Нарушение функции иммунной системы при острой алкогольной интоксикации и алкоголизме

Актуальность проблемы. Алкогольная зависимость представляет собой серьезнейшую медицинскую и социальную проблему во всем мире и в нашей стране. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в мире алкоголизмом страдает более пяти миллионов человек. В России на ч сегодняшний день зарегистрировано более 2,5 миллионов человек, страдающих алкогольной зависимостью, а с 2000 года по темпам роста алкоголизма Россия обогнала большинство развитых стран мира [Кошкина Е.А., Киржанова В. В., 20 011]. Алкогольная зависимость поражает людей в расцвете физических, творческих и духовных сил, лиц разного возраста и разных социальных групп. Алкоголь часто является причиной нетрудоспособности молодых и деятельных слоев населения, ведет к потере активности и препятствует карьерному росту [Альтшулер В.Б., 2011; Кошкина Е. А., Киржанова В. В., 2005]. Алкоголизм приводит к росту смертности, увеличению травматизма и количества преступлений на бытовой и профессиональной почве. И, наконец, среди пьющего населения нашей страны резко возросла заболеваемость алкогольными психозами [Анохина И.П., 2011; Арзуманов Ю. Л., 2011; Иванец H.H. и др., 2011; Крок М. А., 2001].

Этанол не является чужеродным агентом для иммунной системы, в малых дозах (приблизительно 0,05 промилле, или 0,83 мг на организм) вырабатывается эндогенно в организме каждого человека и принимает участие в поддержании гомеостаза [Рожанец В.В., Нужный В. П., 2007]. Однако чрезмерное и частое его употребление (алкогольная интоксикация) негативно сказывается на функционировании практически всех органов и систем организма, оказывая на них токсическое действие [Акперов Э.К. и др., 2006; Анохина И. П., 2002; Кошкина Е. А., 2002].

При хронической алкогольной интоксикации чаще всего поражаются такие важнейшие органы: печень [Огурцов П.П. и др., 2011; Donohue Т.М. Jr., 2009]- почки [Тарасова Н.С., 2001; Frank J. et al., 2004]- сердце [Константинов.

B.B. и др., 1998; Кошкин И. В., Букач Т. А., 2001; Огурцов П. П. и др., 2011; Imhof A., Koenig W., 2003]- легкие, поджелудочная железа [Огурцов П.П. и др., 2011; Day P.C., 2000; Thomson G. S., 2001]- периферическая и центральная нервная система [Анохина И.П., 2008; Арзуманов Ю. Л., 2011; Мартынов М. Ю. и др., 2011]. Лица, злоупотребляющие алкоголем, входят в группу ч повышенного риска возникновения туберкулеза [Alvarez R.M., Godoy G.P.,.

1999; Mason С.М. et al., 2004] и онкологических заболеваний [Dossow V. et al., 2004] и входят в группу риска развития таких серьезных заболеваний, как гепатиты В и С [Должанская H.A., Бузина Т. С., 2011; Zhang Т., 2006]. Наконец, они чаще, чем кто-либо, подвержены простудным заболеваниям [Должанская H.A., Бузина Т. С., 2011; Boyadjieva N.I. et al., 2004].

Иммунная система, как и другие системы организма, подвергается пагубному воздействию алкогольной интоксикации [Альбрант А.И. и др., 2000; Плецитый К. Д., 1997; Плецитый К. Д., Давыдова Т. В., 1989]. Следует отметить, что до сих пор не определено место иммунной системы в патогенетических механизмах алкогольной интоксикации, особенно у лиц без сопутствующей патологии органов и систем, не страдающих аллергическими, аутоиммунными, онкологическими заболеваниями, туберкулёзом и другими инфекциями.

Несмотря на значительный интерес исследователей к проблеме алкогольной интоксикации, остаются спорными вопросы механизмов влияния этанола на иммунокомпетентные клетки организма человека и их роли в патогенезе органной и системной патологии. И, наконец, практически отсутствуют данные о влиянии алкогольной интоксикации на основные показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, а также у больных алкоголизмом до назначения медикаментозного лечения. Исходя из вышесказанного, проблема влияния алкогольной интоксикации на иммунную систему и её роли в механизмах развития органной патологии чрезвычайно актуальна.

Цель исследования: исследовать влияние острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых лиц и у больных алкогольной зависимостью без выраженной сопутствующей патологии органов и систем до назначения медикаментозного лечения.

Задачи исследования:

1. Исследовать in vitro в культуре клеток крови влияние различных доз этанола на пролиферативную активность лимфоцитов, цитолитическую активность NK-клеток, кислородзависимую активность фагоцитов и экспрессию на клеточных мембранах CD25-, CD38-, HLA-DR-молекул и молекул HLA I класса.

2. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя.

3. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом I стадии до назначения медикаментозного лечения.

4. Изучить особенности влияния острой алкогольной интоксикации на показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии до назначения медикаментозного лечения.

5. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии.

Научная новизна.

Впервые на модели острой алкогольной интоксикации in vitro при исследовании влияния разных доз этанола, вносимого в культуры клеток крови, установлено его угнетающее влияние на CD4+ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8+ Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих Т-клеток, индуцированную митогенным лектином Con А, и экспрессию на них активационных молекул — CD25, HLA-DR и CD38. Кроме того, этанол обладает способностью усиления экспрессии ч молекул HLA I класса на клетках иммунной системы в крови.

Впервые установлено, что этанол, вносимый in vitro в культуры клеток крови здоровых лиц (модель острой алкогольной интоксикации) в дозах, вызывающих сильное и слабое опьянение, приводит к нарушениям клеточного иммунитета.

Впервые с помощью широкого спектра иммунологических методов при исследовании репрезентативной выборки образцов периферической крови здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью, без выраженной соматической и системной патологии, проведено комплексное исследование основных параметров иммунного статуса, спустя 17−19 час после последнего употребления ими алкоголя. Получены принципиально новые данные о механизмах влияния острой алкогольной интоксикации на иммунную систему, что согласуется с результатами исследования прямого влияния этанола на клетки крови in vitro. Показана доминирующая роль С08±лимфоцитов в иммунном ответе при алкогольной интоксикации, указывающая на их возможную роль в развитии воспалительных процессов на уровне тканей и органов у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Впервые обнаружены сходные нарушения иммунитета после острой алкогольной интоксикации у лиц без синдрома зависимости от алкоголя и у больных алкогольной зависимостью.

Впервые показано, что острая алкогольная интоксикация приводит к нарушению пролиферативной активности Ти В-лимфоцитов и NK-клеток (натуральных клеток киллеров) и нарушению популяционного, субпопуляционного и активационного состава клеток крови как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (в количестве 0,2 л и более), так и у больных с алкогольной зависимостью.

Впервые выявлено, что острая алкогольная интоксикация приводит к повышению кислородзависимой активности фагоцитов и снижению их поглотительной способности как у здоровых лиц после нагрузки крепким алкоголем (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые обнаружено, что после острой алкогольной интоксикации, спустя 17−19 час после последнего употребления алкоголя, в периферической крови повышается содержание иммуноглобулинов классов, А и Е и снижается содержание иммуноглобулинов классов М и в, а также нарушается гемолитическая активность комплемента, изменяется содержание С1, СЗ и С4 компонентов системы комплемента, а также повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов как у здоровых лиц после употребления крепкого алкоголя (0,2 л и более), так и у больных алкоголизмом.

Впервые установлено, что острая алкогольная интоксикация ведёт к изменению типа иммунного ответа, о чём свидетельствуют сдвиги в содержании цитокинов — 1Ь-4,1Ь-2 и №N-7 — в образцах периферической крови здоровых лиц, так и у больных с алкогольной зависимостью.

Практическая значимость исследования.

Впервые получены принципиально новые данные о негативном влиянии острой алкогольной интоксикации как у лиц без синдрома зависимости от алкоголя, так и у больных алкоголизмом, на клеточные и гуморальные составляющие иммунной системы, приводящем к транзиторному иммунодефициту, активации цитолитических и аутоагрессивных реакций. Как следствие этих процессов возможно развитие системной и органной патологии, в частности, ослабление резистентности организма в борьбе с различными инфекциями и патологические изменения в органах и тканях, что было продемонстрировано ранее в имеющейся литературе.

Получены принципиально новые данные при исследовании показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных алкоголизмом в фазе продолжительной ремиссии (3−5 лет), указывающие на то, что именно алкогольная интоксикация является патогенным фактором для иммунной системы. Впервые показано также, что при прекращении употребления алкоголя больными алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии восстанавливаются все изученные параметры иммунной системы и исчезает иммунодефицит, что свидетельствует о временном, транзиторном, характере иммунодефицитного состояния у больных с алкогольной зависимостью.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу лечения иммуномодулирующих препаратов при условии продолжающегося употребления алкоголя.

Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия острой алкогольной интоксикации следует учитывать при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови в научно-практических и лечебно-профилактических учреждениях, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке, во-первых, ошибочного диагноза воспалительного процесса, и, во-вторых, ошибочного диагноза иммунодефицитного состояния.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Этанол in vitro в культурах клеток крови человека (модель острой алкогольной интоксикации) в диапазоне доз 6×10~5−6×10~' мг/мл не влияет на спонтанную пролиферацию лимфоцитов, однако статистически значимо усиливает последующую индукцию делений Т-лимфоцитов митогенным лектином Con «А (СБ8±лимфоциты) — приводит к значимому повышению экспрессии активационных молекул СБ25, СБ38, НЬА-ОЯ на СБ8±лимфоцитах и молекул НЬА I класса на клетках крови, а также приводит к статистически значимому снижению кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, индуцированной зимозаном и форбол-меристат-ацетатом (ФМА).

2. Острая алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям клеточного иммунитета у обследованных лиц, а именно:

— изменениям гемограммыпролиферативной активности Ти В-лимфоцитовцитолитической активности ТЧК-клеток (натуральные киллеры) — фагоцитарного звена иммунной системы;

— изменению популяционного состава клеток крови, которое выражается снижением в периферической крови процента СБ4+ Т-лимфоцитов (хелперов), отношения С04+/СБ8+ Т-лимфоцитов и увеличением процента СБ19+ В-лимфоцитов.

— увеличению в периферической крови процента активированных С08+БК+ Т-лимфоцитов, изменению процента активированных СЭ4+ Т-лимфоцитов и ТчГК-клеток, экспрессирующих ОЯ-молекулы.

3. Острая алкогольная интоксикация приводит к статистически значимым нарушениям гуморального иммунитета, а именно:

— изменению иммуноглобулинового профиля;

— изменению содержания комплемента и его компонентов;

— изменению содержания циркулирующих иммунных комплексов;

— изменению содержания цитокинов — 1Ь-4, 1Ь-2 и №N-7 — в периферической крови.

4. Статистически значимое повышение кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток, увеличение цитолитической активности! чГК-клеток, повышение экспрессии молекул НЬА I класса и экспрессии активационных молекул на СБ8±лимфоцитах, а также увеличение в периферической крови процента активированных СЭ8±лимфоцитов могут явиться предпосылкой для развития соматической патологии вследствие цитолиза клеток у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

5. Тяжесть нарушений клеточного и гуморального иммунитета возрастает по мере увеличения количества потребляемого алкоголя и длительности его потребления.

Публикация результатов исследования.

Основное содержание диссертации изложено в 40 публикациях, в том числе 23 публикациях в рецензируемых центральных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, 3 публикациях в периодической научной печати, главе в монографии, 13 публикациях в материалах научных конгрессов и конференций.

Апробация результатов диссертации.

Результаты исследования доложены на 2-ом Национальном конгрессе РААКИ (Москва, 1998 г.) — на XIV съезде психиатров России (Москва, 15−18 ноября 2005 г.) — конференции — Современные достижения наркологии, посвященной 20-летию Национального научного центра наркологии (Москва, 21−22 ноября 2005 г.) — на Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 3−7 октября 2005 г.) — на XI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе (Санкт-Петербург, 28−31 мая 2007 г.) — на VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 27 -29 июня 2007 г.) — на I Российском национальном конгрессе по наркологии с международным участием (Москва, 24 — 27 ноября 2009 г.) — на XIV Всероссийском научном Форуме с международным участием им. Академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2011» (Санкт-Петербург, 23 — 26 мая 2011 г.) — на VII Российской конференции, посвященной 90-летию со дня рождения академика РАМН Г. Н. Крыжановского.

Нейроиммунопатология" (Москва, 13−14 ноября 2012 г.) — на Третьей Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 5−6 марта 2013 г.).

Объём и структура работы.

Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Цели и задачи исследования», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований и обсуждение», изложенные в 5 главах- «Заключение», «Выводы» и «Библиографический указатель» — представлен 220 библиографическими источниками, в том числе 88 отечественных и 132 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 59 таблицами и 38 рисунками.

Часть II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Особенности алкогольной зависимости, её биологические и иммунологические механизмы.

Проблема алкогольной зависимости приобрела в нашей стране в настоящее время драматический характер по всем важнейшим параметрам: по количеству потребляемого алкоголя, заболеваемости алкоголизмом и алкогольными психозами, травматизму, смертности, преступлениям на почве алкоголизма, негативному воздействию на трудовую деятельность и семью [Альтшулер В.Б., Чередниченко Н. В., 1992; Анохина И. П., 2011; Арзуманов Ю. Л., 2011; Барденштейн JIM. и др., 2007; Кошкина Е. А., Киржанова В .В., 2008; Ливанов Г. А. и др., 2000; Нужный В. П., 2002; Москаленко В. Д., 2006; Цыган В. Н. и др., 2008].

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) алкоголизмом страдают более пяти миллионов человек, что создает серьезные медико-социальные проблемы для системы здравоохранения большинства стран мира.

С 2000 года Россия по темпам роста алкоголизма обогнала большинство развитых стран мира. Официальные данные статистики говорят о том, что более 2,5 миллионов больных алкоголизмом состоят на учете в специализированных медицинских учреждениях, не считая тех лиц, которые, будучи алкоголиками, в эти учреждения не обращаются [Кошкина Е.А., 2005].

Алкогольная зависимость все чаще поражает людей разного возраста и разных социальных групп, в расцвете физических, творческих и духовных сил, в связи с чем эта проблема на сегодняшний день переросла узко медицинские рамки и стала в нашей стране задачей социальной и демографической важности [Альтшулер В.Б., 2008; Анохина И. П. и др., 1987; Белокрылов И. В., Даренский И. Д., 2002; Иванец H.H., 2002; Кошкина Е. А., Киржанова В. В., 2005; Нужный В. П., 2002; Gillin J.C. et al., 1990].

В России, как известно, традиционно наблюдался высокий уровень злоупотребления алкоголем, который в последнее десятилетие существенно возрос. Значительно расширились возрастные диапазоны пьющих лиц. Неблагоприятные социально-политические и социально-экономические процессы вызвали массовые миграционные явления, резкие изменения привычного жизненного стериотипа у многих социальных групп. Увеличивающиеся нервно-психические перегрузки привели к неизбежной дезадаптации не только лиц пожилого возраста, но и молодежи, и, как следствие, — к росту заболеваемости алкоголизмом в этих возрастных группах [Анохина И.П., 2001; Арзуманов Ю. Л., Барденштейн Л. М. и др., 2007; Ливанов Г. А. и др., 2000; Нужный В. П., 2002; Судаков С. К., 2007].

Алкоголизм является самой распространенной формой зависимости от психоактивных веществ (ПАВ) и, как всякая болезнь, она имеет свое начало, свои этапы, свой финал и протекает с той или иной скоростью [Альтшулер В.Б., 1994; Анохина И. П. и др., 1997; Белокрылов И. В., Даренский И. Д., 2002; Кошкина Е. А., 2002; Gillin J.C. et al., 1990; Frank J. et al., 2004; Seitz H.K. et al., 2001].

Клиническим проявлением алкогольной зависимости являются симптомы, которые отличаются друг от друга на различных стадиях тяжестью расстройств. На начальной стадии заболевания у больного отмечается патологическое влечение к спиртному без алкогольного абстинентного синдрома (ААС). При второй стадии алкогольной зависимости присоединяется алкогольный абстинентный синдром, а для третьей стадии характерные деградация личности и тяжёлые сомато-неврологические расстройства [Альтшулер В.Б., 2008].

Наибольшие трудности в диагностики заболевания представляет начальная стадия (первая), которая постепенно переходит от простого злоупотребления алкоголем (бытовое пьянство) к патологическому влечению. Она характеризуется неврозоподобными расстройствами, патологическим влечением к алкоголю и сопровождается изменениями поведения и социального облика. У больного меняется симптоматика опьянения: выраженная раздражительность, придирчивость, грубость, растёт суточная толерантность к алкоголю [Альтшулер В.Б., 2008].

У больных при второй стадии алкогольной зависимости в отличие от первой появляется алкогольный абстинентный синдром (ААС), изменяется характер употребления алкоголя, а именно: приём высоких доз алкоголя становится частыми, в результате формируется запойный либо постоянный тип злоупотребления спиртными напитками, в несколько раз вырастает толерантность к алкоголю. Формируются психопатоподобные состояния либо заостряются преморбидные личностные особенности. У этой категории больных при алкогольном опьянении появляется: агрессия, психическая регидность, брутальность аффекта, амнезия — утрата памяти о том, что в это время происходило [Альтшулер В.Б., 2008].

При третьей стадии алкогольной зависимости отсутствуют утончённые эмоции, усиливаются примитивные влечения, нивелируются душевные привязанности, появляется распущенность, дурашливость при опьянении, снижаются интеллектуально-мнестические способности и т. д. В отличие от первой и второй стадии алкоголизма у больных резко снижается толерантность к алкоголю [Альтшулер В.Б., 2008; Винникова М. А., Кинкулькина М. А., 2008].

Исследования отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют о том, что злоупотребление алкоголем способствует в 2−3 раза более частому развитию у пьющих заболеваний центральной нервной системы [Александровский Ю.А., 2005; Альтшулер В. Б., Лукин A.A., 2006; Анохина И. П., 2011; Крок М. А., 2001; Мартынов М. Ю. и др., 2011; Xiao B-G., Link Н., 1998]. Чрезмерное употребление алкоголя влияет на определенные системы и структуры мозга, вызывая синдром зависимости, являющийся стержневым в клинической картине алкоголизма [Анохина И. П., 2011]. Алкогольная интоксикация оказывает токсическое воздействие практически на все внутренние органы и системы организма [Арзуманов Ю.Л., 2001; Ашмарин И. П. и др., 1996; Кошкина Е. А., 2002; Мартынов М. Ю. и др., 2011; Огурцов П. П. и др., 2011; Adams D.H., 1994; Constant J., 1997; Cook R. T., 1998; Lieber.

C.S., 2004; Seitz H.K., Suter P.M., 2002].

Согласно результатам эпидемиологических исследований, хроническая алкогольная интоксикация является причиной возникновения большого числа соматических заболеваний, таких как патология печени — алкогольный гепатит, стеатоз и цирроз печени [Морозов И.А., 2002; Огурцов П. П. и др., 2011; Adams.

D.H., 1994; Aloman С. et al., 2007; Bautista A.P., 2002; Daniluk J. et al., 2001; Donohue TM Jr., 2009; Leevy C.B. et al, 2005; Lieber C.S., 2004; Thomson G. S., 2001; Thomson G. S., 2006]- патология почек — алкогольный гематурический нефрит и уратная нефропатия [Тарасова Н.С., 2001; Тарасова Н. С., Белобородова Э. И., 2003; Frank J. et al., 2004]- патология сердечно-сосудистой системы — алкогольная кардиомиопатия, алкогольная артериальная гипертензия [Кошкина Е.А., Букач Т. А., 2001; Огурцов П. П. и др., 2011; Constant J., 1997; Imhof A., Koenig W., 2003; Sacco R.L. et al., 1999]- патология эндокринной системы — сахарный диабет [Ben-Eliyahu S. et al., 1996; Day P.C., 2000]. Доказано, что лица, злоупотребляющие алкоголем, входят в группу повышенного риска развития таких серьезных заболеваний как туберкулез, гепатиты В, С и ВИЧ-инфекция [Должанская H.A., Бузина Т. С., 2011; Aloman С. et al., 2007; Alvares R.M., Godoy G.P., 1999; Jacobson, 1992; Jerrells T.R., 2002; Krupitsky F.M. et al., 2006; Molina P.E. et al., 2006; Ozden N., 2003; Potula R. et al., 2006; Safdar K. et al., Schiff E., 2004; Zhang T. et al., 2006;] и онкологические заболевания [Anderson L.M., 1992; Bode J.C. et al., 2000; Diaz L.E. et al., 2002; Dossow V. et al. 2004; Feigelson H. et al., 2001; Kolls J.K. et al., 1998; Rohan T. et al., 2000; Seitz H.K. et al., 2001; 2002]. И, наконец, они чаще подвержены простудным заболеваниям [Должанская H.A., Бузина Т. С., 2011; Gillin J.C. et al., 1990; Boyadjieva N.I. et al., 2004; Dossow V. et al., 2004; Kolls J.K. et al., 1998; PaviaC.S. et al., 2004].

По данным немногочисленных исследований, как в России, так и за рубежом, у детей, родившихся от больных алкоголизмом родителей, повышается риск развития этого заболевания [Коннор П., Стрессгус А., 1999].

С конца XX века, как у нас, так и за её пределами возрос интерес к нозологической форме патологии, именуемой алкогольная болезнь [Евсеев В.А., 1990; Плецитый К. Д., 1997; Gillin J.C. et al., 1990]. Необходимо подчеркнуть, что основное внимание уделялось патологии ЦНС (прямое токсическое действие алкоголя на нейроны, энцефалопатия, нарушение функциональной активности и метаболизма медиаторов, эмоциональные нарушения и т. д.), патологии сердечно-сосудистой системы (гипертоническая болезнь, алкогольная кардиомиопатия) и патологии печени (жировая инфильтрация, гепатит и цирроз). Следует отметить, что иммунологическим процессам не уделялось должного внимания, несмотря на то, что иммунная система, также как и нервная и эндокринная, является системой интеграционной и находится во взаимодействии с ними в норме и при патологии [Хаитов P.M., 2010; Ярилин А. А., 2010; Haddad J.J., 2004].

При анализе патогенеза алкогольной болезни мы имеем дело с различными видами и проявлениями повреждений органов и тканей: сосудовпеченипочекжелудочно-кишечного тракта (циррозы, панкреатиты, гастриты, пептические язвы желудка и т. д.) и органов дыхания [Альтшулер В.Б., 1994; Анохина И. П., 2001; Иванец Н. Н., 2001; Огурцов П. П. и др., 2011; Adams, D.H. et al., 1994; Baumgarten et al., 1996; Constant J., 1997; French W.S., 1996; Goldberg R. et al., 1995; Szalay F., 2003; Szuster-Ciesielska A. et al., 2000], приводящих к компенсируемым и некомпенсируемым нарушениям функции этих органов, что, в свою очередь, вызывает каскад вторичных трофических нарушений и, как следствие, — развитие нового цикла нарушений функции органов. Злоупотребление алкоголем способствует усилению этих нарушений, которое усугубляется еще и тем, что иммунная система находится в постоянном напряжении. Отвечая на постоянные стимулы извне (алкогольная интоксикация), она исчерпывает свои резервы, что может привести к возникновению иммунодефицитного состояния [Cook R.T., 1998; Singh А.К. et al., 2007].

Иммунная система играет важнейшую роль в патогенетических механизмах возникновения и развития всех заболеваний, которыми страдает человечество земного шара [Ярилин A.A., 2010]. Фундаментальные исследования в области прикладной иммунологии значительно расширили наши представления о роли иммунной системы в поддержании гомеостаза организма. Основными клетками, поддерживающими гомеостаз, являются фагоцитирующие, антигенпредставляющие клетки и лимфоциты [Гущин И.С., 2000; Манько В. М., Девришов Д. А., 2011; Пинегин Б. В., 2000; Рабсон А. и др., 2006; Хаитов P.M. и др., 2010; Ярилин A.A., 2010].

Организм человека при проникновении патогена, переохлаждении, стрессе, действии химических веществ, в частности избытка алкоголя, может воспользоваться огромным арсеналом защитных механизмов иммунной системы, как врожденных (иммунологически неспецифических), так и адаптивных (приобретённых, иммунологически специфических). При успешном развитии защитных реакций повреждение быстро устраняется или вовсе не проявляется. При неадекватном развитии иммунологические реакции способны вызвать повреждение организма и могут сами по себе составлять часть патологического процесса [Ярилин A.A., 2000].

Полагают, что увеличение частоты возникновения злокачественных новообразований, аутоиммунных и инфекционных заболеваний, нарушение регенерации тканей у больных алкоголизмом является следствием нарушения функций иммунной системы [Тарасова Н.С., 2001; Тарасова Н. С., Белобородова Э. И., 1998; Happel K.I., Nelson S., 2005;Harcombe A.A. et al., 1995; Rohan Т. et al., 2000; Salaspuro M.P., 2003].

В 2003 году Schiff E. и Ozden N. на основании клинических исследований высказали предположение, что алкогольное поражение внутренних органов, например, алкогольное заболевание печени, отчасти обусловлено или обостряется в результате развития аутоиммунных процессов, запускаемых при злоупотреблении алкоголем. В этой связи ряд исследователей делают вывод, что основополагающим фактором патогенеза этих заболеваний следует считать нарушение иммунных механизмов в ответ на действие алкоголя, как главного этиологического агента [Плецитый К.Д., 1997; Cook R.T., 1998; Messingham K.A.N., 2002].

Таким образом, можно предположить, что этанол при чрезмерном его употреблении может выступать в роли «патогена», внося серьезные изменения и нарушения как механизмов врожденного, так и адаптивного иммунитета, а в дальнейшем и систем организма в целом.

2. Особенности биотрансформации этанола в организме человека.

В ряду биологически активных веществ, продуцирующихся непосредственно тканями организма человека, важную роль играет этанол. Он вырабатывается эндогенно гепатоцитами печени человека в количестве до 0,05 промилле, что составляет приблизительно 0,83 мг на организм, и принимает участие в поддержании гомеостаза [Рожанец В.В., Нужный В. П., 2007].

При поступлении в организм человека этанол почти полностью подвергается биотрансформации, и всего лишь 2−8% принятого алкоголя в неизмененном виде выводится из организма. От 60% до 80% алкоголя окисляется в цитоплазме гепатоцитов [Нужный В.П., 2002; Рожанец В. В., Нужный В. П., 2007]. Незначительная часть поступившего в организм алкоголя подвергается биотрансформации в других тканях и органах, а именно в эндотелии сосудов, почках, легких. Окисление этанола, в отличие от окисления большинства других веществ, почти не зависит от его концентрации в крови и идет с постоянной скоростью (кинетика нулевого порядка). Скорость окисления этанола после однократного приема составляет примерно 100 мг/кг в час у мужчин и 85 мг/кг в час у женщин. Это различие обусловлено тем, что скорость окисления алкоголя в слизистой желудка и относительное содержание воды в организме женщин ниже [Рожанец В.В., Нужный В. П., 2007]. При участии алкогольдегидрогеназной и, в меньшей степени, микросомальной и каталазной систем алкоголь окисляется в ацетальдегид, последний вступает во взаимодействие со структурными и функциональными элементами крови, с клетками эндотелия сосудов и других тканей [Trudel J.R. et al., 1991]. Употребление алкоголя в количестве 1 г/кг, что соответствует пиковой концентрации этанола в крови — 1 г/л, ацетальдегид обнаруживается в крови на протяжении 3-х часов в концентрации 0,0001 — 0,001 г/л. При увеличении нагрузки алкоголем поступление ацетальдегида в кровь возрастает. Около 90% ацетальдегида подвергается дальнейшему окислению по месту его образования и превращается в свободный ацетат. В итоге 70 — 80% поступившего в организм человека этанола превращается в свободный ацетат. Примерно 20% поступающего из печени в кровь ацетальдегида образует стабильные N-этил-лизиновые конъюгаты (аддукты) не только с белками плазмы, но и с белками, находящимися в клетках: гемоглобином, цитохромами Р450 2Е1, Р4503А и белком печени с молекулярной массой 37 кД [Seitz H.K. et al., 1998]. В ряде работ есть указания также на то, что употребление этанола способствует появлению в сыворотке крови специфических антител к ацетальдегидным аддуктам Р4502Е1, Р4503А [Clot Р. et al., 1999], повышение титра которых совпадает с началом поражения печени или аутоиммунных заболеваний [Cook R.T., 1998].

3. Алкогольная интоксикация и восприимчивость к инфекциям.

Мнение о влиянии алкоголя на иммунную систему укоренилось после того, как появилось представление о целебном, противопростудном, бактерицидном, сосудорасширающем, «согревающем» при переохлаждении эффекте алкоголя [Евсеев В.А., 1990]. Это послужило отправной точкой для изучения биологических свойств этанола. Было обнаружено, что приём небольшого количества алкоголя сопровождается непродолжительным иммуностимулирующим действием на фагоциты человека и животных.

На начальном этапе исследование эффектов этанола проводилось на культуре лейкоцитов, полученных из крови здоровых доноров. Было установлено, что малые концентрации этанола (1,6−0,6 г/л) повышают хемотаксис нейтрофилов, при этом не изменяются их бактерицидные свойства. Авторы этих исследований сделали вывод, что однократный прием алкоголя приводит к активации хемотаксиса и фазы захвата микробов, но не переваривания их. И лишь дозы, в десятки раз превышающие малые концентрации этанола (выше 64 г/л), угнетают хемотаксис и бактерицидную функцию нейтрофилов. Вместе с тем, у больных алкоголизмом, вне зависимости от принятого алкоголя, обнаруживалась повышенная функциональная активность нейтрофилов. Подавляющий же эффект алкоголя на функциональную активность фагоцитов, обнаруженный на мышах, а также в крови человека, как установили авторы, не наблюдается [Евсеев В.А., 1990; Плецитый К. Д., 1997].

Евсеев В.А. с соавторами (1990) и иностранные авторы [Bautista А.Р. et al., 2002] в экспериментах на различных видах животных (мышах, крысах, кроликах) получили данные, свидетельствующие о том, что прием в течение непродолжительного времени 15% раствора этанола приводит к повышению резистентности, активирует функцию макрофагов, Ти В-лимфоцитов, бактерицидных свойств сыворотки крови. Но этот эффект непродолжителен и при дальнейшем приеме алкоголя через 3⁴ недели сменяется выраженным подавлением механизмов иммунной защиты животных.

Позднее в экспериментах на животных рядом исследователей было подтверждено развитие иммуносупрессии под влиянием высоких доз алкоголя [Акперов Э.К. и др., 2006; Bautista А.Р. et al., 2002; Bukara М. et al., 2000]. В 1990 Евсеев В. А. и соавторы показали, что у мышей породы С57/В16 даже кратковременное введение высоких доз этанола в пищевой рацион вызывало угнетение фагоцитарной активности макрофагов и снижение их количества.

Полученные сведения об изменениях функциональной активности фагоцитарной системы крови согласуются с результатами изучения влияния алкогольной интоксикации на резистентность организма к инфекционно-токсическим воздействиям. Так, Аверьянова Л. Л. и Ходорова В. Г. (1976) исследовали устойчивость мышей, подвергнутых действию алкоголя, к заражению культурой стафилококка и токсинами возбудителей газовой гангрены. При введении животным 15% раствора этанола в течение 5−15 дней наблюдалось достоверное повышение резистентности к инфекционно-токсическим агентам, тогда как 30-дневное введение алкоголя сопровождалось значительным снижением резистентности животных к исследуемым факторам. После прекращения введения животным раствора этанола состояние иммунореактивности приходило к норме.

Углубленное изучение патогенетических аспектов алкогольной патологии позволило многим исследователям прийти к заключению, что развитие ее во многом обусловлено иммунотропным эффектом этанола [Цыган В.Н. и др., 2008; Frank J. et al., 2004].

В работах последнего десятилетия убедительно показано, что наиболее частыми причинами заболеваемости и смертности больных алкоголизмом являются тяжелые инфекции, возникновение которых обусловлено нарушением механизмов иммунной системы в результате действия алкогольной интоксикации [Imhof A., Koenig W., 2003; Kovacs E.I., Messingham К.А., 2002; Nelson S., Kolls J.K., 2002; Pavia C.S. et al., 2004; Sander M. et al., 2005; Wang F. et al., 2006].

Наиболее частыми причинами смертности больных алкоголизмом являются пневмонии. Happel K.I. (2005) и Nelson S. (2002) показали, что смертность при алкоголизме от пневмоний у мужчин — в семь раз, у женщин — в три раза выше, чем у непьющего контингента.

В результате многочисленных исследований получены факты, касающиеся частоты заболеваемости бактериальными формами пневмонии [Nelson S. et al., 1992]. Позднее ряд исследователей пришли к единому выводу, что частота заболеваемости бактериальной, в том числе пневмококковой формами пневмонии у злоупотребляющих алкоголем намного чаще, чем у непьющих лиц, особенно в постоперационном периоде и после травм [Cook R.T., 1998; Grimsley E.W., 1995; Messingham K.A.N, et al., 2002; Pavia C.S. et al., 2004; Roux A. et al., 2006; Spies С., Eggers V., 2006].

Алкогольная интоксикация является фактором повышенного риска возникновения генерализованных инфекций со смертельным исходом (до 38%). При этом, чаще всего из крови этих больных с алкогольной зависимостью высевают Escherichia coli (в 57% случаев) и Klebsiella pneumoniae (в 17%) [Boudma L. et al., 2006]. Наличие в организме больных с алкогольной зависимостью сопутствующих инфекций (болезни мочеполового тракта, бактериальный перитонит, инфекции желчевыводящих путей) способствует генерализации инфекции [Diaz L.E. et al., 2002].

Frank J. et al. (2004) считают, что основная причина возникновения генерализованных инфекций у больных с алкогольной зависимостью, с одной стороны, связана с повышенной проницаемостью слизистой кишечника для липополисахарида (ЛПС) — основного эндотоксина клеточной стенки Грам-отрицательных бактерий, и со снижением клиренса ЛПС печенью. А с другой стороны — с резким снижением эндотоксин-нейтрализующей активности сыворотки крови. Рядом исследователей обнаружено, что у многих больных алкоголизмом снижена секреция провоспалительных цитокинов альвеолярными макрофагами, стимулированными ЛПС, что приводит к повышению их восприимчивости к пневмонии [Cook R.T., 1998; Khoruts A. et al., 1991; Ross R., 1993; Happel K.I., Nelson S., 2005; Messingham K.A.N. et al., 2002; Roux A. et al., 2006; Smits H.H. et al., 2001]. В результате возникает ЛПС-индуцированное гиповоспалительное состояние врожденного иммунитета, которое обусловлено нарушением синтеза прои противовоспалительных цитокинов, в частности, снижением секреции интерлейкина-12 [Mason М.С. et al., 2004; Frank J. et al., 2004]. Существует предположение, что IL-12 играет решающую роль в развитии септических осложнений [Peterson J.D. et al., 1998].

В последние годы значительно повысилась частота заболеваемости и смертности от туберкулеза больных с алкогольной зависимостью не только в нашей стране, но и за ее пределами. Заболевание туберкулезом составляет большую проблему для общества, особенно в связи с появлением лекарственно устойчивых штаммов возбудителя этой болезни [Cook R.T., 1998; Krupitsky Е.М. et al., 2006; Mason.M.C. et al., 2004].

По данным Cook R.T. (1998) и Krupitsky E.M. et al. (2006) туберкулез у лиц, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками, встречается в 15 — 200 раз чаще, чем в группах непьющих и мало пьющих людей. Замечено: сопутствующий туберкулез чаще встречается у больных алкоголизмом (53%), чем у лиц, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками (10%) или только наркотиками (4%).

При заражении мышей Mycobacterium tuberculosis на фоне потребления ими алкоголя Mason С. М et al. (2004) выявили снижение сопротивляемости организма к возбудителю, которое сопровождалось нарушением специфического иммунного ответа CD4+ (хелперных) и CD8+ (цитотоксических) Т-лимфоцитов. При этом в легких формировались дефектные гранулемы. Эта работа послужила доказательством того, что злоупотребление алкоголем пагубно влияет на заболеваемость туберкулезом не только благодаря сопутствующим неблагоприятным социально-экономическим факторам, но также в результате непосредственного влияния на иммунную систему.

В результате большого количества эпидемиологических исследований как в России, так и за ее пределами были выявлены факторы риска, которые представляют собой «главных обвиняемых» в развитии цирроза печени [Adams.

D. H. et al., 1994; Day C.P., 2000; Hines I.N. et al., 2004; Laso F. J. et al., 1997, 2007; Leevy C.B. et al., 2005]. К этим факторам относят злоупотребление алкоголем, наркотиками и повышенную чувствительность к вирусам гепатитов В (HBV) и С (HCV) [Donohue Т.М. Jr., 2009; Gonzalez-Quintela A. et al., 2000; Schiff E., OzdenN., 2003].

Рядом исследований продемонстрировано высокое заражение HBV и HCV при наличии у больных нескольких факторов риска, таких как чрезмерное употребление алкоголя, наркотиков, гомосексуализм [Schiff Е., Ozden N., 2003]. В то же время в группе «чистых» алкоголиков не отмечалось повышения частоты встречаемости HBVоднако HCV выявлялся у них приблизительно на 10% чаще, чем у непьющих людей. Это обстоятельство, как отмечает Cook R.T. (1998), может указывать на повышенную восприимчивость алкоголиков к HCV. В общей группе больных алкоголизмом, включающей как «чистых» алкоголиков, так и лиц с дополнительными факторами риска, вирусы HBV или HCV обнаруживались в 10−50% случаев.

Schiff Е. и Ozden N. (2003) показали, что около одной трети больных с алкогольной зависимостью с клиническими признаками заболевания печени инфицированы HCV, что в 4 раза превышает частоту инфицирования вирусом гепатита С среди алкоголиков без признаков заболевания печени. По данным отечественных исследователей в Санкт-Петербурге и Ленинградской области инфицирование больных алкоголизмом вирусами гепатитов В и С отмечено в 7 и 14% случаев соответственно [Krupitsky F.M. et al., 2006]. Многие исследования показали, что тяжелое пьянство ускоряет переход хронического гепатита С в цирроз и рак печени, главным образом, гепатоцеллюлярную карциному [Цыган В.Н. и др., 2008; Doli R. et al., 1999; Schiff E.R., Ozden N., 2003; Kreisler W. et al., 1999].

Клинико-патологические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что продолжительное потребление алкоголя в дозах (40г водки в сутки) в группе HCV-позитивных лиц приводит к развитию цирроза печени чаще (в 32% случаев), чем у лиц, употребляющих алкоголь в меньших дозах (в 10% случаев). Увеличение же суточных доз алкоголя до 41−80г водки удваивает риск развития гепатоцеллюлярной карциномы у лиц, инфицированных HCV, и учетверяет этот риск при употреблении алкоголя в больших дозах. Таким образом, на фоне инфицирования вирусом гепатита С употребление алкоголя особенно пагубно сказывается на состоянии печени [Zhang Т. et al., 2006].

Schiff E.R. и Ozden N. (2003) и Aloman С. et al. (2007) утверждают, что среди механизмов повреждающего действия алкоголя на печень в условиях инфицирования вирусом гепатита С можно отметить следующее: усиление репликации HCV в печени, о чем свидетельствует более высокая концентрация РНК вируса в кровиповышение частоты мутаций вируса HCV с образованием так называемых квази-типов, плохо узнаваемых иммунной системой, которое сопровождается усилением программируемой смерти (апоптоза) печеночных клеток, дисфункцией дендритных клеток селезенки, проявляющейся изменением профиля синтезируемых последними иммунорегуляторных белков (повышением секреции IL-l? и IL-10, снижением секреции фактора некроза опухолей альфа, IFN-y, IL-12 и IL-6). Помимо этого, наблюдается угнетение иммунного ответа Т-хелперных и Т-цитотоксических лимфоцитов, играющих основную роль в элиминации вируса (что обусловлено, в свою очередь, дисфункцией дендритных клеток). И, наконец, приводит к жировой дистрофии печени (стеатозу) — избыточному отложению ионов железа в органах и тканях, прежде всего в печени и оксидантному стрессу, характеризующемуся повышением уровня свободных радикалов кислорода и снижением факторов антиоксидантной защиты.

Особый интерес представляют работы, посвященные изучению роли чрезмерного употребления алкоголя в резистентности к ВИЧ-инфекции и в прогрессировании симптомов заражения. Большая группа исследователей пришла к выводу, что при алкогольной болезни повышается восприимчивость к ВИЧ-инфекции в момент заражения [Должанская H.A., Бузина Т. С., 2011;

Haorah J. et al., 2004; Potula R. et al., 2006]. Кроме того, существуют доказательства того, что употребление алкоголя инфицированными лицами повышает риск прогрессирования у них бессимптомной инфекции с формированием СПИДа и глубокого иммунодефицита [Wang X. et al., 2006].

Liu X. et al. (2003) в экспериментах in vitro установили, что при культивировании выделенных мононуклеаров ВИЧ-инфицированных больных с этиловым спиртом наблюдается усиление репликации ДНК вируса в культурах, что, как утверждают авторы, является следствием усиленного проникновения вируса в CD4+ Т-клетки в результате увеличения количества HIV-1 ко-рецептора, сопровождаемого повышением уровня внутриклеточного цАМФ.

В исследованиях in vitro было установлено, что алкоголь способен усиливать инфицирование лимфоцитов периферической крови и клеток лимфоидной линии человека (СЕМХ174) вирусом иммунодефицита человека, т. е. проявлять коморбидное действие, вследствие индукции в них синтеза эндогенного бета-эндорфина и усиления экспрессии мРНК, специфичной для мю-опиоидных рецепторов. Это заключение подтверждается предотвращением усиления ВИЧ-инфекции, вызванного алкоголем или экзогенным бета-эндорфином, при введении налтрексона или специфического антагониста мю-опиоидных рецепторов (СТАР) [Wang X. et al., 2006].

В 2006 г. Molina Р.Е. et al. показали, что заражение макак резус вирусом иммунодефицита обезьян на фоне хронического внутрижелудочного введения алкоголя приводило как к высокой вирусной нагрузке, так и к усилению метаболической дисрегуляции, что способствовало возникновению воспалительной реакции в скелетных мышцах обезьян.

В экспериментах на мышах Potula R. et al. (2006) получили доказательства того, что алкоголь является кофактором в прогрессировании ВИЧ-1 инфекции. Авторы показали, что потребление алкоголя инфицированными мышами приводило к усилению виремии и нейровоспаления, а также препятствовало ч эффективной элиминации зараженных вирусом макрофагов. Недавно было показано, что хроническое потребление алкоголя крысами усиливает вредоносное действие белка оболочки ВИЧ, gp 120, играющего ключевую роль в прогрессировании ВИЧ-инфекции, в результате угнетения его распада в гепатоцитах [Singh А.К. et al., 2007].

Таким образом, у больных туберкулезом, гепатитами В и С, ВИЧ-инфекцией, инфекциями мочеполового тракта, злоупотребляющих алкоголем, происходит аддитивное действие этих двух патогенных факторов на развитие поражения легких, печени, почек, связанное, прежде всего, с изменениями в иммунной системе организма.

4. Алкогольная интоксикация и органная патология.

Очевидной причиной возникновения соматических заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем, является действие этанола на жизненно важные органы человека. К этим заболеваниям относятся: патология ЦНС, патология печени (гепатиты, цирроз), патология почек (воспалительные и онкологические заболевания), патология сердечно-сосудистой системы (алкогольные миокардиопатии), патология желудочно-кишечного тракта и т. д. [Анохина И.П., 2002; Барденштейн Л. М. и др., 2007; Leevy C.B., Elbeshbeshy Н.А., 2005; Roux A. et al., 2006; Zhang T., Li Y., Ho W.Z., 2006]. Цитируемые здесь авторы сделали заключение, что нарушения в иммунной системе являются определяющими в развитии вышеперечисленных патологий, что связано с отрицательным иммунотропным действием этанола [Цыган В.Н. и др., 2008].

Важную роль в развитии воспалительных процессов, происходящих в нервной, сердечно-сосудистой, выделительной и пищеварительной системах, играет алкогольная интоксикация [Альбрант А.И. и др., 2000; Цыган В. Н. и др., 2008; Cook R.T., 1998].

Алкоголь прежде чем попасть в печень и подвергнуться метаболизму, из желудочно-кишечного тракта поступает в кровеносные сосуды и с кровью попадает во все жизненно важные органы, тем самым оказывая непосредственное влияние на них. В условиях чрезмерного употребления алкоголя происходит активация клеток, формально не относящихся к иммунной системе, прежде всего эпителиальных (пищеварительной, выделительной систем) и эндотелиальных клеток сосудов, что сопоставимо с влиянием инфекции, химических веществ, стрессом и т. д. [Ярилин A.A., 2000].

Слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта представляют собой барьер между окружающей средой и средой макроорганизма. Они предохраняют от воздействия чужеродных агентов, которые способны проникать сквозь эпителий в макроорганизм, тем самым вызывая в нем заболевания (инфекционной, аллергической и другой этиологии) [Faria A.M.С., Weiner H.L., 1999].

В слизистых оболочках всех органов содержатся в небольших количествах клетки иммунной системы, которые не всегда образуют определенные структуры [Brandtzaeg P.A. et al., 1999; Faria A.M.C. et al., 1999].

Слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта покрыты однослойным эпителием. Он не являются иммунологически пассивной клеточной структурой, а участвует в представлении антигена лимфоцитам с фенотипами CD4+ и CD8+ [Hershberg R.M., Mayer L.F., 2000]. Более того, при действии химических веществ [Хаитов P.M., 2006; Ярилин A.A., 2010], и, по-видимому, при воздействии алкоголя, слизистый эпителий желудочно-кишечного тракта способен отвечать на эти воздействия.

Эпителиальные клетки слизистых на своей поверхности экспрессируют мембранные белки, свойственные антиген-представляющим клеткам, а именно: молекулы адгезии и молекулы главного комплекса гистосовместимости класса I (HLA I), а при активации на них появляются молекулы класса II (HLA-DR) и костимуляционные молекулы группы В7 [Алексеев Л.П., Хаитов P.M., 2001; Хаитов P.M., Алексеев Л. П., 2000].

Рядом исследователей было показано, что иммунная система принимает активное участие в развитии у больных алкоголизмом септических артритов, артралгий, пищевых аллергий и других заболеваний [Акперов Э.К. и др., 2006; Огурцов П. П. и др., 2011; Ishimuru Н., 2000; Serghini-Idrissi N., et al., 2001; Tirado-Miranda R., et al., 2001]. И, наконец, чрезмерное употребление алкоголя способствует возникновению и развитию онкологических заболеваний пищевода, желудочно-кишечного тракта [Огурцов П.П. и др., 2011; Anderson L.M., 1992; Ben-Eliyahu S., et al., 1996; Rohan Т., et al., 2000; Salaspuro M.P., 2003; Szalay F., 2003; Visappa J.P. et al., 2005].

Немногочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что алкогольная интоксикация приводит к поражению поджелудочной железы (Огурцов и др., 2011; Szalay F., 2003; Szuster-Ciesielska A. et al., 2000). Так, Szuster-Ciesielska A. et al. в 2000 г показали, что злоупотребление алкоголем может привести к развитию алкогольного панкреатита. Авторы высказали предположение, что в патогенезе этого заболевания определенную роль играет нарушение гомеостаза цитокинов. Кроме того, авторами было показано, что у больных алкогольным панкреатитом отсутствует генетическая взаимосвязь с болезнью (нет ассоциативных маркеров предрасположенности к заболеванию), главной причиной болезни является алкогольная интоксикация.

Из желудочно-кишечного тракта основная часть алкоголя попадает в кровеносные сосуды, эндотелий которых, как известно, также как и слизистые желудочно-кишечного тракта, отвечает на воздействие веществ химической природы [Дейл М.М., Форман Дж.К., 1998].

Эндотелий кровеносных сосудов представляет собой в нормальном состоянии непроницаемую, а при патологии полупроницаемую мембрану, через которую происходит контролируемый соответствующими гомеостатическими тканевыми механизмами субстратный обмен внутритканевых сред. Люминальная поверхность эндотелиоцитов (обращенная к крови) — является барьером, отделяющим кровь от субэндотелиальной ткани. В отличие от фибробластов и гладкомышечных клеток эндотелий представляет собой монослой, проявляет характерное контактное торможение, осуществляет межклеточные контакты и не является пассивной структурой [Хэм А., Кормак Д., 1983]. Основная часть сосудистых эндотелиальных клеток находится в микрососудах, главным образом, в капиллярах.

Эндотелиальные клетки сосудов различных органов и тканей не идентичны и различаются по структуре или функции [Jaffe Е.А., 1984]. Эндотелиальные обладают преимущественно плотными соединениями между клетками, в то время как в костном мозге подобные соединения отсутствуют. В легких клетки эндотелия отличаются от других сосудистых систем тем, что способны метаболизировать циркулирующие в кровяном русле пептиды. Эндотелиальные клетки посткапиллярных венул активно отвечают на циркулирующие в крови вещества повышением проницаемости сосудов. В то время как клетки эндотелия капилляров и артериол этой способностью не обладают, они имеют непосредственное отношение к воспалительной реакции [Thorgeirsson G., & Robertson A.L., 1986]. Артериолы осуществляют переход клеток из крови в область воспаления, а венулы принимают участие в контроле направленного из сосудов потока жидкости, медиаторов, комплемента и антител. Кроме того, венулы осуществляют прохождение клеток иммунной системы непосредственно в зону внедрения патогена или другого чужеродного агента.

В клетках эндотелия содержатся миозиновые и актиновые микрофиламенты. Они способны играть определенную роль в движении, поддержании формы, прикреплении к субстрату и обеспечении стабильности межклеточных соединений [Хэм А., Кормак Д., 1983; Furchgot R.F. et al., 1984]. Сравнительно недавно было установлено, что эндотелиальные клетки способны к сокращению (подобно гладкой мускулатуре) под действием таких веществ, как брадикинин и гистамин. Гистамин синтезируется тучными клетками, расположенными хаотично в субэндотелиальной ткани [Дейл М.М., Форман ДЖ.К., 1998].

Эндотелиальные клетки сосудов экспрессируют на своей поверхности различные аллоантигены, такие как антигены группы крови (ABO), антигены HLA класса I, рецепторы к гистамину, IL-1, ацетилхолину, тромбину, веществу Р, фактору некроза опухолей, и молекулы адгезии. При вирусной инфекции на них могут появляться Fe и СЗ рецепторы [Bevilacqua М.Р. et al., 1985; Me Intyre T.M. et al., 1987].

Установлено, что эндотелиальные клетки осуществляют синтез колониестимулирующего фактора (GSF), который усиливает антитело и комплементзависимую цитотоксичности, и GM — KSF, являющийся фактором хемотаксиса нейтрофилов и макрофагов. Они могут синтезировать и секретировать ростовой фактор тромбоцитов, а также ростовые факторы, влияющие на гладкомышечные клетки и фибробласты. Эндотелиальные клетки, подобно макрофагам и дендритным клеткам, экспрессируют DR-антигены и секретируют IL-1, и способны замещать макрофаги в представлении антигена Т-клеткам [Дейл М.М., Форман ДЖ.К., 1998].

С помощью культуральных методов исследования было установлено, что адгезия лейкоцитов крови к эндотелиальным клеткам посткапиллярных венул, одно из ранних событий воспаления, является предпосылкой для клеточной миграции [Schleimer R.P., & Rultedge В.К., 1986].

Таким образом, сосудистый эндотелий активно участвует в физиологических и патологических процессах, играет значительную роль в регуляции гемостаза, а взаимодействие клеток эндотелия с лейкоцитами играет основную роль при воспалительных и иммунных реакциях.

На сегодня является очевидным, что иммунная система принимает активное участие в развитии у больных алкоголизмом сердечно-сосудистых заболеваний [Константинов В.В., 1998; Кошкин И. В., Букач Т. А., 2001; Мартынов М. Ю. и др., 2011; Imhof A., Koenig W., 2003; Goldberg R. et al., 1995].

Показано, что хроническая алкогольная интоксикация способствует возникновению и развитию ишемической болезни сердца [Constant J., 1997; Sacco R.L. et al., 1999] и, наконец, приводит к атеросклерозу сосудов головного мозга [Ross R., 1993].

Иммунная система, как и другие системы высших позвоночных (нервная, эндокринная, выделительная), призвана обеспечивать наилучшую приспособляемость организма к условиям внешней среды [Хаитов P.M., 2006]. Если формализовать признаки, характерные для этих основных систем, то окажется, что иммунная система более всего напоминает нервную систему, к тому же известно, что нервная и иммунная системы происходят из одного зародышевого листка [Хэм А., Кормак Д., 1983]. Они могут распознавать «свое» и «чужое», способствуя, таким образом, самоидентификации организма в окружающей среде. Обе эти системы реагируют на внешние воздействия с исключительно высокой специфичностью. На сегодняшний день существуют неопровержимые доказательства того, что центральная нервная система (ЦНС) и иммунная система имеют некоторые общие черты в функционировании, а именнотолько они способны распознавать и запоминать объект, обладают памятью [Brostoff J. et al., 1991]. Помимо сходства, имеются и различия, главным из которых является способность клеток иммунной системы действовать в автономном режиме, что абсолютно исключено для клеток нервной системы.

Взаимодействие между иммунной и центральной нервной системой осуществляется с помощью растворимых медиаторов. На лимфоцитах крови человека обнаружены рецепторы к нейромедиаторам ацетилхолину, дофамину, энкефалину и эндорфину [Быкова А.А., Сединина Н. С., 2002; Tupala Е., Tiihonen J., 2004].

В нормальных условиях развитие иммунного ответа в мозге практически невозможно, так как мозг изолирован от иммунной системы. Это обусловлено отсутствием лимфатического дренирования мозга, низкой экспрессией DRантигенов, наличием гематоэнцефалического барьера, в мозгу практически отсутствуют дендритные клетки, Ти B-лимфоциты. Там мало антигенпредставляющих клеток, но при некоторых условиях они появляются. К ним относятся дендритные клетки, которые мигрируют из сосудов и тканей организма. Для них характерен высокий уровень экспрессии HLA I и II классов и костимулирующих молекул [Weber F. et al., 1994].

Иммунная система ЦНС представляет собой хорошо развитую фагоцитарную систему, в состав которой входят глиальные клетки, микроглия, астроглия и клетки эндотелия сосудов [Barron K.D., 1995; Hickey W.F., 1991; Norton W.L. et al., 1992; Sedgwick J.D., Hickey W.F., 1997].

Сравнительно недавно появились данные, что при активации микроглия начинает продуцировать цитокины, а именно: IL-1, IL-6, TNF-a, IFN-y и IL-12, последнему отводится важная роль в синтезе цитокинов Thlпрофиля — IFN-y, TNF-a и IL-2 [Ashkenazy A., Dixit V.M., 1998]. Микроглия, кроме того, является основным продуцентом компонентов комплемента. Однако комплементзависимому лизису клетки мозга человека не подвергаются, так как на них экспрессирован ингибитор комплемента — белок CD59 [Xiao B-G., Link H., 1998].

Следующими важными клетками мозга являются клетки астроглииастроциты. Они являются частью гематоэнцефалического барьера, медленнее реагируют на стимулирующие воздействия, чем клетки микроглии. Астроциты способны представлять антиген, секретировать цитокины, могут выступать в качестве предшественников дендритоподобных клеток, обладают способностью понижать функциональную активность цитотоксических Т-лимфоцитов, снижая таким образом их цитотоксический эффект в участках воспаления мозговой ткани [Williams К. et al., 1996]. В 1994 году S. Bahram et al. установили, что астроциты способны секретировать цитокины (GM-KSF, М-KSF) и ряд биологических факторов, обладающих нейротропными свойствами: фактор роста нейронов (NGF), фактор роста фибробластов (FGF), главный фактор роста (GDGF), инсулиноподобный фактор роста — 1 (IGF 1), цилиарный нейротропный фактор (CNTF) и др. [Fischer H.G. et al., 1999].

Исходя из вышесказанного, можно заключить, что ЦНС не является индифферетной системой, при иммунных нарушениях она сама способна подключаться к иммунному ответу, включая те резервы и механизмы, которые в ней заложены.

Роль алкоголя, как химического регулятора деятельности ЦНС и ее физиологических функций, известна давно. Установлено, что алкогольная интоксикация депрессивно влияет на функционирование головного мозга [Анохина И.П., 2011; Огурцов П. П., 2011; Сиволап Ю. П., 2006; Цыган В. Н. и др., 2008].

Следующий орган, который наиболее часто подвержен отрицательному влиянию этанола — печень. Важнейшую роль в воспалительных процессах печени при алкоголизме играет алкогольная интоксикация. Давно доказано, что печень является жизненно важным органом и играет существенную роль в функции врожденного иммунитета, которая обеспечивает защиту организма от патогена [Хаитов Р. М., 2005]. В эмбриональном периоде она является кроветворным органом и главным источником стволовых клеток крови. При некоторых патологических состояниях, например, при лейкозах, в печени возникают очаги экстрамедуллярного гемопоэза [Морозов И.А., 2002]. Основными клетками печени являются гепатоциты, которые окисляют от 60% до 80% этанола в ацетальдегид [Проскурякова Т.В., 2008].

Показано, что гепатоциты слабо экспрессируют молекулы HLA класса I, на здоровой печени отсутствуют молекулы HLA класса II, однако они появляются при ее заболевании [Хаитов P.M., 2005]. Популяционный состав лимфоцитов печени (от общего количества лимфоцитов печени) представлен: В-лимфоцитами (не более 5%), незрелыми Та,(3-лимфоцитами (20%), Ту, 5-лимфоцитами (приблизительно 3%, распознают антиген без предварительных процессинга и презентации), NK-клетками (20%) и лимфоцитами, сочетающими в себе признаки Ти NK-клеток (50%). Помимо лимфоцитов, иммунная система печени включает и пространства Диссе.

Макрофагами печени являются Купферовские клетки [Bautista А.Р., 2002]. Они составляют 15% от общего числа клеток печени и 80% от всех макрофагов организма. Известно, что печень синтезирует белки системы комплемента (в том числе Cl), белки острой фазы воспаления (С-реактивный белок, маннозосвязывающий лектин) и является источником кининогенов [Манько В.М., Девришов Д. А., 2011; Хаитов P.M. и др., 2010].

Таким образом, клетки печени занимают значительное место в гомеостазе, а их взаимодействие с клетками иммунной системы имеет фундаментальное значение при воспалительных и иммунных реакциях.

Наблюдения последних лет свидетельствуют о том, что практически в 100% случаев у больных с алкогольной зависимостью регистрируется патология печени, а именно: гепатиты и циррозы [Огурцов П.П. и др., 2011; Leevi C.B. et al., 2005].

В настоящее время существует точка зрения, что у лиц, злоупотребляющих алкоголем, иммунологические реакции играют ключевую роль в патогенезе хронической болезни печени, проявляющейся жировой дистрофией, гиалиновым некрозом и циррозом [Brown L.A. et al., 2006; Neuberger J. et al., 1984]. Как показали гистологические исследования, при алкогольном гепатите у больных наблюдается гибель гепатоцитов, сопровождающаяся острым воспалением и инфильтрацией печени иммунными лимфоцитами. На основание этих исследований авторы сделали заключение об аутоиммунной природе заболевания печени. Кроме того, ими были выделены цитотоксические антитела к детерминантам печеночных клеток кроликов, которым в течение 7 дней вводили этанол в суточной дозе 1 г/кг.

Серия исследований, проведенных с целью выявления цитотоксических антител (аутоантител) к гепатоцитам у больных с различными поражениями печени алкогольного генеза, показала их наличие у этих пациентов. У больных с жировой дистрофией печени (с фиброзом и без него) аутоантитела выявлялись у 39%, при алкогольном гепатите — у 46%, с алкогольным циррозом печени без алкогольного гепатита — у 42%, на фоне гепатита — у 50% и у 60% больных алкогольным циррозом и гепатитом. Авторы пришли к единому заключению, что в процессе длительной алкогольной интоксикации в мембранах гепатоцитов происходят антигенные изменения, которые запускают иммунные реакции, повреждающие печеночную ткань [Brown L.A. et al., 2006; Leevi C.B. et al., 2005].

Leevy C.B. и Elbeshbeshy H.A. в 2005 году подтвердили появление аутоантител к белкам печени у пациентов с различными поражениями печени алкогольного генеза. Эти исследователи указали на то, что важную роль в повреждении гепатоцитов играет также цитотоксическая активность нейтрофилов, лимфоцитов и NK-клеток, которые непосредственно участвуют в возникновении фиброза печени и образовании иммунных комплексов, обладающих цитотоксической активностью.

Немаловажная роль в патогенезе поражения печени алкогольного генеза отводится хемокинам, привлекающие лейкоциты, индуцирующие фиброгенез и апоптоз клеток печени [Aloman С. et al., 2007]. Установлено, что тельца Мал ори индуцируют как клеточные, так и гуморальные иммунологические реакции, способствующие переходу алкогольного гепатита в алкогольный цирроз печени. Приведенные данные не исключают вторичной роли этанолспецифических антител при алкогольном повреждении печени, но они свидетельствуют о постепенном процессе нарастания синтеза этих антител при продолжении употребления алкоголя и объясняют прогрессирующее повреждение печени у некоторых пациентов после прекращения его приема.

Следующим органом, который страдает от чрезмерного употребления алкоголя, являются почки [Огурцов П.П. и др., 2011; Тарасова Н. С., Белобородова Е. И., 2003]. Они осуществляют функцию выделения избытка воды и продуктов обмена, особенно тех, которые возникают в результате обмена белков. Через почки каждую минуту протекает более одной пятой всей крови.

Почки, в прямом смысле, не являются иммунокомпетентным органом, но в силу того, что в них находится развитая сеть кровеносных сосудов, они могут быть подвержены действию иммунных комплексов и их отложению, что может обусловить в дальнейшем развитие болезни иммунных комплексов и привести к развитию аутоиммунных процессов в них. Сравнительно недавно было установлено, что мезангеальные клетки почек выполняют функцию антигенпредставляющих клеток (макрофагов) и тем самым могут участвовать в иммунном ответе.

Показано, что на клетках эпителия канальцев почек слабо выражена экспрессия молекулы HLA I класса и отсутствует молекула HLA II, но при воспалениях почек усиливается экспрессия молекул HLA I и появляются молекулы HLA II классов, что способствует развитию аутоиммунных процессов в них. Однако существует и иное мнение, что причиной возникновения гломерулонефрита является чрезмерное употребление алкоголя, т. е. алкогольная интоксикация. В последнее время появились данные, указывающие на то, что злоупотребление алкоголем может приводить к поражению почек, проявляющемуся клиническими симптомами хронического пиелонефрита и гломерулонефрита. Патогенез такого поражения, как полагают исследователи, может быть связан с накоплением в организме циркулирующих иммунных комплексов [Тарасова Н.С., Белобородова Е. И., 1998]. В состав которых входят, в частности, IgM, IgA и ДНК-антитела, а также с дисфункцией ферментативных систем клеток фагоцитарной системы [Тарасова Н.С., Белобородова Е. И., 2003; Цыган В. Н. и др., 2008].

Чрезмерное употребление алкоголя является фактором риска поражения и органа зрения. К такому выводу пришли Дьяконова Т. В. и Петрунина A.M. (2001), которые установили, что у больных алкоголизмом нередко выявляются нарушения со стороны зрительных нервов и дегенеративные изменения сетчатки. Эти нарушения сопровождаются расстройствами, как общего, так и локального иммунитета глаз.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что алкогольная интоксикация негативно влияет на все органы и системы, принося вред здоровью человека.

5. Алкогольная интоксикация и клеточный иммунитет.

Важной составной частью иммунологической реактивности организма является опосредованный клетками иммунный ответ, реализацию которого осуществляют имму некомпетентные клетки, а именно: антигенпредставляющие клетки (макрофаги, дендритные клети лимфатических узлов, селезенки и других тканей, клетки Лангерганса, эпидермиса и т. д.), Ти B-лимфоциты и NK-клетки.

Лимфоциты осуществляют регуляторную и эффекторную функцию. Они отвечают за специфичность действия иммунной системы, а также за сохранение иммунологической памяти [Sprent J., 1994]. Лимфоциты участвуют в хронических воспалительных реакциях и в резистентности организма к облигатным и факультативным микроорганизмам, к злокачественным новообразованиям, а также в отторжении органных и тканевых трансплантатов [Хаитов P.M. и др., 2010; Ярилин A.A., 2010].

С помощью специализированных популяций лимфоцитов организм способен различать «свое» и «чужое», распознавать чужеродные антигены, продуцировать антитела, а также осуществлять специфически направленные цитотоксические реакции [Гущин И.С., 1998; Пинегин Б. В., 1995; Соколов Е. И., 1998; Хаитов P.M., 2010; Ярилин A.A., 2010].

Помимо участия в клеточно-опосредованном иммунитете, субпопуляции Т-клеток играют важную роль в регуляции иммунного ответа и помогают реагировать на антиген В-лимфоцитам при гуморальном иммунном ответе [Фонталин Л.Н., 1998; Tseng S.Y., Dustin M.L., 2002].

Т-лимфоциты содержат Ig-подобный интегральный мембранный гликопротеин — рецептор Т-лимфоцитов (TCR) строго одной специфичности [Res P., Spits Н., 1999]. По экспрессии маркерных антигенов Т-клетки подразделяют на CD4+ и CD8+ (короткоживущие и быстро обновляющиеся) Т-лимфоциты.

Т-клетки с мембранным маркером CD4+ подразделяются на регуляторные (Т-хелперы, или ТЬ2-хелперы) и эффекторные (Thl-хелперы, или Т-ГЗТ). Т-хелперы Th2 при взаимодействии с антиген-представляющими клетками распознают антиген, при взаимодействии с В-лимфоцитами индуцируют гуморальный иммунный ответ, Thl при взаимодействии с макрофагами и цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) — клеточный иммунный ответ. Т-ГЗТ (Т-эффекторы реакций гиперчувствительности замедленного типа) опосредуют реакции замедленного типа [Abbas A.K. et al., 2001; ].

Т-лимфоциты с мембранным маркером CD8+ также подразделяются на регуляторные и эффекторные, цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ). Регуляторные CD8± Т-клетки регулируют интенсивность иммунного ответа, подавляя активность CD4+ - клеток. Эффекторные цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+57+ Т-киллеры) уничтожают клетки-мишени с чужеродным антигеном или измененные собственные антигены, такие как аутоантигены (клетки опухолей) и аллотрансплантаты [Хаитов P.M., 2007; Ярилин A.A., 2010].

Среди Т-лимфоцитов выделяют долгоживущие рециркулирующие малые лимфоциты — Т-клетки памяти (в их популяцию входят как CD4+, так и CD8+ лимфоциты). Они экспрессируют на своей поверхности CD45RO молекулу и находятся не в фазе покоя, как «наивные» малые лимфоциты с экспрессией CD45RA молекулы, а в фазе Gl. Т-клетки памяти образуются при первичной встрече с антигеном, «запоминают» особенности его детерминант, при повторном воздействии на него развивают быстрый и повышенный ответ. Т-клетки памяти экспрессируют на своей поверхности больше мембранных молекул, чем «наивные» малые Т-лимфоциты. Клетки памяти отличаются от «наивных» Т-лимфоцитов меньшей потребностью в медиаторах воспаления и наличием корецепторных сигналов для развития эффекторной фазы иммунного ответа [Хаитов P.M. и др., 2010; Ярилин A.A., 2010; Sprent J. Т., 1994].

B-лимфоциты (CD19, CD20) — короткоживущие (не более 10 дней), оседлые клетки, ответственные за гуморальный иммунный ответ. На их мембране находится антигенный рецептор — мономер IgM (BCR). В популяцию B-лимфоцитов входят антигенпредставляющие клетки, которые экспрессируют HLA-DR молекулы и могут участвовать в презентации антигена Т-лимфоцитам, заменяя тем самым макрофаги и дендритные клетки. Следующими популяциями B-лимфоцитов являются эффекторные клеткиактивированные клетки, которые размножаются и дифференцируются в плазматические клетки, вырабатывают антитела всех известных классов, не имеют поверхностных Ig, не экспрессируют HLA-DR и B-клетки памятидолгоживущие рециркулирующие малые лимфоциты, которые не превращаются в плазматические клетки и сохраняют «память» об антигене [Sprent J.T., 1994].

Еще одной популяцией лимфоцитов, которая участвует в эффекторных механизмах иммунного ответа, являются NK-клетки (CD56+). Эффекторная функция NK — это их цитотоксичность и продукция цитокинов (IFN-y, TNF-a, GM-CSF, IL-5, IL-8). У них отсутствуют рецепторы, кодируемые перестроенной ДНК, но есть особые рецепторы, распознающие антигены HLA класса Iрецепторы, не активирующие, а ингибирующие киллерную функцию, NK-рецепторы к IL-2, к IFN-y и иммунорецепторы Fc-yR. Характерной особенностью NK-клеток является отсутствие поверхностных CD — маркеров и TCR -, BCR-рецепторов, присущих Ти В-лимфоцитам. NK-клеткам отводится важная роль в механизмах врожденного иммунитета, кроме того, они уничтожают инфицированные вирусами и опухолевые клетки [Кадагидзе З.Г., 1996; Манько В. М., Девришов Д. А., 2011; Ярилин A.A., 2010].

Важная роль в механизмах врожденного иммунитета, кроме NK-клеток, принадлежит «профессиональным» фагоцитам (полинуклеарам), которых у млекопитающих два типа — нейтрофилы и макрофаги. Созревание их происходит в костном мозге из стволовых кроветворных клеток, они имеют общую промежуточную клетку-предшественника. Полинуклеарные клетки очень подвижны и первыми из лейкоцитов появляются в зоне воспаления.

Нейтрофилы составляют 60% от всех лейкоцитов крови человека. Появляются в зоне воспаления на ранней стадии реакции. Нейтрофилы не способны к делению, являются секретирующими клетками, выделяющими содержимое своих гранул в ответ на различные стимулы, генерируют метаболиты Ог, которые при избытке могут повреждать ткани, способны расщеплять компоненты комплемента и запускать кининовый каскад. Активированные нейтрофилы могут участвовать в повышенной проницаемости сосудов и увеличении отека, являются продуцентами хемотаксинов (лейкотриена В4 и фактора активации тромбоцитов). На них обнаружены Fc-рецепторы для Fc-фрагмента IgG, при активации появляются рецепторы для СЗЬкомпонента комплемента. Нейтрофилы экспрессируют на своей поверхности молекулу HLA класса I, на них отсутствует молекула HLA класса II [Хаитов P.M. и др., 2010].

Моноциты — промежуточная форма, в норме они составляют 5−10% от общего числа лейкоцитов крови. Появляются в зоне воспаления на поздней стадии реакции, многими часами позднее нейтрофилов. Моноциты секретируют лизосомальные ферментыкомпоненты комплементапростагландинытканевой фактор, запускающий каскад свертывания кровиIFN-aфактор, стимулирующий фибробластыIL-1 и т. д. Они являются антигенпредставляющими клетками (АПК), обеспечивая тем самым Ти В-клеточный ответ. Основное их предназначение — стать оседлыми макрофагами в тканях [Манько В.М., Девришов Д. А., 2011; Хаитов P.M. и др., 2010].

Немаловажную и, пожалуй, основную роль в регуляции иммунного ответа играют антигены главного комплекса гистосовместимости HLA (Human leucocyte antigens) — HLA I и II классов. Они осуществляют такие важнейшие физиологические функции, как взаимодействие всех иммунокомпетентных клеток организма, участвует в распознавании своих и чужеродных клеток, в запуске и реализации иммунного ответа. Антиген-распознающие молекулы Т-лимфоцитов способны «увидеть» и связать антиген только в комплексе с молекулами HLA класса I (ко-рецепторные молекулы CD8 Т-лимфоцитов) или HLA класса II (ко-рецепторные молекулы CD4 Т-клеток), в том числе и на поверхности клеток своего организма [Хаитов P.M., 2001; Ярилин A.A., 2010]. Система HLA осуществляет генетический контроль качества иммунного ответа и участвует в механизмах апоптоза различных типов АПК. И, в целом, обеспечивает выживание человека как вида в условиях экзогенной и эндогенной агрессии [Алексеев Л.П. и др., 2000; Roelen D. et al., 2000].

В 1991 году Cook R.T. et al. исследовали количество клеток CD4+, CD8+, CD19+, CD56+ и количество клеток экспрессирующих молекулу HLA-DR, у алкоголиков до интоксикации алкоголем и в состоянии абстинентного синдрома (4−10-е сутки после прекращения приема алкоголя), а также в контрольной группе. Они установили, что у лиц, злоупотребляющих алкоголем, увеличено количество СБ8±клеток, в то время как количество клеток с маркерами CD4+, CD19+, CD56+ снижено. Существенных изменений в количестве клеток, несущих CD25 и HLA-DR, у лиц, злоупотребляющих алкоголем, по сравнению с непьющими лицами выявлено не было. Таким образом, эти авторы заключили, что увеличение количества CD8+ клеток является маркером алкогольной интоксикации.

В более поздних работах было показано, что у больных алкоголизмом наблюдаются множественные нарушения клеточного иммунитета. Так, Brown L.A. et al. (2006) отметили, что у лиц, злоупотребляющих алкоголем, наблюдается снижение кожной реактивности (гиперчувствительности замедленного типа) на туберкулин и антигены грибов. Наиболее существенные изменения происходят в Т-клеточном звене иммунитета. Наблюдается снижение количества CD4+ Т-хелперов, в то время как количество CD8+ лимфоцитов соответствует норме, что приводит к снижению отношения CD4 /CD8, снижается и количество CD 19 B-лимфоцитов. Авторы резюмируют: изменения функциональных и морфологических характеристик Ти B-клеток являются основой для возникновения нарушения процессов их взаимодействия, что может служить причиной неадекватной продукции иммуноглобулинов и других дефектов иммунной регуляции у больных алкоголизмом.

Клинико-иммунологические исследования больных с алкогольной зависимостью показали, что чрезмерное употребление алкоголя является фактором повышенного риска возникновения алкогольного поражения внутренних органов и систем. Enoch М.А. и Goldman D. (2001) при исследовании биопсийного материала печени больных алкоголизмом с циррозом печени и лиц, не употребляющих алкоголь, установили, что сильным раздражающим фактором для эпителия печени является усиление на гепатоцитах печени экспрессии HLA класса I. В печени появляется большое количество клеток CD56+ и в меньшей степени CD29+клеток и клеток, несущих рецептор к IL-4 и TGF-?. На клетках печени при алкогольной нагрузке, как утверждают авторы, не экспрессируются молекулы HLA DR, DP и DQ и рецепторы к IFN-y.

Большая серия работ в области онкологии при алкогольном заболевании посвящена изучению показателей иммунного статуса. Авторы этих работ считают, что нарушения иммунитета играют основополагающую роль в исходе онкологических заболеваний [Anderson L.M., 1992; Doll R. et al., 1999; Feigelson H. et al., 2001; Friedenreich C. et al., 1993; Seitz H.K. et al., 1998; 2001; 2003; Visapaa J.P. et al., 2004]. Daniluk J. et al. (1997) исследовали периферическую кровь (гематологические показатели, Т-, В-лимфоциты, субпопуляции CD4+, CD8+, CD3″ 56+ NK-клетки, активированные Т-клетки HLA-DR) лиц, злоупотребляющих алкоголем, находящихся в хирургическом отделении с доброкачественными опухолями. Было установлено, что у пациентов с доброкачественными опухолями снижено количество лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, CD4+ Т-лимфоцитов, CD19+ B-лимфоцитов и снижено отношение CD4+/CD8+ клеток и клеток с экспрессией молекулы HLA-DR, в то время как количество CD8+ и NK — клеток соответствовало нормальным значениям. Авторы пришли к заключению, что чрезмерное употребление алкоголя снижает резистентность организма, что является причиной возникновения как доброкачественных, так и злокачественных новообразований.

Имеются работы, в которых утверждается, что у больных стеатозом или лиц, недавно употребивших алкоголь, активность NK-клеток может быть повышена. Активность NK-клеток у больных алкоголизмом повышается, несмотря на такие факторы как курение и недостаточное питание, которые, как правило, угнетают активность NK-клеток. Однако у больных с алкогольным поражением печени число и активность NK-клеток значительно снижены [Cook R.T., 1998]. Число и функциональная активность NK-клеток у больных алкоголизмом без поражения печени не отличаются от нормы при условии воздержания от приема алкоголя в течение двух недель и более [Ishimuru Н., 2000].

Одним из факторов реализации механизмов адаптации организма к воздействию различных стрессорных факторов, включая хроническую интоксикацию алкоголем, является апоптоз. Этанол усиливает апоптотическую нейродегенерацию в мозге эмбрионов крыс и в гепатоцитах взрослых особей [Ikonomidou С. et al., 2000]. Моноциты здоровых людей после приема ими алкоголя проявляют признаки апоптотической смерти, как и нейроны от больных алкоголизмом [Singhai P.C. et al., 1999; Freund G., 1994]. Усиление апоптоза макрофагов под действием этанола отчасти связано с усилением синтеза TNF-? [Singhai P.C. et al., 1999], тогда как усиление апоптоза в клетках печени, кишечника и миокарда связано, в частности, с повышением содержания проапоптотических факторов, таких как рецептор 1 TNF-a и Fas-лиганды [Rodriguez D.A. et al., 2004]. Молекулярные механизмы усиления апоптоза в нейронах связаны с активацией Вах-зависимой каспазы-3 и не зависят от экспрессии р53 или дефицита проапоптотических факторов семейства Вс1−2 (Bid или Bad) [Nowoslavski L. et al., 2005]. Алкоголь вызывает также усиление спонтанного апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов, однако в процессе купирования алкогольного абстинентного синдрома активируются механизмы, контролирующие процессы программируемой клеточной смерти, в результате чего индекс реализации апоптоза значительно снижается [Иванова С.А., Бохан H.A., 2006].

Особую роль в реализации механизмов врожденного иммунитета играют полиморфноядерные лейкоциты. Как свидетельствуют данные литературы, у лиц, злоупотребляющих алкоголем, число нейтрофилов в крови часто возрастает, особенно при алкогольном гепатите [Cook R.T., 1998]. Гистологические исследования биопсийного материала больных алкогольным гепатитом и циррозом выявили инфильтрацию печени нейтрофилами. Авторы высказывают предположение, что у лиц, злоупотребляющих алкоголем, повреждение ткани печени связано с притоком к ней нейтрофилов (которые, в свою очередь, выделяют мощные ферменты, повреждающие ткань).

Имеются работы, авторы которых отмечают, что у некоторых больных алкоголизмом на поздних стадиях заболевания наблюдается, напротив, существенное снижение числа нейтрофилов в крови. Это связано, как утверждают авторы, с угнетением костного мозга (местом созревания нейтрофилов), что вносит дополнительный вклад в формирование иммуносупрессии [Bukara М. et al., 2000; Latif О. et al., 2002].

Cook R.T. (1998) приводит данные, указывающие на то, что у больных алкоголизмом снижена миграция нейтрофилов в область воспаления. Это обусловлено, как отмечает автор, ослаблением хемотаксиса, уменьшением способности прилипать к стенкам сосудов, снижением фагоцитарной активности и внутриклеточного киллинга бактерий, что отчасти объясняет снижение у больных алкоголизмом способности локализовать инфекцию, особенно если она вызвана инкапсулированными микроорганизмами.

Таким образом, несмотря на противоречивость результатов исследований, их авторы приходят к единому мнению о том, что алкогольная зависимость сопровождается серьезными изменениями и нарушениями клеточного звена иммунной системы, которые приводят к возникновению вторичного иммунодефицитного состояния у этого контингента больных. б. Алкогольная интоксикация и гуморальный иммунитет.

Немаловажная роль в развитии иммунного ответа принадлежит гуморальному иммунитету. Важнейшим гуморальным фактором защиты являются иммуноглобулины, которые выделяются при воспалении активированными плазматическими клетками — IgA, IgG, IgM и IgE. Существующие литературные данные о роли иммуноглобулинов в иммунном ответе при алкогольной зависимости немногочисленны и достаточно противоречивы.

При исследовании сыворотки крови больных с алкогольной зависимостью было выявлено повышение титров иммуноглобулинов IgA, IgG и IgM по сравнению с непьющим контингентом. При этом повышение уровня IgA наблюдалось, как у больных алкоголизмом без поражения печени, так и у больных с алкогольным поражением печени, тогда как уровень IgG был повышен только у больных с алкогольным гепатитом. Повышение же титра IgM в крови наблюдалось только у больных с активным алкогольным гепатитом [Cook R.T., 1998].

Kreisel W. et al. в 1999 году, исходя из полученных результатов исследования, высказали противоположную точку зрения, что у больных алкоголизмом нет существенных различий в уровнях иммуноглобулинов классов А, G и М в сравнении с непьющим или малопьющим контингентом обследованных. При этом авторы считают, что изменения в иммуноглобулиновом статусе, как правило, связаны с наличием у пьющих разного рода инфекций.

У больных алкоголизмом часто обнаруживают отложения IgA в тканях, особенно в коже, печени и почках. Принято считать, что повышение уровня антител, относящихся к тому или иному классу иммуноглобулинов, связано с развитием специфического иммунитета (как, например, при успешной вакцинации или инфекции). Однако у больных с алкогольной зависимостью значительное повышение уровня иммуноглобулинов часто сочетается с Т-клеточным иммунодефицитом. Полагают, что отмеченное повышение уровня IgA является следствием нарушенной регуляции выработки антител и/или отражением аутоиммунных процессов. Это предположение было подкреплено фактами обнаружения аутоантител к большому ряду тканей и молекул. Показано, например, что хроническая алкогольная интоксикация сопровождается усиленной продукцией антител к антигенам головного мозга и печени [Гамалея Н.Б., 1990], к сывороточным антигенам, в частности, альбумину и нейромедиаторам [Гамалея Н.Б. и др., 1997], пищевым антигенам [Плецитый К.Д., Давыдова Т. В., 1989]. Следствием повышения уровня аутоантител может быть отмеченное возрастание у больных с алкогольной зависимостью концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) [Гамалея Н.Б., 1990]. Ведущим механизмом нарушения элиминации комплексов антиген-антитело периферической крови у больных с алкогольной зависимостью является снижение порога емкости нейтрофилов и эритроцитов к иммунным комплексам [Ветлугина Т.П., Бохан H.A., 2005]. У больных алкоголизмом был отмечен также важный факт — повышение уровня антител к белкам, измененным под действием реактогенного продукта метаболизма этанола в организме — ацетальдегида. Обнаружены, в частности, антитела к модифицированному ацетальдегидом гемоглобину [Worrall S. et al., 1990] и модифицированному альбумину [Гамалея Н.Б. и др., 2000].

7. Алкогольная интоксикация и медиаторы иммунитета.

Одним из наиболее важных достижений иммунологии является обнаружение обширной сети регуляторных молекул, названных цитокинами. Многие виды этих белков секретируются клетками иммунной системы, а изменение их соотношения оказывает выраженное влияние на функцию иммунных клеток. Многочисленными работами показано, что у больных с алкогольной зависимостью нарушен баланс прои противовоспалительных цитокинов [Daniluk J. et al., 2001; Gonzalez-Quintela A. et al., 2000; Laso F.J. et al., 2007; Szuster-Ciesielska A. et al., 2000]. Однако характер этого нарушения, как отмечают авторы вышеуказанных работ, зависит как от присутствия сопутствующего алкогольного цирроза печени, или панкреатита, так и от состояния пациента в момент исследования (прием алкоголя или воздержание). Gonzalez-Quintela A. et al. (2000) показали, что у больных с алкогольной зависимостью с циррозом печени при поступлении в стационар в состоянии острого абстинентного синдрома в сыворотке крови наблюдалось повышение уровней цитокинов: IL-6, IL-10 и IL-8, которые в течение недели нормализовались. Наличие у больных алкогольного цирроза печени в стадии компенсации характеризовалось повышением уровня IL-6 и снижением уровня IL-10 в сыворотке крови [Daniluk J. et al., 2001]. В стадии декомпенсированного алкогольного цирроза печени помимо повышенных концентраций IL-6 отмечалось повышение уровня фактора некроза опухолей (TNF-a) и IL-8. У больных алкоголизмом уровень IL-8 коррелировал с повышенной смертностью. TNF-a и IL-6 повышались в крови не только при алкогольном циррозе печени, но и в случае развития панкреатита [Szuster-Ciesielska A. et al., 2000]. Поскольку TNF-a токсичен для многих клеток организма, вызывая их апоптоз программируемую клеточную смерть), то его избыточная секреция вносит свой вклад в гибель клеток печени и других органов.

В экспериментах на мутантных мышах показано, что IL-6 защищает гепатоциты от апоптоза, вызванного этанолом и TNF-a, в результате индукции противоапоптотических белков [Hong F. et al., 2002].

В более поздних исследованиях в культурах моноцитов или дендритных клеток, выделенных из периферической крови больных алкоголизмом, было показано, что у пациентов без заболевания печени в отсутствие приема алкоголя наблюдается существенное повышение спонтанного синтеза провоспалительных цитокинов IL-1 бета, IL-6, IL-12, TNF-a [Laso F.J. et al., 2007]. Наоборот, у активно пьющих больных с алкогольным циррозом печени синтез провоспалительных цитокинов моноцитами и дендритными клетками (как спонтанный, так и стимулированный) резко снижен. Однако, у больных с циррозом печени при воздержании от приема алкоголя в течение продолжительного времени изменений в синтезе этих цитокинов не наблюдалось.

Нарушение баланса цитокинов играет важную роль в ослаблении иммунной защиты и при бактериальной пневмонии [Happel. et al., 2005]. У мышей, зараженных К. pneumoniae, алкоголь приводит к снижению в легких уровня важных для иммунной защиты провоспалительных цитокинов IL-12 и IFN-y и повышению уровня противовоспалительного цитокина IL-10. Хроническая алкогольная интоксикация вызывает также снижение в легких синтеза IL-17 в ответ на инфекцию К. pneumoniae [Nelson S., Kolles J.K., 2002; Pavia C.S. et al., 2004]. Этот недавно открытый цитокин является важным связующим звеном между приобретенным и врожденным иммунитетом в результате стимуляции нейтрофильного воспаления. Было высказано предположение [Cook R.T., 1998], что нарушения иммунитета, наблюдаемые при алкоголизме, связаны с изменением равновесия между активностью хелперных Thl и Th2 клеток. Реакции с участием Thl-клеток являются преимущественно клеточными и наиболее выражено стимулируются 1Ь-12 и №N-7, тогда как реакции с участием ТЬ2-клеток — преимущественно гуморальные (опосредованы антителами) и наиболее эффективно стимулируются ІЬ-4, 1Ь-5 и 1Ь-10. Становится все более очевидным, что сдвиг равновесия между двумя видами хелперных клеток в какую-либо одну сторону приводит к развитию иммунологического заболевания.

В опытах на мышах, иммунизированных Т-клеточными рецепторами, было показано, что этанол оказывает непосредственное влияние на антиген-презентирующие клетки, которые, в свою очередь, определяют, какой характер ответа (опосредованный ТЫ или ТЪ2) будет доминировать [Valtenbaugh С. еі аі., 1998].

Таким образом, можно заключить, что на сегодняшний день отсутствуют общая концепция влияния алкогольной интоксикации на иммунную систему и данные, характеризующие как больных алкоголизмом I и II стадии, так и лиц без синдрома зависимости от алкоголя, без сопутствующих патологий органов и систем организма.

Часть III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы и методы исследования.

1. Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro.

Биологическим материалом для проведения данного этапа исследований служила венозная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки «Vacutainer» с гепарином. В работе использовали цельную кровь и мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови, в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин «Gibco» d= 1,077 л г/см по общепринятой методике [Воут А., 1968]. Культуры лимфоцитов крови культивировали при 37° С в атмосфере с 5% С02 в полной питательной среде (ППС), в состав которой входила среда RPMI («Sigma Chemical Со», USA), ^ дополненная 10% фетальной телячьей сывороткой («Sigma Chemical Со», USA),.

2 mM L-глутамина («Gibco», USA), 20 mM HEPES-буфера («Gibco», USA) pH 7,4 и 10 мкг/мл гентамицина («Gibco» USA).

Изучалось прямое влияние широкого диапазона доз этанола (концентрации в культурах 6×10~5−6 мг/мл) на способность Т-лимфоцитов активировать синтез ДНКцитолитический эффект NK клетокэкспрессию на лимфоцитах активационных молекул CD25, HLA-DR, CD38 и экспрессию молекулы HLA I класса на клетках кровифункциональную активность фагоцитирующих клеток in vitro. Кроме того, изучали влияние различных концентраций этанола на фазу индуцибельного периода иммунного ответа Т-лимфоцитов человека (предварительное воздействие митогенными лектинами) in vitro. Для выполнения этих задач был выбран широкий диапазон доз этанола, включающий: критические дозы (6 мг/мл крови), дозы, вызывающие сильное.

1 2 (0,6×10″ ' мг/мл) или слабое опьянение (6×10″ мг/мл), и дозы, практически не влияющие на организм человека (6×10″ мг/мл и ниже). Выбор исследованных концентраций этанола соответствует дозам, охарактеризованным в России и ч.

США для здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, употребивших алкоголь в различных количествах [Прозоровский В.И. и др., 1967].

1.1. Метод изучения влияния этанола на пролиферативную активность Т-лимфоцитов и B-лимфоцитов на модели реакции бластной трансформации in vitro.

Биологическим материалом для исследований служила цельная периферическая кровь, взятая в пробирки с гепарином. Влияние этанола на пролиферативную активность Т-лимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) без или с применением митогенных лектинов РНА («Sigma», USA) в концентрации 5 мкг/мл и Con A («Sigma», USA) в концентрации 5 мкг/мл. Контролем служили культуры клеток крови без добавления этанола и культуры без этанола, но с добавлением митогенных лектинов. Постановку проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах («Nunc», Denmark) в нескольких вариантах. В первом варианте в лунки вносили 150 мкл ППС с различными концентрациями этанола (с конечными концентрациями этанола 6×10~5−6 мг/мл в эксперименте), затем вносили 50 мкл цельной крови, контролем служили культуры цельной крови без внесения этанола. Во втором варианте, в лунки вносили 150 мкл 1111С с различными концентрациями этанола, затем вносили 50 мкл цельной крови и митогенные лектины: РНА «Sigma» USA в концентрации 5 мкг/мл ППС или Con A («Sigma», USA) в концентрации 5 мкг/мл ППС. Контролем служили культуры цельной крови без добавления этанола и культуры без этанола, но с добавлением митогенных лектинов. В третьем варианте постановка была аналогична второму, с той лишь разницей, что этанол вносили в планшеты после 3-х часовой прединкубации культур при 37° С в атмосфере с 5% С02. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения о метилHi-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Для этого за 16 часов до окончания инкубации в планшеты вносили изотоп в конечной концентрации 1 мкК/мл. По завершению инкубации клетки осаждали на стекловолокнистом фильтре («Flow Lab», USA) с помощью полуавтоматического сборщика клеток Cell Harvester («Flow Lab», USA). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью (3,5 г. РРО и 0,05 г. РОРОР в 1 л толуола). Радиоактивность образцов измеряли на ?-счётчике («Wallac 1409 DSA», Finland). Результаты измерения выражали имп/мин (СРМ) и рассчитывали для каждой культуры, каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражались средними арифметическими значениями.

1.2. Метод изучения влияния этанола на цитолитическую активность NK-клеток на модели естественной цитолитической активности in vitro.

Биологическим материалом для исследований служили мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин «Gibco» d=l, 077 по общепринятой методике [Воут А., 1968]. Влияние этанола на цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro. Метод основан на способности NK-клеток in vitro лизировать клетки-мишени эритромиелоидной линии К-562 [М.П. Рычков, 1981]. Клетки-мишени (2×106 кл/мл) помещали в 24-луночные планшеты («Nunc», Denmark) метили метил- 3Н] - уридином и инкубировали при 37° С в атмосфере влажности с 5% ССЬ в течение одного часа. Затем клетки отмывали дважды питательной средой 199 с 2% фетальной телячьей сывороткой, доводили концентрацию клеток до 100 000 в 1 мл ППС. Концентрацию выделенных из клеток крови мононуклеаров (клетки эффекторы) доводили до 5×106 в 1 мл 1111С. Постановку цитолитического теста проводили в 96луночных круглодонных планшетах («Nunc», Denmark). В лунки вносили 50 мкл 111IC с конечными концентрациями этанола 6×10″ 5−6×10″ ' мг/мл в эксперименте, 50 мкл меченой культуры К-562 (10 000 клеток), 100 мкл суспензии выделенных мононуклеаров (5×106 клеток). Контролем служили культуры К-562 (10 000 клеток в 200 мкл ППС) без добавления этанола и с этанолом, а также смесь эффекторных клеток — мононуклеаров и культуры К-562 (10 000 клеток) без добавления этанола. Планшеты помещали на 18 часов в инкубатор при 37° С в атмосфере влажности с 5% С02. По завершении инкубации клетки осаждали на стекловолокнистом фильтре («Flow Lab», USA) с помощью полуавтоматического сборщика клеток Cell Harvester («Flow Lab», USA). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью (3,5 г. РРО и 0,05 г. РОРОР в 1 л толуола). Радиоактивность образцов измеряли на ?-счётчике («Wallac 1409 DSA», Finland). Результаты измерения выражались имп/мин (СРМ) в расчете на каждую культуру. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты выражали индексом цитотоксичности (ИЦ), который вычисляли по формуле: ИЦ = (1 — средние значения в опытных культурах: средние значения в контрольных культурах) х 100%.

1.3. Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул CD25, CD38, HLA-DR на лимфоцитах человека in vitro.

Биологическим материалом для исследования служила цельная кровь здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя, взятая в пробирки «Vacutainer» с гепарином. Постановку реакции проводили в 24-луночных планшетах («Nunc», Denmark). В лунки вносили 500 мкл ППС и этанол в соответствующих концентрациях (с конечными концентрациями этанола 6×105−6 мг/мл в эксперименте), после чего вносили 500 мкл цельной крови. Контролем служила кровь без добавления этанола. Культуры инкубировали в течение 18 часов при 37° С в атмосфере влажности с 5% С02. Обработку крови проводили согласно протоколу фирмы «Becton Dickinson», USA. 10 мкл цельной крови инкубировали с 2 мкл флуоресцентно-меченных двухцветных моноклональных антител в течение 20 минут при комнатной температуре. После чего в лунки добавляли 2 мл лизирующего раствора (8,26 г/л NH4CL и 1 г/л NaHCO?, pH 7,2), инкубировали 10 минут при комнатной температуре и центрифугировали 5 минут при 300g. Осадок отмывали раствором Cell Wash и центрифугировали 5 минут при 300g, осадок фиксировали раствором Cell Fix. Клетки анализировали не позднее 24 часов после фиксации. Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson», USA. Обработку материала проводили согласно протоколу фирмы «Becton Dickinson», USA. Экспрессию активационных молекул CD25, HLA-DR и CD38 определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных CD3+, CD4+, CD8± Т-лимфоцитов, CD19+ -B-лимфоцитов и CD3″ 16+56+ - NK-клеток, которую выражали в условных единицах, у.е. — MFI (mean fluorescence unit).

1.4. Метод изучения влияния этанола на экспрессию молекул HLA I класса на клетках крови in vitro.

Биологическим материалом для исследования служили мононуклеары, выделенные из крови здоровых лиц (как указано выше) без синдрома зависимости от алкоголя, взятой в пробирки «Vacutainer» с гепарином. Постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных планшетах («Nunc», Denmark), в которые вносили 100 мкл ППС с конечными концентрациями этанола 6><10″ 5 — 6×10″ ' мг/мл в эксперименте и 100 мкл выделенных мононуклеаров (2×106 в 1 мл ППС), контролем служила клеточная суспензия в ППС без добавления этанола. Культуры инкубировали 18 часов при 37° С в атмосфере влажности с 5% СОгОбработку клеточных культур проводили в планшетах. Планшеты центрифугировали 5 минут при 300g, надосадок убирали стряхиванием планшета, добавляли 240 мкл раствора.

Хенкса. В пластиковые пробирки, для проточной цитофлюориметрии («Falcon»), вносили по 10 мкл суспензии клеток, добавляли по 50 мкл немеченого антитела к антигену HLA класса I («Сорбент» Филатов A.A.), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Отмывали центрифугированием 5 минут при 300g, надосадок удаляли и добавляли 150 мкл раствора Хенкса, еще раз отмывали 5 минут при 300g, надосадок убирали. Добавляли 50 мкл вторичных антител (меченных ФИТЦ), инкубировали при комнатной температуре 30 минут. Центрифугировали 5 минут при 300g, осадок фиксировали раствором Cell Fix. Клетки анализировали не позднее 24 часов после фиксации. Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson», USA. Обработку материала проводили согласно протоколу фирмы «Becton Dickinson», USA. Экспрессию молекул HLA I класса определяли по интенсивности флуоресценции (у.е.) всех антиген-позитивных клеток крови (моноцитов, Ти B-лимфоцитов, нейтрофилов и NK-клеток).

1.5. Метод изучения влияния этанола на функциональную активность фагоцитирующих клеток крови in vitro.

В качестве источника фагоцитов использовали венозную кровь, взятую в пробирки «Vacutainer» с ЭДТА. Постановку проводили в стерильных пробирках («Nunc», Denmark) объемом 15 мл, в которые вносили по 500 мкл цельной крови. Затем добавляли этанол в конечных концентрациях 6xl0″ 5−6xl01 мг/мл в эксперименте. Контролем служила кровь без добавления этанола. Пробирки помещали на 18 часа в инкубатор и инкубировали при 37° С в атмосфере влажности с 5% С02. Затем эритроциты лизировали добавлением 15 мл лизирующего раствора (8,26 г/л NH4CL и 1 г/л NaHC03, pH 7,2) в течение 5 минут, затем центрифугировали 7 минут при 200g. Гемолизат удаляли, осевшие клетки ресуспендировали в 0,5 мл раствора Хенкса (без фенолового красного), дополненного 5 шМ глюкозы, 10 шМ HEPES-буфера и 1 мкМ люминола «Sigma Chemical Со», pH 7,2. Суспензию клеток по 50 мкл переносили в стеклянные пробирки и помещали в ячейки 36 канального хемилюминометра Люцифер Б, («Диалог», Москва) по 6 пробирок на один образец при 37° С. Результаты измерений регистрировались непрерывно в виде кинетической кривой. Интенсивность реакции оценивалась количественно по числу импульсов за 1 минуту (имп/мин) в расчете на каждую исследуемую пробу. Для активации хемилюминесцентной реакции нейтрофильных гранулоцитов использовали зимозан («Sigma Chemical Со», USA), опсонизированный по методике Зыкина В. Ю. и Годкова М. А. (2004), или раствор ФМА. В пробирки (по 3 на пробу) добавляли по 15 мкл зимозана (10 мг/мл) или ФМА (0,2 мг/мл) и регистрировали уровень хемилюминесценции в течение 30 минут. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивали по максимальному значению на кинетической кривой. Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяли по данным трех идентичных измерений. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции нейтрофилов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции нейтрофилов с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови): средние значения спонтанной хемилюминесценции нейтрофилов (имп/мин на 100 мкл крови).

2. Методы иммунологического обследования Материалы для исследования. В качестве биологического материала для иммунологических исследований использовали репрезентативную выборку образцов периферической крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью спустя 17−19 часов после употребления последней дозы крепкого алкоголя.

2.1. Характеристика обследованных групп.

Часть работы выполнена на базе ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. В работе представлены результаты иммунологического обследования 220 больных алкогольной зависимостью, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в наркологических клиниках и диспансерах города Москвы в период с 1994 по 2009 годы, а также 180 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.

Распределение обследованных лиц по полу и возрасту представлено в табл. 1.

Таблица 1. Распределение обследованных лиц по полу и возрасту, п=400.

Тендерный состав Средний возраст пациентов, лет Количество обследованных, %.

Мужчины, п=321 24−60 (45,5±8,8) 81.

Женщины, п=79 25−60 (40,9±9,8) 19.

В табл. 2 представлена возрастная и тендерная характеристика обследованных групп больных алкоголизмом и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя.

Таблица 2. Характеристика групп обследованных больных с алкогольной зависимостью и здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя (М±а).

Группы обследованных мужчины женщины Средний возраст (лет) Рост (см) Вес (кг).

1. Больные алкоголизмом I стадии п=79 58 (73%) 21 (27%) 43± 10 165−190 64−110.

2. Больные алкоголизмом II стадии п=72 60 (83%) 12 (17%) 43,3±9,6 167−189 63−105.

3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, п=69 60 (87%) 9(13%) 44,9±9,6 165−192 63−105.

4. Здоровые лица (контроль), п=90 73 (81%) 17(19%) 44±10 163−195 60−128.

5. Здоровые добровольцы после употребления крепкого алкоголя, п=90 70 (78%) 20 (22%) 44,2±9,2 164−198 60−135.

У больных алкоголизмом I стадии, вошедших в группу 1, длительность злоупотребления алкоголем варьировала от 1 года до 3,5 лет, средняя длительность хронической алкогольной интоксикации (ХАИ) составляла 2,3±0,8 лет. Значимых различий длительности ХАИ у мужчин и женщин выявлено не было. Состояние алкогольного абстинентного синдрома ни у одного из больных группы 1 не отмечено. Толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,4 л до 0,8 л (в среднем 0,6±0,2 л) и у женщин от 0,3 л до 0,6 л (в среднем 0,45±0,1 л) крепких алкогольных напитков в сутки (табл.3). Больные употребляли крепкий алкоголь в течение 1−2 дней до исследования в количестве 0,3−0,45 л, забор крови проводили спустя 17−19 час после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения им медикаментозного лечения.

Таблица 3. Характеристика обследованных пациентов по длительности злоупотребления алкоголем, толерантности к алкоголю и частоте запоев (М±а).

Группы пациентов Длительность хронической интоксикации алкоголем Толерантность к крепкому алкоголю (в литрах) Продолжительность запоев (дни) Частота запоев в год мужчины женщины.

1. Больные алкоголизмом I стадии, п=79 2,3±0,8 0,6±0,2 0,43±0,1 0 0.

2. Больные алкоголизмом II стадии, п=72 7,5±2,6 0,9±0,2 0,68±0,22 10−20 4−7.

3. Больные алкоголизмом II стадии, фаза ремиссии, п=69 В анамнезе 0 0.

8,1±2,0 0,5−1,2 0,4−1,1.

У больных алкоголизмом группы 2 длительность ХАИ варьировала от 6 до 10 лет (в среднем 7,5±2,6 лет). Алкогольный абстинентный синдром появился 4−6 лет назад. Частота появления ААС варьировала от 4 до 7 раз в год (табл. 3). Продолжительность запоев составляла 10−20 дней, толерантность к алкоголю варьировала у мужчин от 0,6 до 1,2 л (в среднем 0,9±0,2 л) и у женщин от 0,4 до 1 л (в среднем 0,68±0,22 л) крепких алкогольных напитков в сутки. Больные употребляли алкоголь в течение 1−2 дней до исследования в количестве 0,3−0,6 л крепкого алкоголя, забор крови проводили спустя 17−19 час после употребления больными последней дозы алкоголя до назначения им медикаментозного лечения.

В группу 3 вошли больные алкоголизмом II стадии в фазе ремиссии длительностью от 3 до 5 лет, в среднем 4,1 ±1,1 лет (табл. 2, 3).

В группу 4 — контрольную (группа сравнения, норма) вошли здоровые лица без синдрома зависимости от алкоголя. В группу 5 вошли здоровые добровольцы также без синдрома зависимости от алкоголя. В зависимости от дозы употребленного до исследования алкоголя группа 5 была разбита на 3 подгруппы (табл. 4). В подгруппу 1 вошли 27 практически не пьющих лиц, которые употребили 50 мл водки или 150 мл красного вина за 17−19 час до забора крови. В подгруппу 2 вошли 35 человек, употребивших 0,2−0,3 л крепкого алкоголя в течение дня до исследования, последний прием алкоголя был за 17−19 час до забора крови. В подгруппу 3 вошли 28 человек, употребивших 0,6−1 л крепкого алкоголя в течение 2−3 дней до исследования, последний приём был за 17−19 час до забора крови. Перед данным исследованием лица в подгруппе 3 не употребляли никакого алкоголя в течение 1,5−2 месяцев.

Таблица 4. Характеристика подгрупп обследованных здоровых добровольцев из группы 5, без синдрома зависимости от алкоголя, употребивших алкоголь накануне исследования.

Количество употреблённого алкоголя добровольцами мужчины женщины Возраст (лет) Рост (см) Вес (кг).

1 подгруппа: 50мл водки или 150мл вина, п=27 20 (74%) 7 (26%) 24−60 164—188 60−105.

2 подгруппа: 0,2−0,3 л водки, п=35 30 (86%) 5 (14%) 25−60 170−190 68−105.

3 подгруппа: 0,6−1 л крепкого алкоголя в течение 2−3 дней, п=28 24 (86%) 4 (14%) 28−60 170−190 70−135.

Все обследованные (100%) — лица трудоспособного возраста с одинаковым социальным статусом (высшее образование, хорошая среда обитания и материальный достаток, проживание в полноценных семьях), жители города Москвы и ближнего Подмосковья. Из числа обследованных были исключены лица с отягощённой наследственностью по соматическим, аллергическим, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям, а также страдающие туберкулезом, рецидивирующими герпетическими, цитомегаловирусными, хламидийными инфекциями, гепатитами В и С и ВИЧ-инфекцией.

Исследование проводилось в соответствии с требованиями Основ законодательства «Об охране здоровья граждан», у больных и здоровых лиц было получено информированное согласие на проведение обследования.

Всем здоровым лицам и больным алкоголизмом после употребления алкоголя проводили определение показателей иммунного статуса: клеточного и гуморального иммунитета.

Методы определения иммунного статуса.

Для исследования клеточного иммунитета определяли пролиферативную активность Т-лимфоцитов и B-лимфоцитов, цитолитическую активность NK-клеток, функциональную активность фагоцитов, популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов.

Для исследования гуморального иммунитета определяли содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, G и Е, гемолитическую активность комплемента СН50, содержание компонентов комплемента CI, СЗ и С4, С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-0 (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Цитокиновый статус изучали по уровню цитокинов — IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y — в сыворотке крови, а также по уровню продукции IFN-y при индукции клеток крови in vitro митогеном фитогемагглютинином (РНА).

Забор крови у здоровых проводили, рано утром, а у больных в момент поступления в клинику или в наркологический диспансер в пробирки с гепарином, ЭДТА и сухие без антикоагулянта с помощью системы «Vacutainer» («Becton Dickinson», USA). Для оценки иммунного статуса кровь использовали не позднее 6-и часов после забора.

2.2. Методы определения клеточного иммунитета.

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки «Vacutainer» с гепарином. В работе использовали мононуклеары, которые выделяли из гепаринизированной крови путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-верографин «Gibco» d= 1,077 г/см по общепринятой методике [Воуш А., 1968], как указано выше (методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro).

Всем обследуемым проводили клинический анализ крови с обязательным определением лейкоцитарной формулы.

2.2.1. Метод определения пролиферативной активности Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов.

Пролиферативную активность Ти Влимфоцитов определяли на модели реакции бластной трансформации (РБТЛ) с применением митогенных лектинов [Петров Р.В. и др., 1984], которая рассматривается как экспериментальная модель пролиферативной экспансии клеток, происходящей под влиянием антигенов in vivo. В работе использовали митогенный лектины: РНА («Sigma», USA) с конечной концентрацией 10 мкг в 1 мл полной питательной среды (ППС) — Con A («Sigma», USA) с конечной концентрацией 10 мкг в 1 мл ППСPWM («Sigma», USA) с конечной концентрацией 5 мкг в 1 мл ППС и LPS («Sigma», USA) с конечной концентрацией 0,5 мкг в 1 мл ППС. Контролем служили культуры без добавления митогенных стимуляторов. Суспензию 100.

ООО клеток в ОД мл ППС инкубировали в течение 72 часов в 96-луночных плоскодонных планшетах («Nunc», Denmark), при 37° С в атмосфере с 5% С02. Интенсивность пролиферативной реакции иммунокомпетентных клеток оценивали по активности синтеза ДНК, измеренной по скорости включения л метилHt — тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Для этого за 16 часов до окончания инкубации в планшеты вносили изотоп в конечной концентрации 1 мкК/мл. По завершению инкубации клетки осаждали на стекловолокнистом фильтре («Flow Lab», USA) с помощью полуавтоматического сборщика клеток («Cell Harvester», «Flow Lab», USA). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью (3,5 г. РРО и 0,05 г. РОРОР в 1 л толуола). Радиоактивность образцов измеряли на ?-счётчике «Wallac 1409 DSA» (Finland). Результаты измерения выражались имп/мин (СРМ) в расчете на каждую культуру клеток, каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты исследований выражали в виде средних арифметических значений и индекса стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения СРМ опытных культур: средние значения СРМ контрольных культур [Кондратьева H.A. и др., 2001].

2.2.2. Метод определения цитолитической активности NK-клеток.

Цитолитическую активность натуральных (естественных) киллеров (NK-клеток) периферической крови человека определяли на модели естественной цитолитической активности in vitro. Клетки-мишени лини К-562 (2×106 кл/мл).

— з помещали в 24-луночные планшеты («Nunc», Denmark), метили метилHiуридином и инкубировали при 37° С в атмосфере влажности с 5% С02 в течение одного часа. Затем клетки отмывали дважды питательной средой 199 с 2% фетальной телячьей сывороткой, доводили концентрацию клеток до 100 000 в 1 мл 1111С. Концентрацию выделенных из клеток крови мононуклеаров (клетки эффекторы) доводили до 5×106 в 1 мл ППС. Постановку цитолитического теста проводили в 96-луночных круглодонных планшетах.

Nunc", Denmark). В 6 лунок вносили клетки-мишени в количестве 10 ООО в 0,2 мл ППС (контрольные культуры). В следующие 6 лунок вносили клетки-мишени в количестве 10 ООО в 0,1 мл ППС и к ним добавляли по 500 000 клеток эффекторов в 0,1 мл ППС (в соотношении клетка-мишень к эффекторным клеткам 1:50). В каждую лунку добавляли панкреатическую RNK-азу («Sigma», USA) pH 7,2 в конечной концентрации 10 мкг/мл. Культуры инкубировали при 37° С в атмосфере влажности с 5% С02 в течение 14 часов. По завершении инкубации клетки осаждали на стекловолокнистые фильтры («Flow Lab», USA) с помощью полуавтоматического сборщика клеток («Cell Harvester», «Flow Lab», USA). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью (3,5 г. РРО и 0,05 г. РОРОР в 1 л толуола). Радиоактивность образцов измеряли на ?-счётчике. Результаты измерения выражались в имп/мин в расчете на каждую культуру. Каждая экспериментальная группа состояла из 3-х идентичных культур. Результаты выражали индексом цитотоксичности, который вычисляли по формуле: ИЦ=(/ - средние значения в опытных культурах: средние значения в контрольных культурах) х 100% [Петров Р.В. и др., 1984].

2.2.3. Метод определения популяционного состава лимфоцитов.

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в пробирки «Vacutainer» с гепарином или ЭДТА. Обработку крови проводили согласно протоколу фирмы «Becton Dickinson» (USA). 10 мкл цельной крови инкубировали с флуоресцентно-меченными двухи трехцветными моноклональными антителами (2 мкл) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавляли 2 мл лизирующего раствора (NH4CL 8,26 г/л и ИаНСОз 1,0 г/л, pH 7,2), инкубировали 10 минут при комнатной температуре и центрифугировали 5 минут при 300g. Осадок отмывали раствором Cell Wash (USA) и центрифугировали 5 минут при 300g, осадок фиксировали раствором Cell Fix (USA). Анализ образцов осуществляли с помощью проточного лазерного цитофлуориметра FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson» (USA). Обработку материала проводили согласно протоколу фирмы «Becton Dickinson» (USA). Клетки анализировали не позднее 24 часов после фиксации [Loken M.R., 1990].

2.2.4. Методы определения функциональной активности фагоцитов Хемилюминесценция фагоцитов периферической крови.

В качестве источника фагоцитов использовали венозную кровь, взятую в пробирки «Vacutainer» с ЭДТА. Образцы крови в объеме 500 мкл помещали в стеклянные пробирки, лизировали эритроциты добавлением 15 мл лизирующего раствора (NH4CL 8,26 г/л и NaHC03 1 г/л, pH 7,2) в течение 5 минут, затем центрифугировали 7 минут при 200g. Гемолизат удаляли, осевшие клетки ресуспензировали в 0,5 мл раствора Хенкса (без фенолового красного), дополненного 5 шМ глюкозы, 10 тМ HEPES-буфера, 1 мкМ люминола «Sigma Chemical Со» (USA), pH 7,2. Суспензию клеток по 50 мкл переносили в стеклянные пробирки и помещали в ячейки 36 канального хемилюминометра (Люцифер Б «Диалог», Москва) по 6 пробирок на один образец при 37° С. Результаты измерений регистрировались непрерывно в виде кинетической кривой, интенсивность реакции оценивалась количественно по числу импульсов за 1 минуту (имп/мин) в расчете на исследуемую пробу. Для активации хемилюминесцентной реакции фагоцитирующих клеток использовали зимозан («Sigma Chemical Со», USA), опсонизированный по методике [Зыкин В.Ю., Годков М. А., 2004] или раствор форбол-меристат-ацетата (ФМА). В пробирки (по 3 на пробу) добавляли по 15 мкл зимозана (10 мг/мл) или ФМА (0,2 мг/мл) и регистрировали уровень хемилюминесценции в течение 30 минут. Интенсивность хемилюминесцентного ответа оценивали по максимальному значению на кинетической кривой. Среднее значение интенсивности хемилюминесценции определяли по данным трех идентичных измерений. Результаты выражали в виде средних арифметических значений хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови) и индексом стимуляции (ИС), который вычисляли по формуле: ИС = средние значения хемилюминесценции фагоцитирующих клеток с зимозаном, либо с ФМА (имп/мин на 100 мкл крови): средние значения спонтанной хемилюминесценции фагоцитов (имп/мин на 100 мкл крови).

Оценка поглотительной активности фагоцитов.

Метод основан на том, что фагоциты, поглотившие микроорганизмы, меченные ФИТЦ, сами начинают интенсивно флюоресцировать. При этом они четко отличаются от фагоцитов, не поглотивших микробы, что регистрировалось на проточном цитофлюориметре. Для определения поглотительной активности фагоцитов использовали дрожжевые грибы Candida albicans, которые выращивали в питательной среде Сабуро в течение ночи. Осаждали центрифугированием (450g 10 минут), после чего отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с рН 7,4 и фиксировали 70° этанолом в течение 1 часа, далее отмывали один раз и ресуспензировали в карбонатном буфере (рН 9,5). Концентрацию С. albicans доводили карбонатным буфером до 100×106 в 1 мл. ФИТЦ растворяли в диметил — сульфоксиде (ДМСО) и добавляли 0,01 мг на 100х Ю6 С. albicans. Микроорганизмы инкубировали с ФИТЦ в течение 1 часа при комнатной температуре в темном месте, после чего трехкратно отмывали ФСБ от несвязавшегося ФИТЦ центрифугированием. В пластиковые пробирки, для проточной цитофлюориметрии («Falcon», USA), вносили 10 мкл меченых С. albicans в концентрации 80×106 в 1 мл. Добавляли 90 мкл цельной гепаринизированной крови, тщательно перемешивали, инкубировали 30 минут при 37° С. Реакцию останавливали добавлением 10 мл лизирующего раствора (8,26 г/л NH4C1, 1 г/л NaHC03 и 0,37 г/л ЭДТА) рН 7,2. Пробирки центрифугировали 5 минут при 150 g, гемолизат удаляли, осевшие клетки ресуспензировали в 1 мл отмывочного раствора (NaCl — 9 г/л, Na2 НР04 — 1,42, ЭДТА — 0,33 г/л, NaN3 — 0,2 г/л) и повторно центрифугировали 5 минут при 150g. Осадок ресуспензировали в 100 мкл отмывочного раствора и фиксировали добавлением 100 мкл 2% параформальдегида, приготовленного на отмывочном растворе. Интенсивность фагоцитоза оценивали на проточном цитофлюориметре. Фагоцитарный индекс вычисляли как число грибов Candida albicans, поглощенных одним нейтрофилом [Saresella М., Spesiale D. et al., 1999].

2.3. Методы определения гуморального иммунитета.

Биологическим материалом для исследования служила венозная кровь, взятая в сухие пробирки «Vacutainer» без антикоагулянта. Кровь оставляли для свёртывания на 1 час при комнатной температуре, затем центрифугировали 10 мин при 400g (+4° С). Сыворотку аликвотировали в пробирки «Eppendorf' и хранили до анализа при -20° С не более месяца.

2.3.1. Метод определения содержания в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, G и общего Е.

Количественное определение уровня IgA, IgG, IgM и IgE в сыворотке крови человека проводили с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем фирмы «Sigma» (USA). В лунках плоскодонных 96-луночных планшетов сорбировали антитела против IgA, IgG, IgM или IgE человека в концентрации 10 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 — 9,8 и оставляли на ночь при +4° С, после чего планшет, покрытый антителами, трижды отмывали карбонатно-бикарбонатным буфером. В лунки вносили калибровочный стандарт и исследуемые образцы. Инкубировали 1 час в термостате при 37° С, затем трижды отмывали промывочным раствором для удаления несвязавшегося материала. После последнего этапа отмывки в планшеты вносили один из коньюгатов поликлональных афинно-очищенных антител к IgA, IgG, IgM или IgE, меченных пероксидазой хрена («Sigma» в разведении 1:10 000), которые связывались с иммуноглобулинами вышеуказанных классов. Инкубировали 1 час при 37 °C, дважды отмывали промывочным раствором. В результате иммунологической реакции образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Связанный фермент определялся количественно с помощью цветной реакции с хромогенным субстратом. Реакцию останавливали, добавляя IN H2S04. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра «Titertek Multiskan МСС/340» («Labsystems», Finland) при длине волны 492 nm [Пинегин Б.В., Симонова A.B., 2001].

2.3.2. Методы определения в сыворотке крови гемолитической активности комплемента СН50, содержания компонентов комплемента CI, СЗ и С4.

В сыворотке крови как здоровых без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкогольной зависимостью проводили определение гемолитической активности комплемента СН50 и содержание компонентов комплемента С1, СЗ и С4.

Оценка гемолитической активности комплемента СН50.

Эритроциты барана (ЭБ) трижды отмывали 10 минут при 200g в фосфатной буферной смеси — ФБС (NaCl — 8000 мг/л, KCl — 200 мг/л, Na2HP04 — 1000 мг/л, Na2 НР04 — 150 мг/л, КН2Р04 — 200 мг/л, MgS04 6Н20 — 200 мг /л, СаС12 — 100 мг/л) pH 7,2. Затем эритроциты разводили ФБС до 109 в 1 мл. К 4% суспензии эритроцитов барана осторожно добавляли равный объем кроличьей гемолитической сыворотки против эритроцитов барана в титре 1:1200 (предприятие «Антиген») и разводили в 75 раз ФБС. Гемолитическую систему инкубировали при постоянном помешивании в течение часа при 37° С.

Постановку реакции проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы «Nunc», Denmark. В лунки планшета вносили по 50 мкл разведенной сыворотки обследуемых в ФСБ и 50 мкл гемолитической системы. Инкубировали 1,5 часа при 37° С с периодическим встряхиванием планшета. По окончании инкубации планшеты встряхивали и в лунки для фиксации добавляли 100 мкл 2% параформальдегида для остановки реакции. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра — ридера «Titertek Multiskan MCC 340» («Labsystems», Finland) при длине волны 690 nm.

Гемолитическую активность комплемента выражали в условных единицах — СН50, рассчитанных с помощью специальной программы. За единицу активности принимали количество комплемента, выраженное в мл, вызывающее 50% гемолиз сенсибилизированных ЭБ. Постановку реакции осуществляли в триплетах. Контролем служила стандартная пулированная (более 30 образцов) сыворотка здоровых доноров. Качество гемолитической системы контролировали по установленному стандартному значению оптической плотности суспензии сенсибилизированных эритроцитов, инкубированных в лунках без добавления сыворотки [Кондратьева И.А. и др., 2001].

Количественное определение содержания в сыворотке крови CI, СЗ и С4 компонентов комплемента.

Определение содержания компонентов комплемента С1, СЗ и С4 в сыворотке крови как здоровых без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкогольной зависимостью проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест систем («Beckman Culture», USA). Для определения были использованы наборы «IFA-Cl», «IFA-СЗ» и «IFA-C4», основанные на «сэндвич» — варианте твердофазного ИФА. Постановку реакции проводили согласно инструкции производителя.

Для постановки теста использовали два вида моноклональных антител с различной эпитопной специфичностью к С1, к СЗ или к С4 компоненту комплемента человека. Одно из них было иммобилизовано на твердой фазе (в лунках 96-луночного планшета) и обладало высокой специфичностью к С1, СЗ, или к С4, второе антитело было мечено пероксидазой хрена. На первой стадии определения С1, СЗ или С4 компонент комплемента, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывался с антителами, иммобилизованными на поверхности лунок. На втором этапе иммобилизованный С1, СЗ или С4 компонент комплемента взаимодействует с пероксидазным коньюгатом вторых антител. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству С1, СЗ или С4 компонента комплемента в определяемых образцах. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра-ридера «Titertek Multiskan MCC 340» («Labsystems», Finland) при длине волны 630 nm [Walport M.J., 2001].

2.3.3. Методы определения содержания в сыворотке крови С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

В сыворотке крови как здоровых без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкогольной зависимостью проводили определение содержания С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Количественное определение содержания в сыворотке крови CRP.

С-реактивный белок (CRP) представляет собой высокочувствительный неспецифический маркер воспалительных процессов, вырабатывается клетками печени при воспалении. Повышение CRP указывает на обострение хронических заболеваний.

Тест основан на взаимодействии исследуемых сывороток или контрольной сыворотки со специфическими моноклональными антителами, иммобилизованными на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX CRP («HUMAN», Deutschland). Постановку реакции проводили согласно инструкции производителя.

Количественное определение содержания в сыворотке крови ASO.

Тест основан на взаимодействии исследуемых сывороток или контрольной сыворотки со специфическими моноклональными антителами к стрептолизину-O (ASO), иммобилизованными на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX CRP («HUMAN», Deutschland). Постановку реакции проводили согласно инструкции производителя.

Количественное определение содержания в сыворотке крови RF.

Ревматоидный фактор (RF) связан с появлением в крови эндотоксина, который вызывает поликлональную активацию В-клеток, часть которых продуцирует аутоантитела, такие как анти-ДНК и анти-IgG. Ревматоидный фактор обладает низкой афинностью к мономерному IgG, но с высокой авидностью связывается с уже образовавшимся комплексом ДНК-анти-ДНК. Появление в крови высоких титров RF свидетельствует о возникновение аутоиммунных заболеваний.

Тест основан на взаимодействии ревматоидного фактора (RF) в исследуемых сыворотках с иммуноглобулином IgG человека, иммобилизованным на латексных частицах. Появление отчетливо видимой агглютинации латекса в ячейках стеклянного слайда указывает на положительный результат теста. В работе были использованы наборы HUMATEX RF («HUMAN», Deutschland). Постановку реакции проводили согласно инструкции производителя.

Количественное определение содержания в сыворотке крови ЦИК.

Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) образуются при каждой встрече антител с антигеном и обычно эффективно разрушаются мононуклеарными фагоцитами, но иногда сохраняются в течение длительного времени в различных тканях и органах. Сочетание хронической инфекции со слабым гуморальным ответом приводит к постоянному образованию иммунных комплексов и к их отложению в тканях. В каких местах произойдет отложение иммунных комплексов, отчасти зависит от локализации антигена в тканях, а отчасти — от условий попадания комплексов из крови в ткани. Иммунные комплексы способны инициировать разнообразные воспалительные процессы. В норме у человека иммунные комплексы элиминируются из кровяного русла системой фагоцитов. Быстрой элиминации подвергаются крупные комплексы, с низкой и средней молекулярной массой элиминируются плохо и длительно циркулируют в крови. Избыток антигена, снижение синтеза антител, снижение фагоцитарной функции приводит к накоплению иммунных комплексов и запуску иммунопатологических процессов.

Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили в сыворотке крови, как здоровых лиц, так и больных. Определение основано на снижении растворимости иммунных комплексов при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Увеличение мутности раствора при осаждении циркулирующих иммунных комплексов ПЭГ-ом определяли турбодиметрически, оценивая скорость нарастания оптической плотности. При 3%-ой концентрации ПЭГ происходит осаждение крупных иммунных комплексов, при 4%-ой концентрации ПЭГ — средних и мелких [Digeon М. et al., 1977].

Исследуемые образцы сыворотки вносили по 20 мкл в 96-луночные плоскодонные планшеты фирмы «Nunc», Denmark по 6 лунок на сыворотку. В лунки вносили по 120 мкл 3,6 и 4,8% раствора ПЭГ на боратном буфере с рН 8,4 (по 3 лунки). Конечная концентрация ПЭГ в 1 — 3 лунках 3%, в 4 — 6 лунках 4% соответственно. Измерение проводили на MRX Microplate Reader («DYNEX», USA) при длине волны 340 nm. Конечный результат выражался как среднее арифметическое трех значений OD/мин.

2.3.4 Методы определения содержания цитокинов — IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y.

Метод количественного определения содержания в сыворотке крови цитокинов — IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y.

Содержание цитокинов — IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a и IFN-y в сыворотке крови как здоровых без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкогольной зависимостью проводили методом твердофазного ИФА с применением тест систем «Cytimmune» (USA). Постановку реакции проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах («Nunc», Denmark), согласно инструкции производителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометр — MRX Microplate Reader («Dinex Technology Ins.», USA) при длине волны 490 nm.

Метод определения продукции лейкоцитами IFN-y при индукции клеток крови митогеном РНА in vitro.

Секрецию IFN-y исследовали методом ИФА в культуральной среде. Постановку проводили в следующем порядке: мононуклеары выделяли из гепаринизированной венозной крови, разводили кровь средой 199 с солями Хенкса или фосфатно-солевым буфером, остальные процедуры выделения выполняли так же, как указано выше (пункт — Методы исследования влияния этанола на культуру клеток крови здоровых лиц in vitro). Концентрацию выделенных лимфоцитов доводили до 2×106 в 1 мл ППС, культуры о инкубировали при 37 С в атмосфере влажности с 5% СОг в течение 48 часов. Для индукции IFN-y использовали фитогемагглютинин (РНА) «Sigma» (USA) 5 мкг/мл ППС. Постановку проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах («Nunc»). По завершении инкубации планшеты центрифугировали, затем собирали супернатанты в стерильные пробирки «Eppendorf', которые хранили до анализа при -20° С.

Содержание IFN-y в культуральной среде определяли с помощью твердофазного ИФА с применением тест систем «Cytimmune» (USA), постановку реакции проводили согласно инструкции производителя. Учет реакции проводили с помощью спектрофотометра — MRX Microplate Reader («Dinex Technology Ins.», USA) при длине волны 490 nm.

3. Методы статистической обработки результатов исследований.

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики на персональном IBM-совместимом компьютере с применением пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 2007» и «Bio stati stic s «.

Результаты представлены в виде средней (М) ± стандартное отклонение (а). Сравнение групп здоровых добровольцев после нагрузки алкоголем и больных алкоголизмом с группой здоровых (норма) проведено с использованием t-критерия Стьюдента при условии нормального распределения признаков. Различия считались достоверными при р<0,05 [Реброва, О.Ю., 2003; Стентон Гланц, 1999].

Перечень исследованных в работе показателей у больных алкоголизмом и здоровых лиц, не страдающих алкогольной зависимостью, представлен в таблице 5.

Таблица 5. Исследованные показатели у здоровых лиц и больных алкоголизмом.

ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА.

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ.

Показатель Единицы измерения.

Эритроциты млн/мл.

Гемоглобин г/процент.

Гематокрит процент.

Средний объем эритроцитов мкм.

Тромбоциты кл/мкл.

Лейкоциты кл/мкл.

Нейтрофильные миелоциты процент.

Метамиелоциты процент.

Палочкоядерные процент сегментоядерные процент.

Эозинофилы процент.

Базофилы процент.

Лимфоциты процент.

Моноциты процент.

СОЭ мм/час.

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ T-, В-ЛИМФОЦИТОВ и ЦИТОЛИТИЧЕСКАЯ.

АКТИВНОСТЬ NK-клеток.

СП (спонтанная пролиферация) имп/мин.

РНА (10мкг/мл) — индуцированная пролиферация имп/мин.

Con, А (10мкг/мл) — индуцированная пролиферация имп/мин.

PWM (5 мкг/мл) — индуцированная пролиферация имп/мин.

LPS (0,1 мкг/мл) — индуцированная пролиферация имп/мин.

Активность NK-клеток (ИЦ) процент.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК.

СП (спонтанная хемилюминесценция) имп/мин на 100 мкл крови.

ЗИМ (зимозан индуцированная хемилюминесценция) имп/мин на 100 мкл крови.

ФМА (ФМА индуцированная хемилюминесценция) имп/мин на 100 мкл крови.

CD — МАРКЕРЫ).

СБЗ+ Т-лимфоциты % клеток.

СБЗ+ 4+ Т-хелперы, индукторы % от CD3+.

СЭЗ+8+ Цитолитические Т-лимфоциты и Т-регуляторные клетки % от CD3+.

4+/8+ (Отношение С04+ к СЭ8+ Т-клеткам) отношение.

СВ19+ В-лимфоциты % клеток.

СЭЗ" 16+56+ МС-клетки % клеток.

СЭЗ+16+/56+ №СТ-клетки киллеры % от CD3+.

СОЗ+4″ 8″ Незрелые Т-клетки % от CD3+.

СОЗ+4+8+ Незрелые Т-клетки % от CD3+.

С04+25+ Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор к 1Ь2% от CD4+.

С04+0Я+ Активированные Т-лимфоциты, экспрессирующие НЬА-ОЯ % от CD4+.

СЭ8+25+ Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор к 1Ь2% от CD8+.

Продолжение Таблицы 5.

СБ8+БЯ+ Активированные Т-лимфоциты, экспрессирующие НЬА-ОЯ % от CD8+.

С03 56+0Я' Активированные МК-клетки, экспрессирующие НЬА-ОЯ % от NK-клеток.

СБ95+ молекула апоптоза % клеток.

СБ4+45ЯА КО+ Т-хелперные клетки памяти % от CD4+ Т-лимфоцитов.

СБ8+45ЯА" КО+ Т-супресорные клетки памяти % от CD8+ Т-лимфоцитов.

СБ8+СБ28+ % от CD8+ Т-лимфоцитов.

СБ8+ С028″ % от CD8+ Т-лимфоцитов.

ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА.

ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫИ ПРОФИЛЬ.

Иммуноглобулин IgA мг%.

Иммуноглобулин IgG мг%.

Иммуноглобулин IgM мг%.

Иммуноглобулин IgE (общий) МЕ.

ПОКАЗАТЕЛИ КОМПЛЕМЕНТА И КОМПОНЕНТОВ КОМПЛЕМЕНТА.

СН50 гемолитическая активность комплемента Ед.

С1 компонент комплемента мг/мл.

СЗ компонент комплемента мг/мл.

С4 компонент комплемента мг/мл.

ПОКАЗАТЕЛИ БЕЛКОВ ОСТРОЙ ФАЗЫ ВОСПАЛЕНИЯ.

Среактивный белок (CRP) мг/л.

Антистрептолизин-О (ASO) Е/мл.

Ревматоидный фактор (RF) Е/мл.

Иммунные комплексы (3% ПЭГ) у.е.

Иммунные комплексы (4% ПЭГ) у.е.

ПОКАЗАТЕЛИ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ.

IL-2 ед/мл.

IL-4 пг/мл.

IL-6 пг/мл.

IL-8 пг/мл.

TNF-а пг/мл.

IFN-y пг/мл.

Часть IV. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Часть VI. ВЫВОДЫ.

1. Острая алкогольная интоксикация в культурах клеток крови in vitro оказывает угнетающее влияние на CD4+ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8+ Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих клеток, индуцированную митогенным лектином Con А, и экспрессию на них активационных молекул — CD25, HLA-DR и CD38, что способствует их переходу в цитолитические Т-клетки киллеры.

2. Острая алкогольная интоксикация (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, характеризуется нарушениями гемограммы, пролиферативной активности CD4± и CD8±лимфоцитов, В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток. Снижение содержания CD4+ Т-лимфоцитов и их пролиферативной активности является предпосылкой возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния.

3. Выявленные изменения активационного состава лимфоцитов при острой алкогольной интоксикации (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, а именно: повышение содержания CD8+DR+ и CD8+25+ Т-лимфоцитов в периферической крови, приводит к активации эффекторного звена иммунной системы (цитолитических Т-клеток киллеров), результатом действия которого может явиться возникновение алкогольного поражения органов и тканей организма. Обнаруженные изменения CD4+DR+ Т-лимфоцитов и 1ЧК1Ж±клеток отражают длительность хронической алкогольной интоксикации.

4. Острая алкогольная интоксикация (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя), в том числе на фоне хронической интоксикации у больных алкоголизмом, существенно усиливает кислородзависимую активность фагоцитов и снижает их способность к поглощению патогенных микроорганизмов. Усиление кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток может обусловить разрушительное действие фагоцитов на различные клетки и ткани, а снижение их поглотительной способности — привести к нарушению иммунологической реактивности организма и явиться одной из причин частых инфекций и болезней иммунных комплексов.

5. Острая алкогольная интоксикация приводит к увеличению содержания иммуноглобулинов классов, А и Е и к снижению уровня иммуноглобулинов классов М и G в периферической крови как у здоровых добровольцев после употребления крепкого алкоголя в количестве 0,2 л и более, так и у больных алкоголизмом I и II стадии. Увеличение содержания IgE повышает риск развития аллергических заболеваний и бронхиальной астмы, а снижение уровней IgM и IgG может явиться причиной возникновения различных инфекций у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

6. Острая алкогольная интоксикация приводит к изменению гемолитической активности комплемента и содержания компонентов комплемента в периферической крови больных алкоголизмом и здоровых добровольцев, что говорит об изменении классического пути активации комплемента на альтернативный путь.

7. Острая алкогольная интоксикация ведёт к изменению типа иммунного ответа, о чем свидетельствует изменение уровня IL-4, а также IL-2 и IFN-y в периферической крови.

8. Усиление экспрессии молекул HLA I класса наряду с повышением экспрессии активационных молекул на С08±лимфоцитах in vitro и in vivo после острой алкогольной интоксикации свидетельствуют об активации эффекторного (киллерного) механизма иммунитета, что является предпосылкой для развития соматической патологии у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

9. Длительное воздержание от алкоголя (в течение 3−5 лет) больных алкоголизмом приводит к восстановлению основных параметров клеточного и гуморального иммунитета. В случае продолжающегося употребления алкоголя в терапевтическую программу необходимо включать иммуномодулирующие препараты.

10.Обнаруженные изменения параметров иммунной системы в результате действия острой алкогольной интоксикации следует учитывать при исследовании иммунного статуса и проведении клинических анализов крови, поскольку предшествующая алкогольная интоксикация может привести к постановке ошибочных диагнозов воспалительного процесса и иммунодефицитного состояния. 1.