТ-116, предварительно инкубированных с родамин-меченным ДНК-реагентом, флуоресцеин-мечеными антителами к р50 субъединице NF-кВ выявила ко-локализацию антител с ДНК-дуплексами. Можно предполагать, что ДНК-дуплексы образуют специфический комплекс с NF-кВ в клетках.

Таким образом, используемые в работе ДПК-реагенты могут служить основой для разработки противоопухолевых препаратов, базирующихся на модуляции активности NF-кВ в клетке, а также в диагностических целях для определения наличия активного NF-kB в клетке, что позволит выявить онкологические заболевания на ранних этапах.

Кроме того, в работе исследована способность антиракового препаратафталоцианинового комплекса кобальта — ингибировать ДНК-связывающую активность NF-kB. Препараты на основе фталоцианинов широко используются в фотодинамической терапии рака благодаря способности избирательно накапливаться в опухолях и вызывать их деструкцию под действием фотоиндуцируемой генерации активных форм кислорода [7]. В работе показано, что кобальт-фталоцианиновый комплекс, содержащий восемь карбоксильных групп по периферии лиганда, конкурентно связывается с участком узнавания NF-kB в ДНК-дуплексе, препятствуя комплексообразованию белка с ДНК. Кроме того, в присутствии аскорбиновой кислоты он расщепляет ДНК-дуплекс за счет генерации активных форм кислорода. Таким образом, кобальт-фталоцианиновый комплекс является эффективным ингибитором активности NF-kB. Однако, высокое сродство фталоцианинов к любым последовательностям ДНК и подавление активности широкого спектра белков (NF-kB, РНКаза Н, эндонуклеаза рестрикции SsoII) делает его действие неспецифичным. Специфичность может быть достигнута введением металлокомплекса в структуру модифицированных олигонуклеотидов для адресной доставки к генам-мишеням. Такие конъюгаты могут заложить основу для создания новых противоопухолевых агентов.

Проведенные в работе исследования представляют интерес с точки зрения анализа структурных особенностей белка р50 NF-kB и его комплексов с ДПК-дуплексами в растворе и для разработок регуляторов активности фактора транскрипции NF-kB в клетке.

I. РОЛЬ NF-кВ В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ И ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА (Литературный обзор).

1.1. РОЛЬ NF-KB В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ.

Ядерный фактор транскрипции эукариот NF-kB является ключевым элементом в системе регуляции большого числа генов, которая позволяет клеткам млекопитающих быстро приспосабливать свою транскрипционную программу к воздействиям окружающей среды. Он участвует в про воспалительном и иммунном ответе организма, регулируя экспрессию генов цитокинов, хемокинов, интерлейкинов и интерферонов.

К настоящему времени исследование молекулярных механизмов трансформации клеток в опухолевые, эффекта мультилекарственной резистентности опухолевых клеток и программируемой клеточной гибели позволило установить важнейшую роль транскрипционного фактора NF-kB в развитии этих явлений. В опухолевых клетках наблюдается высокий уровень экспрессии NF-kB, который запускает в них целый каскад реакций, ведущих к активации транскрипции онкогенов. В связи с этим, изучение структурно-функциональных аспектов взаимодействия NF-kB с ДНК и поиск эффективных путей модуляции активности NF-kB в опухолевых клетках человека является одним из важных направлений современной молекулярной биологии и фармакотерапии.

1.1.1. СЕМЕЙСТВО NF-кВ.

Название «NF-кВ» представляет собой собирательное название комплексов, образованных белками, входящими в семейство Rel/NF-кВ [8]. В эукариотических клетках присутствуют пять белков этого семейства: р50-р105 (или NF-kB1), р65 (RelA), р52-р100 (или NF-kB2 или Lyt-10), RelB и c-Rel. Все белки этого Rel-семейства имеют в N-концевой части участок высокой гомологии из 300 аминокислот с белком — продуктом онкогена rel, называемый RIIR (от англ. Rel Homology Region). Этот участок отвечает за связывание с ДНК, димеризацию и транспорт активных белков из цитоплазмы в ядро. Интересно, что для связывания с ДНК белкам семейства Rel требуется весь участок высокой гомологии RJIR, в то время как для большинства факторов транскрипции можно выделить небольшой полипептидный фрагмент, обладающий практически такой же специфичностью и сродством к ДНК, как и исходный белок. Данный факт говорит о том, что способ связывания с ДНК у белков семейства NF-кВ отличается от традиционных способов связывания в ДНК-белковых комплексах. Аминокислотная последовательность полипептидов семейства Rel/NF-кВ имеет более 75% гомологии и на 38% идентична.

Семейство Rel белков можно разделить на два класса: к первому относятся белки р50 и р52, получающиеся в результате протеолитического расщепления белков р105 и рЮО, соответственно, и проявляющие только ДНК-связывающую активность, а ко второму — белки р65, RelB и c-Rel, содержащие в своем составе негомологичный трансактивационный домен и отвечающие в составе белкового комплекса за транскрипцию различных генов, в том числе и самого фактора (рис. 1.1).

NF tBI.

NF-kBZ.

RHD C.

СГ.

ANK П [a I pics/ p5C *.

N T.

ЛГИ®-C!©-S5£3lQI p" .

HdB N.

ЛИ-. c-Rel htB. i ¦kSM IkB<

КВт.

C lermlnu" crt NF-kB1/ СЮ51.

1квА.

1С terminus of NF-kB2^b100- Bc*-3 IIvI'. I MM I.

I I Ж .I-1*1 I.

S9 •wbel — ¦ I I — 3.

•.

ЖМДОЫ I I.

1 1.

L L: I I.

1 к I I I.

Рис. 1.1. Семейство белков Rel/NF-кВ и 1кВ [8].

Между собой Rel белки способны образовывать гомои гетеродимеры. Однако не все субъединицы димеризуются между собой. Так, RelB не способен образовывать гетеродимеры с р65 и c-Rei. В клетках преимущественно встречается гетеродимер р50-р65, регулирующий транскрипцию генов цитокинов, хемокинов, интерлейкинов, цитокиновыхи иммунорецепторов, молекул клеточной адгезии, белков острой фазы, стресс-респонсивных генов, вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) и т. д., и гомодимер р50-р50, обычно выступающий в качестве репрессора NF-кВ-зависимой транскрипции.

9].

В здоровых клетках млекопитающих, за исключением В-клеток и клеток плазмы крови, NF-kB находится в цитоплазме в неактивном состоянии в виде комплекса с ингибирующим белком 1кВ.

Семейство белков 1кВ включает белки 1кВа, 1кВр, 1кВе и 1кВу. Для этого семейства характерно наличие на С-конце анкириновых повторов (рис. 1.1), которые необходимы для взаимодействия этих белков с NF-kB. Известно, что различные 1кВ белки по-разному взаимодействуют с индивидуальными гомои гетеродимерами NF-kB, тем самым тонко регулируя активность NF-kB. Ранее в литературе высказывалось предположение, что NF-kB удерживается в неактивном состоянии в цитоплазме за счет экранирования ингибирующим белком 1кВ последовательности сигнала транспорта в ядро (NLS (от англ. nucleic localization signal)) в NF-kB. Однако структурные исследования комплексов NF-kB с 1кВ [10−13] показали, что 1кВа закрывает сигнал ядерного транспорта только у р65 субъединицы NF-kB, оставляя NLS р50 субъединицы открытым, вследствие чего такой комплекс р50-р65−1кВа может мигрировать в ядро. В то же время, у 1кВа на N-конце имеется лейцино-богатая последовательность ядерного экспорта (NES), которая взаимодействует с рецептором ядерного экспорта Crmlp, что приводит к обратной миграции комплекса в цитоплазму. Доминирующее нахождение комплекса IkB (x-NF-kB в цитоплазме может быть обусловлено преимущественно цитоплазматической локализацией 1кВа. В то же время, 1кВа способна выводить уже активный NF-kB из ядра после деацетилирования р65 субъединицы с помощью гистондеацетилазы 3 (HDAC3) и, следовательно, 1кВа регулирует NF-kB как на цитоплазматическом, так и на ядерном уровне. Для другого белка семейства 1кВ — 1кВр известно, что он обладает способностью связываться с обеими доступными последовательностями NLS, таким образом, обеспечивая прочное удержание комплекса IkBP-NF-kB в цитоплазме. У белка 1кВу имеется семь анкириновых повторов, и он взаимодействует с NF-kB через аминокислотные остатки, участвующие в связывании с ДНК, тем самым ингибируя ДНК-связывающую активность NF-kB. Кроме того, белок р105 из семейства Rel/NF-кВ также может выступать в роли ингибиторного белка в комплексе с белками р50, c-Rel и RelA за счет наличия анкириновых повторов в С-концевой части, а сама С-концевая часть в результате альтернативного сплайсинга гена NFkBI превращается в отдельный ингибиторный белок 1кВ5.

Для активации NF-kB и его транспорта в ядро необходимым процессом является фосфорилирование 1кВ белков с помощью комплекса 1кВ киназ (IKK) (IKKa, IKKp и регулирующая субъединица IKKy (или необходимый модулятор NF-кВ (NEMO)). Комплекс IKK активируется под влиянием внешних стимулов и фосфорилирует Ser в N-концевом участке 1кВ. В таком виде 1кВ разрушается с помощью убиквитина и 26S протеасомы. Это так называемый классический сигнальный путь активации NF-kB [14]. После диссоциации комплекса (р50-р65)-(1кВ) активный NF-kB транслоцируется в ядро, где участвует в процессах инициации транскрипции генов, кодирующих сигнальные и защитные белки (рис. 1.2).

TNFu. IL-1, CD40L, LPS.

IJbiqultlneUng.

Fniyme* *.

Pro tea lam* Degradation p p P *>>'.

T к В Degradation J t if" I>M>

UB-x 1кв-|1. pi00, pIQS.

IL-1, M.-2, IL-4. IL-8. TMF w.

IFN-p.G CSF, M CSF.

XmXGGGAATTCCCXXXJC VCAH-1, СМИ. e «ЧииИп.

INOS.

IL-2fti. Jg-*-LC HIV-1, CMV.

Рис. 1.2. Общая схема активации NF-кВ в клетке [8].

ВЫВОДЫ.

1. Методами скоростной седиментации и ЯМР показано, что белок р50 в растворе имеет глобулярную конформацию.

2. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния в невозмущающих условиях обнаружено, что белок р50 в растворе глобулярен и находится, преимущественно, в виде димера. Также было найдено, что связывание ДНК приводит к уменьшению размеров белка и разрушению ассоциатов. В комплексе с ДНК белок находится в виде димера и имеет глобулярную конформацию.

3. Методом КД в сочетании с методом скоростной седиментации показано, что замена Cys62 и Lysl47 белка р50 на Ala приводит к существенным изменениям во вторичной структуре и в окружении ароматических групп белка без сильного нарушения компактности белковой глобулы.

4. Зондирование ДНК-связывающего центра белка р50 с использованием ТЗПГ-содержащих ДНК-дуплексов выявило, что замена Cys62 и Lysl47 на Ala приводит к нарушению связывания белка с ДНК, вероятно, из-за изменений в пространственной организации ДНК-связывающего участка белка.

5. Впервые показано, что 17/19-звенные ТЗПГ-содержащие ДНК-дуплексы, содержащие на З'-конце остаток родамина, способны проникать в опухолевые клетки НСТ-116 через цитоплазматическую мембрану без дополнительных систем доставки и ко-локализоваться с NF-кВ. При этом в.

TNF-a-стимулированных клетках ДПК-реагент мигрирует в ядро, вероятно, в виде комплекса с NF-kB.

6. Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях по Лэммли с последующим иммуноблотгингом выявлена селективность коваленгного связывания ТЗПГ-содержащего ДНК-дуплекса с NF-kB в присутствии остальных компонентов клетки.

7. Методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях показано, что кобальт-фталоцианиновый комплекс, используемый в терапии рака, ингибирует связывание р50 субъединицы NF-kB с ДНК, однако действие его неспецифично.