Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России

Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, возбудители которых циркулируют в природе, остаются сложной проблемой, несмотря на все усилия по борьбе с ними. Нарастающая в последние десятилетия тенденция сосредоточения очагов природных инфекций на территориях, освоенных или осваиваемых человеком, заставляет искать закономерности их формирования и устойчивого функционирования.

Совершенно очевидно, что устойчивость трёхчленной паразитарной системы трансмиссивных заболеваний обеспечивается сложными взаимодействиями гетерогенных структур — популяций основных компонентов очага: возбудителей, переносчиков и прокормителей.

Несмотря па большое количество исследований в этой области, представления о структурных компонентах природных очагов недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований, касающихся функционирования и контроля эпидемической напряжённости природных очагов и очагов, подвергшихся антропогенной трансформации.

Для человека наиболее патогенными возбудителями из природно-очаговых трансмиссивных инфекций, переносимых клещами, являются флавивирусы.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, который включает в себя различные виды млекопитающих, насекомых, птиц, рептилий. Эти виды животных формируют природные очаги в различных географических регионах мира. Многие из флавивирусов вызывают заболевания у человека. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами депге, жёлтой лихорадки, японского энцефалита, Западного Нила и клещевого вирусного энцефалита. Для клинической картины этих заболеваний характерны тяжёлые лихорадки, в том числе с выраженными геморрагическими проявлениями, менингиты и энцефалиты, сопровождающиеся очаговыми поражениями центральной нервной системы, тяжёлыми поражениями печени и других внутренних органов. Для России наибольшую медицинскую значимость имеет вирус клещевого энцефалита (Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V., 1999). BIO был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке как этиологический агент клещевого энцефалита (Павловский, 1940). BIO принадлежит к группе вирусов одноимённого комплекса и вызывает у людей заболевание ЦНС с уровнем смертности 1−2% для европейского и сибирского генотипа и 30% - для дальневосточного генотипа (Gritsun T.S. et al., 2003).

Передача флавивирусной инфекции осуществляется членистоногим переносчиком — через укус комара или клеща, а 'также при употреблении молока от заражённых коров и коз.

В Российской Федерации с начала 90-х годов и до 2000 года отмечался резкий подъём заболевания КЭ (до 8000 случаев в год). Несмотря на то, что в настоящее время заболеваемость снизилась более чем в 3 раза и составляет 2,42,6 чел. на 100 тыс. населения (при этом число заболеваний по РФ находится в пределах 3200−3700 случаев в год), в некоторых регионах Урала, Сибири и Дальнего Востока она по-прежнему остаётся высокой — до 30−35 чел. на 100 тыс. населения. Ежегодно в РФ до 350 тысяч человек подвергаются нападению клещей, а значит, и риску заболевания клещевыми инфекциями. Наряду с ростом случаев присасывания клещей отмечается тенденция к нарастанию тяжести заболеваний, которые они передают, увеличивается доля менингеальных и очаговых форм КЭ (Волкова, Образцова, 2002), имеются сообщения о случаях заболевания IO с геморрагическим синдромом (Ternovoi et al., 2003). Кроме того, растёт список инфекций, передаваемых клещами. Для одних уже установлена роль в инфекционной патологии человека, а для других вопрос патогепности остаётся открытым, особенно это касается риккетсий. 'Гак, виды, считавшиеся ранее непатогенными, после антропогенного воздействия па природные очаги вызывали тяжёлые заболевания у людей. Примером может служить астраханская пятнистая лихорадка (Тарасович, 2005). В настоящее время существует несколько видов риккетсий, патогеппость которых для человека не установлена, — к сожалению, это не всегда означает, что её нет.

Требуются дополнительные исследования этой группы клещевых инфекций для уточнения спектра циркулирующих в России видов и уточнение их патогенпости.

В настоящее время наиболее актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций являются уточнение ареалов инфекций, генотипов возбудителей этих инфекций, а также видового состава и граииц распространения иереносчиков.

В последнее время во многих городах России отмечается увеличение количества иксодовых клещей в городских биотопах, изменение их видового состава, а также увеличение доли смешанных инфекций (Ромапепко и др., 2011; Ястребов и др., 2012).

Известно, что членистоногие переиосчики, а возможно, и их позвоночные прокормители могут влиять на свойства ВКЭ (Вотяков, 2002), в силу чего знание их генетических характеристик может быть полезным при изучении механизмов адаптации возбудителей и формирования их патогенетических свойств. Для доказательства этих изменений проводится видовая идентификация клещей с помощью морфологических методов, что является кропотливым и трудоёмким процессом и не всегда приводит к однозначной интерпретации результатов. Пет сомнения в том, что видовой состав переносчиков оказывает влияние на функционирование природного очага и при появлении таких случаев требует разрешения после проведения дополнительных исследований с применением молекулярпо-биологических методов.

Всё также остаётся актуальной проблема вакцинопрофилактики: доля привитых среди лиц, подвергшихся нападению клеща, не превышает 10% даже для районов, неблагополучных по КЭ. Поэтому генетический контроль производственных штаммов, их соответствие наиболее перспективному по использованию для вакцинации населения генотипу необходимо, особенно после опубликования данных о существовании нескольких существенно отличающихся вариантов штамма Софьин дальневосточного генотипа, используемого в настоящее время как реферепс-штамма (Коуа1еу е1 а1., 2012).

Наибольшее внимание, как известно, уделяется природным очагам с традиционно высокой заболеваемостью (Сибирь, Дальний Восток) и инфекциям, наиболее распространённым и опасным для человека (клещевой вирусный энцефалит, клещевой боррелиоз). При этом об очагах, находящихся на границе ареала иксодовых клещей и в которых ранее регистрировались только единичные случаи клещевых инфекций, известно очень немного.

Учитывая существенный рост заболеваемости клещевым энцефалитом в Республике Коми, наблюдаемый в последние годы, а также отсутствие комплексных исследований этого природного очага, мы решили установить спектр переносимых клещами патогенов в этом регионе и генотипировать наиболее опасный из них — вирус клещевого энцефалита.

Заболеваемость клещевыми риккстсиозами в последние годы не имеет тенденции к росту и регистрируется в 17 областях, в то время как в соседних государствах (европейские страны, Япония) эти заболевания имеют высокую медицинскую значимость и активно исследуются. Появляются публикации о тяжёлых формах риккетсиозов (ОоЬес е1 а1., 2009) и выявлении новых видов риккетсий (Рудаков и др., 2012). Поэтому мы решили определить частоту встречаемости и генотипировать риккетсии в природных очагах, находящихся в различных по эпидемической напряжённости частях ареала и сравнить с природным очагом, для которого значимость этого патогена считается высокой.

В РФ иксодовые клещи, являющиеся неотъемлемой частью природного очага, активно и успешно изучаются только несколькими группами исследователей — зоологов. Информация об их генетических характеристиках отсутствует практически полностью, несмотря па то, что понимание структурно-функциональных особенностей природных очагов без точных генетических критериев невозможно.

Исходя из выше изложенного материала, нами было решено подойти к решению обозначенных проблем комплексно. Отсюда вытекает несколько поставленных целей для моего диссертационного исследования.

Цели исследования:

• оцепить уровень заражённости клещей вида Ixodes persulcatus и определить спектр инфекций в иксодовых клещах, собранных в пограничных районах ареала — па территории Республики Коми в 2010 году;

• определить генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита и риккетсий, циркулирующих в выбранных для исследования природных очагах;

• провести молекулярно-генетическую видовую идентификацию иксодовых клещей, участвующих в трансмиссии инфекций, в природных очагах Западной Сибири;

• дать генетическую характеристику производственного штамма 205 вируса клещевого энцефалита из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».

В связи с поставленными целями предстояло решить ряд задач.

Задачи исследования:

• создать коллекцию ДНК и РНК, выделенных из индивидуальных иксодовых клещей, собранных в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России;

• выявить РНК ВКЭ и ДНК бактерий в коллекционных образцах с помощью ГИДР;

• определить нуклеотидпые последовательности фрагментов геномов, выявленных в образцах коллекции, вариантов ВКЭ и риккетсий и провести их молекулярно-генетический анализ;

• охарактеризовать межвидовую и внутривидовую вариабельность иксодовых клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011;2012 гг., участвующих в трансмиссии клещевых инфекций, по пуклеотидным последовательностям митохондриальпых геномов;

• провести определение полной нуклеотидной последовательности генома реферепс-штамма 205 ВКЭ из коллекции ПЩ ВБ «Вектор» и его сравнительный анализ.

Научно-практическая значимость.

• Впервые проведено комплексное исследование природного очага клещевых инфекций в Республике Коми. В клещах I. persalcatus обнаружен генетический материал возбудителей восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень ипфицировапности клещей для разных инфекций колебался от 11,3% до 1,2% в зависимости от вида возбудителя. Уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6%.

• Впервые проведена оценка генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита, РНК которого выявлена в иксодовых клещах, собранных в центральных и южных районах Республики Коми.

• Впервые показано, что в иксодовых клещах Республики Коми циркулирует сибирский и дальневосточный генотип ВКЭ, причём доминирует дальневосточный, доля которого достигает 81,2%) от числа клещей, генотипированных по ВКЭ. Во всех исследованных образцах иксодовых клещей европейский генотип ВКЭ обнаружен пе был.

• Анализ нуклеотидной последовательности 5'-НТО геномной РНК ВКЭ, выделенной из индивидуальных клещей, показал высокий уровень вариабельности некоторых участков Y-структуры 5'-НТО. Вариабельность элементов В2, С1, CS В наблюдалась в более чем 50% образцов. Анализ копформации района 5'-НТО геномной РНК ВКЭ показал, что наблюдаются существенные изменения вторичной структуры этого района РНК. Полученные данные подтверждают гипотезу, что вариабельность и конформация 5'-НТО геномной РНК BIO имеют принципиальное значение для адаптации вируса к активной репликации в клетках различных видов.

• Установлено, что ДНК Rickettsia spp. встречается в клещах, грызунах и птицах, обитающих в г. Томске и его пригородах, Республике Коми и Республике Молдова. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена в 12,7−5,9% образцов. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и отрА, кодирующих цитратсинтазу и белок, А наружной мембраны, позволил установить, что на территории Республики Коми циркулируют два вида риккетсий — R. raoiiltii и R. tarasevichiae, на территории Томска — R. raoultii, R. tarasevichiae, R. slovaca. С помощью филогенетического аиализа показано, что восемь томских изолятов кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), которая является каидидатной для выделения в новый вид риккетсий.

• Проведён анализ генома штамма 205 ВКЭ, используемого в настоящее время для производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита из двух вирусных коллекций, прошедших разную пассажную историю. Анализ показал их высокую гомологию и высокий уровень консерватизма штамма 205. Полученные данные по генетическим характеристикам производственного штамма 205 ВКЭ могут быть использованы для стандартизации производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита.

• Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генов субъедииицы 1 цитохромоксидазы (COI) и 16SpPIIK митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persidcalus, собранных па юге Западной Сибири в 2011;2012 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей исследованных митохондриальпых генов иксодовых клещей показал, что уровень межвидовых отличий клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus, варьировал от 8 до 12%, а уровень внутривидовой изменчивости — от 0,58% до 1,93%. Полученные данные могут быть использованы для проведения генетических исследований биоразнообразия различных видов клещей, обитающих в Евразии.

Положения, выносимые на защиту.

• В Республике Коми в клещах 1. persulcatus обнаружены генетические маркёры восьми инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Мила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.

• Установлено, что на территории Республики Коми циркулируют ВКЭ дальневосточного и сибирского генотипа.

• Доказано, что элементы С1, В2, CS В Y-структуры 5'-НТО геномной РНК ВКЭ природных образцов высоковариабельпы, при этом вторичная структура 5'-НТО природных вариантов существенно отличается от вторичной структуры 5'-НТО лабораторных штаммов.

• Генетические маркёры Rickettsia spp. выявлены в пробах клещей, грызунов и птиц, обитающих в биотопах г. Томска и его пригородах и в клещах Республики Коми.

• С помощью секвенировапия показано, что полные иуклеотидные последовательности геномной РНК штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и производственного штамма 205 из коллекции НПО «Вирион», опубликованной в 1991 г., имеют высокий уровень гомологии.

• Установлено, что уровень межвидовых и внутривидовых отличий по нуклеотидным последовательностям генов COI и 16S рРНК митохондриального генома клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus подтверждает правильность таксономического разделения двух рассматриваемых видов и позволяет использовать фрагменты последовательностей этих генов в качестве генетического маркёра для видовой идентификации иксодовых клещей.

Вклад автора:

Расчёт и тестирование олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для геиотипироваиия иксодовых клещейсоздание коллекции образцов ДНК/РЫК, выделенных из иксодовых клещейпроведение ПЦРопределение нуклеотидных последовательностей (секвепировапие) и их анализ, выполнены лично автором.

Выявление РНК/Д1 LK-маркёров трансмиссивных инфекций в образцах коллекции, расчёт олигонуклеотидных праймеров для определения полной нуклеотидной последовательности штамма 205 вируса клещевого энцефалита выполнено совместно с канд. биол. наук Чаусовым Е. В. и Карташовым М.Ю.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена па 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы. Библиография включает 150 ссылок: 54 — отечественных авторов, 96 — зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 13 таблиц.

выводы.

1.В клещах I. persulcatus, с обрапных и биотопах Республики Коми, обнаружен генетический материал восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ) и Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickettsia s pp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированное&tradeклещей колебался от 11,3% до 1,2% в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6%. Анализ 5'-НТО геномной РНК ВКЭ из иксодовых клещей, собранных на территории Республики Коми в 2010 г. показал, что 81,25% образцов относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, а 18,75% — к сибирскому генотипу. Варианты европейского генотипа не обнаружены.

2. Анализ 5ЧТГО геномой РНК ВКЭ из иксодовых клещей показал существенные изменения коиформации Y-структуры и высокую вариабельность этого района. Вариабельность элементов С1, В2, CS В наблюдалась в более чем 50% образцов, при этом Л2 и ATG-элементы 5-НТО оставались полностью консервативными.

3. Rickettsia spp. была обнаружена в пробах клещей, собранных в г. Томске — в 5,9%, Республике Коми — в 8,4% и Республике Молдова — в 12,7% образцов. Генетический материал риккетсий был выявлен в 9,7% образцов, полученных из органов грызунов и в 27,4% образцов — из различных видов птиц, обитающих в г. Томске и его пригородах.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и отрА риккетсий позволил выявить циркуляцию R. raoultii и R. tarasevichiae па территории Республики Коми и г. Томске. Восемь томских изолятов Rickettsia кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), выявленной в 2011 г. в Северном Китае и рассматриваемую как кандидата для выделения в новый вид риккетсий.

5. Определена нуклеотидная последовательность генов COI и 16SpPHK митохондриальиой ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011;2012 гг. Уровень гомологии между этими видами клещей составил для гена 16S рРНК — 92%, для гена COI — 90%. Уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составил 0,58% для клещей I. pavlovskyi и 1,17% для I. persulcatus, по гену 16S рРНК — 1,44% и 1,93% соответственно. Филогенетический анализ генов COI и 16SpPHK показал, что последовательности мтДНК клещей /. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геногруппы и могут быть использованы в качестве генетических маркёров для видовой идентификации клещей рода Ixodes.

6. Генетический анализ полной нуклеогидной последовательности штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» (GenBank JX498939) показал, что уровень гомологии нуклеотидной последовательности с прототипными последовательностями дальневосточного генотипа составил 90−95% и для аминокислотных последовательностей — 94−98%. Уровень гомологии со штаммом 205 (GenBank DQ989336) из коллекции НПО «Вирион» — 100%, за исключением З'-НТО, которая оказалась на 30 нуклеотидов длиннее, чем у штамма 205 из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В последние годы наблюдается очень существенный рост, более чем в 50 раз, заболеваемости клещевым энцефалитом в северных регионах европейской части страны. Он сопровождается изменением географии распространения таёжного клеща в этом регионе России (Tokarevich et al., 2011; Revich et al., 2012). Органами практического здравоохранения фактически регистрируются только две клещевых инфекции — это клещевой энцефалит и клещевой боррелиоз. Рост заболеваемости КЭ свидетельствует о возможном росте случаев заболевания другими клещевыми инфекциями. Для уточнения распространённости клещевых инфекций была предпринята попытка идентификации различных клещевых инфекций в таёжных клещах. Их сбор был проведён центральных и южных районах Республики Коми. Исследование собранных клещей Ixodes persulcatiis с помощью полимеразиой цепной реакции выявило генетические маркёры восьми инфекционных агентов: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированное&tradeклещей колебался от 0,4 до 13,4% в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 6,3%. Чаще всего встречалась микст-инфекция ВКЭ и Borrelia spp.

Для уточнения особенностей молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций в этом регионе было проведено гепотигшроваиие современных вариантов ВКЭ и оценки возможной генетической вариабельности ВКЭ в таёжных клещах. С этой целыо были определены секвенированием нуклеотидные последовательности фрагментов генома ВКЭ, полученные в ходе ПЦР с геномной РНК вируса, изолированной из индивидуальных иксодовых клещей, и проведён анализ последовательности 5'-НТО генома ВКЭ. Нам удалось определить нуклеотидные последовательности 5'-НТО и 5'-концевого участка гена, кодирующего N-концевой фрагмент белка С, для 16 вариантов ВКЭ из иксодовых клещей, минуя стадию лабораторного культивирования возбудителя. Прямое определение вирусной пуклеотидной последовательности позволяет оценить генетическую вариабельность вирусного генома непосредственно в клеще. Это исключает адаптацию вируса к лабораторным системам культивирования и исключает селекцию жизнеспособных в лабораторных условиях вариантов ВКЭ. При таком подходе нам удавалось секвенировать вирусные последовательности приблизительно у трети ПЦР-положительпых клещей. Фактически, это косвенно отображало уровень вирусной РНК в клеще. Успешное секвепировапие было возможно только при достаточно высокой концентрации вирусной РНК. Видимо, эти клещи и были более эпидемиологически опасны, так как уровень нагрузки вирусной РНК может предопределять инфицирующую дозу при укусе клеща. Анализ филогенетических взаимоотношений изолятов вируса клещевого энцефалита из таёжных клещей позволил выявить циркуляцию только двух генетических вариантов ВКЭ — сибирского и дальневосточного. Неожиданно, но нам не удалось обнаружить в изолятах, полученных из Республики Коми, вариантов ВКЭ, относящихся к классическим штаммам европейского геиотипа. Практически все исследованные изоляты оказались оригинальными и не имели ближайших прототипов (геновариантов) среди известных ранее штаммов сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ. Только варианты Komi 10−13 и Komi 10−15 были генетически близки к известным и описанным ранее штаммам ВКЭ дальневосточного геиотипа. Это штамм 205 и Приморье-91. Фактически только эти последние два варианта можно рассматривать как «завозные» для этого региоиа. Остальные обнаруженные варианты были генетически разнообразны, кластеризовались в различные группы. Это позволяет высказать гипотезу о длительной и независимой эволюции сибирского и дальневосточного геиотипа ВКЭ на территории Северо-Востока Европейской части России.

Анализ пуклеотидной последовательности 5'-НТО вирусного генома показал, что этот район генома ВКЭ в иксодовых клещах весьма вариабелен.

Вариабельность для элемента А1 5-НТО наблюдалась по всех исследованных образцах (100%), а для элементов CI, В2, CS В — в более чем 50% положительных для секвенироваиия образцов. При этом некоторые элементы 5'-НТО оставались полностью консервативными. Компьютерное моделирование вторичной структуры 5'-НТО генома ВКЭ указывает па возможные существенные изменения в пространственной структуре РНК этого района вирусного генома в клещах I. persulcatus. Для лабораторных штаммов ВКЭ это не характерно, так как фактическое большинство лабораторных штаммов имеет стандартную вторичную структуру 5'-НТО, характерную для конкретного генотипа ВКЭ. Изменчивость 5'-НТО в РНК ВКЭ в таёжных клещах позволяет предположить, что обнаруженная нами вариабельность 5Ч1ТО генома ВКЭ может иметь принципиальное значение для обеспечения эффективной репликации ВКЭ в клеще, может изменяться при смене хозяина и сопровождать адаптацию ВКЭ к клеткам млекопитающих.

Следующий этап работы был связан с молекулярной эпидемиологией клещевых риккетсиозов. Для этого был использован материал, собранный в трёх различных регионах: Республике Коми, г. Томске и его пригородах, а также отдалённом от России районе — Республике Молдова как контрольном районе. Объектом для исследования были клещи, а для томских биотопов — ещё и биопробы от мелких грызунов и различных видов птиц. Отлов млекопитающих производился в тех же биотопах, где и сбор клещей. Большинство птиц было отловлено в июле на берегу реки Томь в границах г. Томска и его окрестностях.

В полевых материалах, представленных в основном иксодовыми клещами, собранными в г. Томске, Республике Коми и Республике Молдова, с помощью ПЦР определено наличие генетических маркёров с использованием праймеров к генам, кодирующим цитратсинтазу и белок, А наружной мембраны Rickettsia spp. ДНК возбудителя обнаруживалась в полевых пробах в пределах от 5,6 до 14,7%. Интересно отметить тот факт, что маркёры риккетсий были обнаружены у мелких грызунов, причём ДНК риккетеий выявлялась в 9,7% случаев, что было несколько выше уровня этого же маркёра у иксодовых клещей в тех же биотопах г. Томска и его пригородах. Ещё более интересный факт был отмечен в случаях выявления ДНК риккетеий в биопробах, полученных от различных видов птиц. В птицах ДНК риккетеий была выявлена в 27,4% случаев. Неожиданный результат навёл на мысль о роли птиц в переносе различных видов риккетеий на большие расстояния. Полученный результат косвенно подтверждает и филогенетический анализ, проведённый по гену отрЛ, когда было обнаружено, что все 8 изолятов, полученных из г. Томска, вошли в одну группу (кластер) и оказались фактически идентичными северо-восточному китайскому изоляту Rickettsia ¿-'/?П820 (JF714220), выделенному ещё 2011 году.

Нуклеотидные последовательности гена, кодирующего цитратсиптазу, из 42 полевых образцов и гена, кодирующего белок, А наружной мембраны, из 18 полевых образцов были использованы для проведения генотипирования клещевых риккетсиозов и филогенетического анализа. В клещах, собранных па территории Республики Коми и г. Томска, была обнаружена ДНК R. raoultii и R. tarasevichiae. Восемь томских изолятов образовывали кластер с последовательностью Rickettsia sp. Н820, которая является кандидатной для выделения в новый вид риккетеий и была описана ранее на Северо-Востоке Китая. На территории Республики Молдова были обнаружены риккетсии, близкие к R. slovaca и R. raoultii. С помощью филогенетического анализа нами было показано, что все последовательности оригинальны и образуют отдельные клайды. Картина филогенетического дерева, построенного на основе нуклеогидной последовательности фрагментов двух генов, показывает выраженное генетическое разнообразие риккетеий в полевых пробах, собранных в трёх различных и удалённых друг от друга районах Евразии.

В настоящее время в Российской Федерации для производства вакцин используется два (производственных) референс-штамма дальневосточного генотипа (Leonova, Ternovoi et al., 2007; Lehrer, Holbrook, 2011). Это штаммы 205 и Софьип. Недавно было установлено, что в полных пуклеотидных последовательностях штамма Софьин, полученных из различных коллекций, содержатся множественные нуклеотидпые и аминокислотные замены (Kovalev et al., 2012). Это поставило под сомнение идентичность рсференс-штамма Софьип дальневосточного генотипа, имеющихся в коллекциях различных лабораторий России. Автор сообщения объясняет эту генетическую неоднородность различной историей культивирования этого штамма в разных учреждениях. На наш взгляд, также нельзя исключить технические ошибки секвенирования, которые могли возникнуть в разных группах исследователей при определении пуклеотидпой последовательности этого референс-штамма.

Для получения новых данных о возможной изменчивости референс-штамма 205 дальневосточного субтина в лабораторных условиях проведено полноразмерпое секвенировапие штамма 205 из коллекции ГПЦ ВБ «Вектор», после чего полученную последовательность сравнили с пуклеотидпой последовательностью генома известных штаммов BIO и штаммом 205 (DQ989336) из коллекции НПО «Вириоп» (г. Томск), полная нуклеотидная последовательность которого была определена с помощью секвенирования нами в 1991 году.

Принципиально важная роль иксодовых клещей в обеспечении устойчивого функционирования природных очагов клещевых инфекций в пригородных и городских биотопах лесостепной зоны России требует проведения исследований с целью выявления особенностей строения генома иксодовых клещей как основного вектора для передачи и распространения клещевых инфекций. Знание пуклеотидпой последовательности митохондриальпого генома иксодовых клещей позволит использовать методы генетической диагностики для идентификации различных видов иксодид, даст возможность оценить их внутривидовую изменчивость и особенности молекулярной эволюции геномов клещей.

К сожалению, паши знания об особенностях строения генома иксодовых клещей на территории России весьма ограничены. Поэтому задачей данного исследования было определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов клещей I. pavlovskyi и /. persulcatus, а именно генов coxl, кодирующего субъединицу 1 цитохром-С-оксидазы (COI), и гена rrnL, кодирующего 16S рибосомальпую РЫК митохондриальиого генома. Выбор этих генов был во многом предопределён наличием информации по этим районам генома для других видов иксодовых клещей, представленым в базе данных GenBank.

Нам удалось обнаружить выраженный консерватизм исследованных генов при сохранении определённого уровня внутривидовой изменчивости. Уровень гомологии нуклеотидной последовательности между двумя видами клещей составил для гена 16S рРНК — 92%, а для гена COI — 90%. Уровень гомологии этих генов с последовательностями I. ricinus, другого значимого вектора для клещевых инфекций на территории Европы, находится также в пределах 89−90%. Филогенетический анализ последовательностей генов COI и 16SpPHK также показывает, что последовательности мтДНК клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геиогруппы. По завершении данного исследования уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составлял 0,58% для клещей 1. pavlovskyi и 1,17% для I. persulcatus, ио гену 16SpPHK — 1,44% и 1,93% соответственно. Эти результаты позволяют использовать гены COI и 16S рРНК в качестве маркёров для видового типироваиия иксодовых клещей I. pavlovskyn и I. persulcatus. Данные о нуклеотидных последовательностях генов COI и 16S рРНК митохондриальиого генома хорошо согласуются с существующим таксономическим разделением этих видов клещей. Они позволяют надеяться, что эти гены можно будет использовать для дальнейшего изучения биоразпообразия и особенностей эволюции I. pavlovskyn и I. persulcatus. Такой подход особенно важен в плане борьбы с клещевыми инфекциями, и хотелось бы надеяться, что будет востребован при конструировании противоклещевых вакцин (ЬаЬиёа е1 а1., 2006). Дальнейшее исследование генома этих двух видов клещей может также принести принципиально новые данные для создания нового поколения препаратов на основе биологически активных соединений иксодовых клещей, что вполне закономерно ставит вопрос о секвенировании полного генома иксодовых клещей I. рач1оУБку1 и I. регзи1са1т.