Новый энхансер локуса cut у Drosophila melanogaster

В последнее время достигнуты значительные успехи в изучении молекулярно-генетических механизмов регуляции активности генов в процессе развития. Обнаружены последовательности ДНК, ответственные за активацию или инактивацию сложных структурных генов (энхансеры, сайленсеры и др.)•.

При изучении молекулярных механизмов онтогенеза были обнаружены энхансеры, ответственные за специфичность экспрессии гена в том или другом органе или ткани. При этом каждому органоили тканеспецифическому гену «соответствует» «свой» энхансер.

В связи с этим становится особенно актуальным выявление новых энхансеров, стимулирующих «ключевые» гены, которые контролируют ход основных событий в индивидуальном развитии.

В геноме дрозофилы к таковым относятся, например, системы генов, детерминирующих выбор клеткой пути ее специализации. Из них особенно хорошо известны гены связанные с развитием нервной системы, такие как гены Notch, AS-C-комплекса, а также cut. Это достаточно сложные локусы, характеризующиеся наличием ряда энхансеров со специфическим функциональным назначением.

Среди них наше внимание привлек локус cut. Этот локус — один из генетически наиболее хорошо изученных сложных локусов дрозофилы (Morgan, Bridges, Stertevant, 1925; Johnson, Judd, 1979). Он является одним из наиболее мутабильных участков Х-хромосомы (Schalet, 1949), и играет важную роль в развитии (Santamaria, Garcia-Bellido, 1975).

Цель и задачи исследования

.

Основная цель данной работы состояла в исследовании района ct6 локуса cut.

В работе были поставлены следующие задачи:

1). Получить трансгенных мух, в геном которых введен ген бактериальной бетагалактозидазы под хит-шоковым промотором и 6 исследуемыи нами район ct.

2). С помощью специфического X-gal окрашивания исследовать влияние участка ct6 на экспрессию репортерного гена на разных стадиях развития трансгенной дрозофилы.

3). Просеквенировать фрагмент ДНК, содержащий район ct6 в дикой линии Oregon R и в двух ct-мутантах ct (MRlKl) и ct (MRpN17).

4). С помощью методов торможения и футпринтинга исследовать новый энхансер для выявления признаков, характерных для LCR.

Выводы.

1. Секвенирована область ct6 локуса cut в составе фрагмента ДНК длиной около 10 kb.

2. На базе вектора pUC8 приготовлена конструкция, включающая в себя область ct6 и ген lacZ, находящийся под хит-шоковым промотором. Методом микроинъекций была получена и отобрана трансгенная линия дрозофилы w5, в геном которой была введена данная конструкция. Методом геномной блот-гибридизации детектирована интеграция ct6 области в линии w5.

3. Обнаружено, что экспрессия гена lacZ наблюдается в разные периоды развития и в нескольких тканях.

4. Обнаружено связывание ядерных белков во фрагменте длиной 1,2 kb в ct6 районе методом торможения в геле.

Область, связывающаяся с ядерными белками была изучена при помощи футпринтинга. Обнаружено, что она имеет 4 сайта связывания с ядерным белком и 4 смежных с ними участка ДНК обнаруживают ДНКаза1 гиперчувствительные свойства.

5. Вместе с данными экспрессии чужеродного репортерного гена это может свидетельствовать о наличии участка подобного LCR в районе ct6 локуса cut.

JlMTepaTypa.

1. Bate M. Development of sensory systems in arthropods. // Hardbook of Sensory Physiology. 1978. V. IX. P.1−53, edited by M. de Jacobson. SpringerVerlag, New York.

2. Blair S.S., Mechanisms of compartment formation: evidence that nonproliferation cells do not play a critical role in defining the D/V lineage restriction in the developing wing of Drosophila. // Development. 1993. V.119. p.339−351.

3. Blochlinger K., Bodmer R., Jack J., Jan L.Y., Jan Y.N. Primary structure of a product from cut, a locus involved in specifying sensory organ identity in Drosophila // Nature. 1988. V.333. p.629- 635.

4. Blochlinger K., Bodmer R., Jan L.Y., Jan Y.N. Patterns of expression of Cut, a protein required for external sensory organ development in wild-type and cut mutant Drosophila embryos //Genes and Development. 1990.V.4. p.1322−1331.

5. Blochlinger K., Jan L.Y., Jan Y.N. Transformation of sensory organ identity by ectopic expression of Cut in Drosophila. // Genes Dev. 1991. V.5. p.1124−1135.

6. Blochlinger K., Jan L.Y., Jan Y.N. Postembryonic patters of expression of cut, a locus regulating sensory organ identity in Drosophila // Development. 1993.V.117. p.441−450.

7. Bodmer R., Barbel S., Sheperd S., Jack J.W., Jan L.Y., Jan Y.N. Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D.melanogaster. // Cell. 1987. V. 51. P.293−307.

8. Brand M., Bremer K., de la Concha A., Dietrich V., Jimenez F., Kunst E., Technau G., Tepass U., Vassin H., Weigel D., Campos-Ortega J. Genetics of early neurogenesis in Drosophila // Molecular neurobiology of Drosophila / Cold Spring Harbor Lab. 1986. P.2.

9. Cabrera C.V., Alonso M.C. Transcriptional activation by heterodimers of the achaete-scute and daughterless gene products of Drosophila. // EMBO J. 1991. V.10. p.2965−2973.

10. Campos-Ortega J., Jimenez F. The effect of X-chromosome deficiences on neurogenesis in Drosophila // Development and neurobiology of Drosophila / Eds.

Q.Siddiqi, P. Babu, L. Hall, J.Hall. New York-London: Plenum Press. 1980. P.201−222.

11.Campos-OrtegaJ., Hartenstein V. The embryonic development of Drosophila melanogaster.// Berlin-Heidelberg-New York. Springer-Verlag. 1985. P.227.

12. Chung H., Whiteley M., Felsenfeld G. A 5'element of the chickenglobin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila.// Cell. 1993. V. 74. P.505−514.

13. Cold Spring Harbor Symp. On Quant. Biol. Molecular Biology of Development. New York: Cold Spring Harbor Lab. 1985. P.210.

14.Couso J.P., Bishop S.A., Martinez A. Arias The wingless signalling pathway and the patterning of the wing margin in Drosophila. // Development. 1994. V.120. p. 621−636.

15. Dambly-Chaudiere C., Ghysen A. Independent subpatterns of sense organs require independent genes of the achaete-scute complex in Drosophila larvae.// Genes Dev. 1987. V.l. P.297−306.

16. Dubinin N.P. Step-allelomorphism in Drosophila melanogaster. // J. Genet. 1933. V.27. P.443−464.

17. Engel J.D. Developmental regulation of human beta-globin gene transcription: a switch of loyalties? // Trends Genet. 1993. V.9. P.304−309.

18. Ganetzky B., Wu C. Neurogenetics of membrane excitability in Drosophila// Ann. Rev. Genet. 1986. Vol.20, p.13−44.

19. Garcia-Bellido A. Genetic analysis of the achaete-scute system of Drosophila melanogaster. // Genetics. 1979. V.91. P.491−520.

20. Garcia-Bellido A., Santamaria P. Developmental analysis of the achaete-scute system of Drosophila melanogaster. // Genetics. 1978. V.88. P.469−486.

21.Georguev P. G, Corces V. The SU protein bound to gypsy sequence in one chromosome can repres enchancer promotor interaction in the baured gene located in the other homolog.// Pros.Nat.Acad.Sci. USA. V.92. P.5184−5188.

22. Gerasimova T.I., Corces V.G. Boundary and insulator elements in chromosomes // Current Opinion Genet. & Develop.1996. V.6.P.185−192.

23.Geyer P.K., Spana S., Corces V.G. On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster.// EMBO J. 1986. V.5. p.2657−2662.

24.Geyer P.K., Corces V.G. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus on Drosophila melanogaster.// Genes Dev. 1987. V.l. p.996−1004.

25. Geyer P.K., Corces V.G. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. // Gen. Dev. 1992. V.6. p.1865−1873.

26. Ghysen A., Dambly-Chaudiere. From DNA to form: the achaete-scute complex. // Genes Dev. 1988. V.2. P.495−501.

27. Ghysen A., O’Kane C. Neural enhancer-like elements as specific cell markers in Drosophila // Development. 1989. V.105. P.35−52.

28. Hall J. Genetics of the nervous system in Drosophila // Quart .Rev. Biophys. 1982. Vol.15, p.223−499.

29.Harbecke R., Janning W. The segmentation gene Kruppel of Drosophila melanogaster has homeotic properties. // Genes Dev. 1989. V.3. P.114−122.

30. Harris W. Genetics and development of the nervous system // J. Of Neurogenetics. 1985. Vol.2, p.179−196.

31. Harrison D.A., Geyer P.K., Spana C., Corces V.G. The gypsy retrotransposon of Drosophila melanogaster: mechanisms of mutagenesis and interaction with the supressor of Hairy-wing locus.// Dev. Genet. 1989. V.10. p.239−248.

32. Hartenstein V., Campos-Ortega J.// Roux’s Arch. 1986. Vol.195.p.210−221.

33. Hartenstein V., Campos-Ortega J. Early neurogenesis in wild-type D. melanogaster // Roux’s Arch. 1984. Vol 193. P.308−321.

34. Hartenstein V. Development of Drosophila larval sensory organs: spatiotemporal pattern of sensory neurones, peripheral axonal pathways and sensilla differentiation. // Development. 1988. V. 102. P. 869−886.

35. Higgs D.R. Do LCRs open chromatin domains?// Cell. 1998. V.95. P. 299−302.

36. Holdridge C., Dorsett D. Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the suppressor of Hairy-wing protein of Drosophila melanogaster.// Mol.Cell.Biol. 1991. V.ll. p.1894−1900.

37. Jack J.W. Molecular organisation of the cut locus of Drosophila melanogaster. // Cell. 1985. V. 42. p.869−876.

38. Jack J., Dorsett D., DeLotto Y., Liu S. Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enchancer // Development 1991. V.113. p.735−747.

39. Jack J., DeLotto Y. Structure and regulation of a complex locus: the cut gene of Drosophila // Genetics. 1995. V.139. p.1689−1700.

40. Jacobson M. Developmental neurobiology. N.Y.: Plenum Press. 1978. P.562.

41. Jan Y., Bodmer R., Jan L., Grell E., Ghysen A., Dambly-Chaniere C. Mutations affecting neurogenesis, neuronal identity and path-finding in D. melanogaster// Molecular neurobiology. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. 1986. P.6.

42. Jimenez F., Campos-Ortega J. A region of the Drosophila genome necessary for CNS development // Nature. 1979. Vol.282, p.310−312.

43.Jimenez F., Campos-Ortega J. Genes in subdivision IB of the D. melanogaster X-chromosome and their influences on neural development. J. Of Neurogenetics. 1987. Vol. 4. P.179−200.

44. Jonhson T.K., Judd B.H. Analysis of the cut locus of Drosophila melanogaster // Genetics. 1979. V. 92. p.485−502.

45. Korochkin L., Panin V., Pavlova G., Kopantseva M., Schostak N., Bashkirov V., Gabitova L., Sergeev P. A relatively small 5' regulatory region of esterase S gene of Drosophila virilis determines the specific expression as revealad in transgenic experiments. // BBRC. 1995.V.213. P.302−309.

46. .Kuhn R., Schafer U., Schafer M. PW-ATG-lac, P-element vectors for lacZ transcriptional gene fusions in Drosophila // Nucleic Acids Res. 1988.V.16. P.4163−4164.

47. Lewin B. Chromatin and gene expression: constant questions, but changing answers.// Cell. 1994. V.79.p.397−406.

48. Lim J.K., Simmons M.J., Raymond J.D., Cox N.M., Doll R.F., Culbert T.R. Homologue destabilization by a putative transposable element in Drosophila melanogaster // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1983. V.80. P.6624−6627.

49. Liu S., McLeod E., Jack J. Four distinct regions of the cut locus and their on cell type specification in Drosophila // Genetics. 1991. V.127.p.151−159.

50. Liu S. Genetic characterization of the cut gene and its regulatory role in cell type specification. // Ph.D.Thesis, Cornell University, New York. 1992.

51.Liu S., Jack J. Regulatory interactions and role in cell type specification of the Malpighian tubules by the cut, Kruppel, and caudal genes of Drosophila. // Dev.Biol. 1992. V.150. p.133−143.

52. Marlor R.L., Parkhurst S.M., Corces V.G. // Mol. Cell. Biol. 1986. V.6.p.1129−1134.

53.Molecular Neurobiology of Drosophila // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. 1986. P.89.

54.Morgan T.H., Bridges C.B., Sturtevant A.H. The genetics of Drosophila. // Bibliogr. Genet. 1925 V.2. P.2−262.

55. Nedeljkovich M., Korochkin L.I., Baschkirov V.N., Schostak N., Pavlova G., Stamenkovich-Radak M. Genetic analysis of transgenic D. melanogaster //DIS 80. 1997. p 10−11.

56. Pankratz M.J., M. Hoch, Seifert E., Jackie H. Kruppel requirement for knirps enhancement reflects overlapping gap gene activities in the Drosophila embryo.// Nature. 1989. V.341. p.337−339.

57. Power M. The brain of D.melanogaster.// J.Morphol. 1942. Vol.72, p.517−559.

58. Power M. The thoracico-abdominal nervous system of adult insect, D. Melanogaster.// J. Comp. Neurol. 1948. Vol.88, p.347−409.

59. Poulson D. Histogenesis, organogenesis and differentiation in the embryo of D. melanogaster Meigen// Biology of Drosophila. Ed: M.Demerec. N.Y.: Wiley. 1950. P.168−277.

60. Ponomarenko N.A., Bannikov V.A., Anashenko V.A., Tchurikov N.A. // FEBS Lett. 1997. V.413. p.7−10.

61.Quinn W., Gould J. Nerves and genes // Nature. 1979. Vol.278, p.19−23.

62. Sergeev P., Panin V., Pavlova G., Kopantseva M., Shostak N., Bashkirov V., Georgiev G., Korochkin L. The expression of esterase S gene of Drosophila virilis in Drosophila melanogaster// FEBS Letters. 1995.V.360. P.194−196.

63.Smith P.A., Corces V.G. The suppressor of Hairy-wing binding region is required for gypsy mutagenesis.// Genes Dev. 1992. V.233. p.65−70.

64. Stocker R., Gendre N. Lozenge, a mutant in Drosophila devoid of basiconic antennal sensilla// Molecular neurobiology in Drosophila. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. 1986.p.58.

65. Strausfeld N. Atlas of an Insect Brain. // Berlin-Heidelberg-N.Y.: Springer-Verlag. 1976. P.214.

66. Tchurikov N.A., Gerasimova T.G., Johnson T.K., Barabkar N.I., Kenzior A.L., GeorgievG.P. Mobile elements and transposition events in the cut locus of Drosophila melanogaster // Mol. Gen. Genet. 1989. V.219. p.241−242.

67. Tchurikov N.A., Krasnov A.N., Ponomarenko N.A., Golova Yu.B., Chernov B.K. Forum domain in Drosophila melanogaster cut locus possesses looped domains inside // Nucleic Acids Res. 1998.V.26. p.3221−3227.

68. Technau G., Campos-Ortega J. Fatr mapping in wild tipe D.melanogaster. II. Injections of horseradish peroxidase in cells of the early gastrula stage // Roux’s Arch. 1985. Vol.194, p.196−212.

69. Van Doren M., Powell P. A., Pasternak D., Singson A., Posakony J.W. Spatial regulation of proneural gene activity: autoand cross-activation of achaete is antagonized by extramacrochaetae. // Genes Dev. 1992. V.6. P.2592−2605.

70.Ward S. Invertebrate neurogenesis // Ann. Rev. Genet. 1977. Vol.11, p.415−450.

71.Wieschaus E., Nusslein-Volhard C., Jurgens G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III. Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. //Roux s Arch. Dev. Biol. 1984. V.193. p. 296−307.

72. WilkinsA. Genetic analysis of animal development // N.Y.: Wiley. 1986. P.546/.

73. Zalocar M., Erk I. Division and migration of nuclei during early embryogenesis of D. melanogaster// J.Micr. Biol.Cell.1976. Vol.25.p.97−106.

74. Zhao K., Hart C.M. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32.// Cell. 1995. V.81. P.879−889.

75. Павлова Г. В., Чуриков Н. А., Корочкин Л. И. и др. // Генетика. 1999. Т.35. № 2.

76. Прохорова А. В., Волошина М. А., Шостак Н. Г., Барский В. Е., Голубовский М. Д. Получение и первичный генетический анализ трансформантов Drosophila melanogaster линии w’lzb/XX у w f, содержащих ген mini-white, интегрированный в геном при Рэлементзависимой трансформации // Генетика. 1994. Т.30.№ 7. С.874−878.

77.Чуриков H.A., Кензиор A.JI., Трубецкая Н. В. и др.// ДАН. 1986. Т.286. № 5. С.1257−1260.

78.Чуриков H.A., Павлова Г. В., Корочкин Л. И., Шостак Н.Г.// Доклады Академ. Наук. 1998. Т.363.№ 6. с.1−4.

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Н. А. Чурикову, члену-корр. А. П. Рыскову, к.б.н. Н. Г. Шостак за руководство работой и плодотворное обсуждение результатов, а также за помощь в работе А. Н. Краснову, Н. А. Пономаренко, О. Н. Сысоеву, Ю.Кошелеву.