Изучение разнообразия и эволюции генов TAS3, кодирующих предшественники ta-siРНК у нецветковых наземных растений и особенности их экспрессии у некоторых покрытосеменных

Актуальность проблемы. Малые некодирующие РНК у эукариот это обычно 20−25-и нуклеотидные последовательности участвующие во многих биологических процессах. У растений они играют важнейшую регуляторную роль в процессе роста и дифференцирования тканей, в формировании гетерохроматина, деградации мРНК, подавлении экспрессии генов, а также в ответе на разнообразные типы стрессов.

Эта роль осуществляется комплементарным связыванием малых некодирующих РНК со специфическими мРНК-мишенями, ведущим к посттранскрипционному РНК-сайленсингу соответствующих генов [Baulcombe, 2004; Carrington and Ambros, 2003; Voinnet, 2005; Vaucheret, 2006; Bonnet et al., 2006; Chu and Rana, 2007].

К основным видам малых РНК относятся микроРНК (miPHK), короткие интерферирующие РНК (siPHK) и транс-действующие siPHK (ta-siPHK).

Микро РНК (miPHK) представляют собой класс малых некодирующих РНК (из 21−22 нуклеотидов), транскрибируемых из геномов всех многоклеточных организмов и некоторых вирусов [Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Laporte et al., 2007; Liu et al., 2007].

Биогенез растительных miPHK начинается с транскрипции предшественников микроРНК РНК-полимеразой II. Эти предшественники содержат последовательность зрелой микроРНК внутри длинной несовершенной шпильки, которая обрабатывается в ядре белком DCL1 [Rogers and Chen, 2013]. В настоящее время описаны, в общей сложности, несколько десятков семейств растительных микроРНК (сотни отдельных видов микроРНК), а также, найдены их мишени — в основном белок-кодирующие мРНК. Но некоторые микроРНК руководят расщеплением некодирующих первичных транскриптов TAS генов направляя формирование трансдействующих siPHK. В этом случае, микроРНК выполняют расщепление с помощью белка Argonaute (AGO), который расщепляет одноцепочечный TAS.

РНК транскрипт в области, комплементарной малой РНК. Продукты расщепления TAS преобразуются в результате совместного действия белка SGS3 и РНК-полимеразы RDR6 в двухцепочечную форму, а затем обрабатываются DCL4 для получения ta-siPHK, которые располагаются с шагом в 21 нт по отношению к исходному сайту расщепления на обеих цепях.

Получившиеся 21 -нуклеотидные ta-siPHK далее работают в качестве компонентов комплекса RISC для направления AGO-зависимого расщепления их мишени.

Особенность их действия связана с тем, что они функционально инактивируют in trans не те гены, которыми кодируются (TAS гены), а иные гены, в основном кодирующие регуляторные белки.

Для высших растений характерны ta-siPHK, которые кодируются собственными генами (TAS la, TASlb, TASlc, TAS2, TAS3 и TAS4). Большинство предшественников TAS РНК имеют только один мотив микроРНК (например, miR173), расположенный на 5'-конце ta-siPHK предшественника, и этот мотив расщепляется AGOl руководствуясь соответствующей микроРНК. Однако для расщепления предшественника TAS3 РНК, необходимо два сайта miR390 (на 5' и 3' концах фрагмента). Образование таких ta-siPHK зависит от специфичного взаимодействия между AG07 и miR390 [Montgomery et al., 2008; Endo et al., 2013]. Впоследствии они контролируют активность генов ауксин-регулируемых транскрипционных факторов ARF3 и ARF4, направляя специфическую деградацию их мРНК, поэтому их назвали ta-siARF РНК [Allen et al., 2005; Carraro et al., 2006; Nogueira et а., 2007].

Важнейшее значение TAS3 генов в регуляции развития растения, их широкая распространенность даже у примитивных наземных растений и слабая изученность эволюции и разнообразия miR390−3aBHCHMbix TAS генов требуют новых подходов и специальных исследований в этом направлении [Allen et al., 2005; Nogueira et al., 2007].

Цель исследования. Изучение разнообразия и биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей генов транс-действующих малых интерферирующих РНК, процессинг предшественников которых направляется микроРНК miR390 для различных, таксономически удаленных, видов наземных растений.

Задачи исследования:

1) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых двудольных растений семейства Solanaceae;

2) Изучение разнообразия и дифференциальной экспрессии генов TAS3 у некоторых двудольных растений трибы Senecioninae (семейство Asteraceae);

3) Изучение разнообразия генов miR390 у некоторых мхов и печеночников;

4) Изучение разнообразия генов TAS3 у мхов.

Научная новизна. Для изучения TAS-генов, зависимых от miR390, исследовано их разнообразие у растений порядков Solanales, Asterales и Alismatales. Использование нового подхода, основанного на ПЦР, позволило выявить новые типы TAS генов. Эти гены характеризуются гораздо меньшей дистанцией между участками, комплеметарными miR390, и не обнаруживаются у Arabidopsis thaliana. Более того, эти «короткие» гены дают начало только одной копии ta-siARF РНК. Заметим, что анализ баз данных последовательностей геномов растений позволил выявить такие TAS гены у 15 семейств двудольных растений и двух семейств голосеменных растений. Кроме того, получены данные об особенностях экспрессии нового типа TAS генов.

В работе приведены данные детального анализа разнообразия TAS3-подобных генов у мхов и родственных им древнейших наземных растений. Ранее мировой науке были известны данные лишь по одному виду мховPhyscomitrella patens. В процессе данной работы были клонированы более 40 генов, кодирующих ta-siARF РНК, используя ДНК различных таксономически удаленных видов мхов. ДНК была изолирована из целого ряда представителей классов Andreaeopsida, Polytrichopsida, Tetraphidopsida, Bryopsida (подклассы Timmiidae, Bryidae и Dicranidae) и класса Sphagnopsida. Анализ данных о структуре TAS генов у других представителей наземных растений, включая печеночники мхи, плауны и папортники, позволил нам выдвинуть гипотезу, согласно которой эти гены эволюционировали с изменением специфичности и структуры кодируемых ими ta-siPHK.

Впервые широко исследована структура генов предшественников miR390 у печеночников и мхов. Впервые идентифицированы гены различных видов мхов и лишь несколько из них сходны по первичной структуре с известными ранее генами miR390 Physcomitrella patens.

Некоторые функции TAS3 генов являются тесно связанными с функциями онтогенеза растений и их устойчивостью к абиотическим стрессам. В этой связи часть работы посвящена изучению селективности регуляции экспрессии TAS3 генов, содержащих тандемно-дуплицированный район ta-siARF РНК, с одной стороны, и мономерный район ta-siARF, с другой. Впервые у цветковых растений выявлено существование механизмов селективной регуляции экспрессии TAS3 генов.

Практическая значимость работы. Результаты нашего исследования дают новые представления о регуляторных механизмах функционирования защитного ответа растений на повреждающие стрессовые воздействия. Согласно литературным данным, на модели растений показана возможность получения трансгенов, имеющих признаки устойчивости к тяжелым металлам и вирусной инфекции. Эта толерантность была основана на стабильной экспрессии в растениях генов TAS. Потенциально, экспрессия в модельных трансгенных растениях наших конструкций генов TAS, введенных с помощью бинарного вектора дает возможность получения растений, несущих ценные признаки. Все полученные материалы могут быть включены в курс лекций для студентов биологических ВУЗов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3 научных конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (Россия, Москва, 2010) — Всероссийская бриологическая конференция с международным участием, посвященная 100-летию со дня рождения Романа Николаевича Шлякова (Кировск, 2012) — International Conference «Molecular Mapping and Marker assisted Selection» (Vienna, Austria, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей в научных журналах, из которых 3 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, а также 3 статьи в материалах и тезисах научных конференций.

выводы.

1) Предложен новый метод выявления генов TAS3 растений в составе геномной.

ДНК и РНК-транскриптов. Этот метод основывается на использовании полимеразной цепной реакции с применением праймеров, сходных или комплементарных микроРНК, miR390.

2) Предложенный нами подход позволил выявить новый, не описанный ранее тип TAS3 генов, кодирующих предшественники ta-siARF РНК у различных семенных растений.

3) Впервые у цветковых растений выявлено существование механизмов селективной регуляции экспрессии TAS3 генов.

4) Приведены данные детального анализа разнообразия TAS3-подобных генов у мхов и родственных им древнейших наземных растений. Идентифицировано более 40 генов, кодирующих ta-siARF РНК, для различных таксономически удаленных групп мохообразных.

5) Впервые установлена первичная структура miR390 у ряда мхов и родственных им древнейших наземных растений.

6) Анализ данных о структуре TAS генов у представителей наземных растений, позволил выдвинуть гипотезу, согласно которой эти гены эволюционировали с изменением специфичности и структуры кодируемых ими ta-si РНК.