Применение нативных и генно-инженерных антигенов в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах для экспрессной иммунодиагностики

Актуальность проблемы Иммунохимические методы, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности для целей охраны окружающей среды. Обнаружение образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и другие метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут [7].

Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований и представляет собой современную прогрессивную форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты-человек, животные, растения, микроорганизмы, клетки и вирусы. Один из разделов биотехнологии — иммунохимия, успехи её развития позволили создать принципиально новую биотехнологию производства высокооднородных в химическом и иммунологическом отношениях антител, названных моноклональными, применение которых позволили создать эффективные методы иммунодиагностики — иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинг, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти и другие методы, основанные на реакции антиген — антитело, нашли широкое применение практически во всех областях современной биологии, а также в медицине и ветеринарии. Для этих методов характерны высокая чувствительность и точность результатов [26, 27, 31, 48, 73].

Всё вышесказанное подтверждает тот факт, что эти методы применяются, прежде всего, как верифицирующие тесты, но не как скриннинговые.

Наметившиеся новые тенденции в медицине XXI века ориентированы на профилактику и выявление ранних нарушений показателей здоровья, поэтому в настоящее время требуется новая тактика лабораторных исследований и необходима диагностика, позволяющая выявлять контингента повышенного риска патологий, методические приемы, в том числе упрощенные для массовых исследований и контроля реабилитации. Наиболее перспективной является разработка новых высокоинформативных чувствительных и специфичных способов диагностики. При этом особое место должно отводиться методам профилактического обследования населения с целью раннего выявления заболевания, что диктует необходимость повышения требований к показателям диагностической эффективности скрининговых тестов.

Следовательно, актуальны простые по исполнению методы, позволяющие обнаружить причинные антигены и маркеры в минимальных и следовых количествах в большом объеме анализируемых образцов в различных стадиях течения заболевания. В сфере первичной помощи пациентам экспресс-диагностика может существенно улучшить исходы заболеваний за счет более широкого скрининга с целью выявления пациентов, которые нуждаются в применении специального обследования, а также за счет систематического мониторинга (включая самомониторинг) эффекта лечебных мер у амбулаторных больных.

Таким образом, основным предметом нашего исследования стали изучение применения нативных и рекомбинантных антигенов, в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах для экспрессной иммунодиагностики.

Анализ данных специальной литературы и высказанные выше предпосылки позволили сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель работы.

Разработка и апробация нового оригинального экспресс метода с применением нативных и генно-инженерных антигенов в реакции гидрозольной агглютинации для выявления антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, к микобактериям туберкулёза, детекции хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.

Задачи исследования.

1. Разработать гидрозольные антигенные диагностикумы для выявления антител к вирусу гепатита псовых, птичьего гриппа, M.tuberculosis.

2.Изучить возможность применения гидрозольных диагностикумов с нативными и генно-инженерными антигенами с целью обнаружения антител в исследуемом материале.

3.Разработать гидрозольный антительный диагностикум для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).

4. Определить диагностическую ценность реакции гидрозольной агглютинации для диагностики ряда заболеваний.

Научная новизна работы.

Впервые разработана технология получения гидрозольных препаратов на основе коллоидных растворов оксида железа (Fe304) и гексацианферрата (II) железа (III), проведена их сравнительная характеристика. Доказана целесообразность и эффективность их применения для детекции в исследуемом материале:

1. Антител к вирусу гепатита псовых.

2. Антител к вирусу птичьего гриппа.

3.Антител к М. tuberculosis.

4. Антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).

Научно-практическая значимость работы.

На основании полученных результатов исследования осуществлён синтез основных реагентов для экспресс-тестов, показана простота и экономичность постановки анализа, достаточная чувствительность и специфичность реакции гидрозольной агглютинации в выявлении антител к вирусам гепатита псовых, птичьего гриппа, М. tuberculosis, антигена хорионического гонадотропина человека, что позволяет рекомендовать разработанные нами экспресс-тесты для использования в ветеринарии и медицинской практике.

Апробация работы.

Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных и научно — практических конференциях: V съезде общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (Москва, 2008) — XI межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Молодёжь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2009) — IV Всероссийской итоговой студенческой научной конференции (Самара, 2010) — V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из которых 4 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждений, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (105 источников, из них 27 — иностранных авторов), приложений. Работа изложена на 119 страницах, содержит 17 таблиц, 4 диаграммы, 4 рисунка.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан и апробирован новый иммунохимический метод гидрозольной агглютинациии (РГЗА) на основе «берлинской лазури» и оксида железа (Fe304) для выявления специфических антител к возбудителям: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза как в сыворотке крови, так и в капиллярной крови.

2. Гидрозольные диагностикумы с нативными и генно-инженерным антигеном применимы в случае выявления антител к М. tuberculosis. Сравнивая гидрозоли различного состава, были обнаружены преимущества использования препарата на основе «берлинской лазури» с генно-инженерным антигеном. Во-первых, он обеспечивает сохранность специфических иммунохимических свойств диагностикума в течение одного года, в то время как диагностикум на основе «берлинской лазури» с нативным антигеном лишь в одномесячный период специфической иммунохимической активности. Во-вторых, по совокупности иммунохимических свойств «берлинская лазурь» с адсорбированным генноинженерным антигеном является наиболее универсальным определителем, обеспечивающим лучшую дифференцировку «+» и «-» результатов. В-третьих, данная гидрозоль обладает высокой чувствительностью (91%) и позволяет определять в образцах крови специфические антитела в титре от 1:100 до 1:2560. Кроме того, немаловажным является и тот факт, что обнаружение противотуберкулёзных антител возможно у больных с различной локализацией патологического процесса.

3. Разработаны новые диагностические препараты на основе «берлинской лазури» и оксида железа (РезОД нагруженные мышиными моноклональными антителами к бета субъединице ХГЧ для выявления антигена хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в сыворотке крови и в моче беременных женщин. Положительная корреляция наблюдалась при детекции антигена ХГЧ в исследуемых сыворотках в титрах от 1:100 до 1:1000 и в неразведенной моче при помощи обеих гидрозолей.

4. Диагностическая ценность реакции гидрозольной агглютинации с антигенным и антительным диагностикумами определяется высокой специфичностью (в среднем 98%) и чувствительностью (91%), простотой постановки, минимальных затратах. Её использование повышает информативность серологической диагностики заболеваний: гепатита псовых, птичьего гриппа, туберкулеза и диагностики беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. С целью повышения качества лечебной помощи медицинским и ветеринарным специалистам рекомендуется гидрозольные препараты использовать как скрининговые тесты в диагностике самых разнообразных нозологий — туберкулеза, птичьего гриппа и гепатита псовых.

2. Материалы исследований внедрены и используются в учебном процессе на кафедре общей химии Кировской медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами лечебного и педиатрического факультетов.

3. Теоретические положения, методики расчета и результаты исследований диссертации использованы в отчете о НИР по договору № 14−06/11-К от 20 июня 2011 г. Результаты научных исследований использованы для разработки методических рекомендаций (положений) в рамках темы: «Лазурь», выполненной по заказу Федерального медико-биологического агенства (ФМБА) Минздравсоцразвития РФ, для оформления проекта технических условий и инструкции по применению. Предполагается выпуск теста для диагностики туберкулеза на профильных предприятиях ФМБА.

4.Техника постановки реакции гидрозольной агглютинации почти полностью совпадает с техникой постановки реакции пассивной гемагглютинации. В связи с этим стоимость анализов будет различаться лишь по стоимости применяемых диагностикумов. Так, стоимость эритроцитарного диагностикума, необходимого для постановки одного анализа РПГА, составляла 20 рублей или 0,70 доллара США, тогда как стоимость гидрозольного антигенного диагностикума, полученного нами в экспериментальных условиях и необходимого для постановки одного анализа, 5 рублей или 0,17 доллара США. Серийный выпуск в промышленных условиях позволит сократить затраты на его производство и приведёт к еще большему экономическому эффекту.

4. Благодаря оптимизации свойств компонентов гидрозольного препарата появляются такие необходимые качества, как высокая чувствительность и специфичность, длительность сроков хранения, простота считывания результатов, возможность ставить реакции с малыми объемами биоматериала. В результате получены рекомендации по синтезу и оптимальному применению гидрозолей, которые могут представлять интерес для практического здравоохранения, ветеринарии, промышленной биотехнологии и возможно спецслужб.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ.

1. Усовершенствование методик выявления инфекционных и соматических па-тологий при помощи реакции гидрозольной агглютинации /Попова C.B., Мешандин А. Г., Ворона М. В. и др. // Информационный лист № 43−024−08. -Киров: ЦНТИ. — 2008. — С. 1−2.

2. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M. tuberculosis /Попова C.B., Мешандин А. Г., Плехов В. Л. и др. // Материалы V съезда общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. — Москва: РАН. — 2008. — С. 283−284.

3. Попова C.B., Мешандин А. Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных бесприборных диагностикумов в выявлении антител к M. tuberculosis, птичьего гриппа, определение ХГЧ // Вятский медицинский вест-ник.- Киров: КГМА. — 2009. — № I. — С. 117.

4. Попова C.B., Мешандин А. Г., Ворона М. В. Изучение коллоидных растворов на основе гексацианферрата железа в качестве возможных диагностических препаратов// Вятский медицинский вестник. — Киров: КГМА. — 2009. — № I. — С. 111.

5. Попова C.B., Мешандин А. Г. Применение метода гидрозольной агглютинации в диагностике туберкулёзной инфекции //Российском биомедицинский журнал — 2009. № 10. С. 478−491.

6. Попова C.B., Мешандин А. Г. Использование гидрозольных препаратов в качестве экспрессных диагностикумов в ветеринарии // Ветеринарный врач. -2010.-№ 4-С. 24−26.

7. Попова C.B., Мешандин А. Г., Ворона М. В. Экспрессный бесприборный метод гидрозольной агглютинации //Вестник РГМУ- 2010.-специальный выпуск 2. С. 536−537.

8. Попова C.B., Мешандин А. Г., Ворона М. В. Диагностические препараты на основе коллоидного раствора гексацианферрата железа и оксида железа // Сборник научных трудов. — Самара: СГМУ. — 2010. — С. 263 264. — публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.