Патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекция белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеином

Актуальность исследования. Синдром ишемии-реперфузии, лежащий в основе таких патологических процессов, как стенокардия, инфаркт миокарда, инсульт, в настоящее время привлекает внимание большого числа исследовательских групп. Целый ряд работ посвящен изучению местного состояния тканей, вовлеченных в реперфузионное повреждение и поиску возможных способов их защиты от таких отрицательных факторов, как гипоксии, лейкоцитарной инфильтрации, цитокиновой агрессии [79,93,175,182,219]. В то же время недостаточно изучена роль в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии одной из наиболее значимых и динамичных гомеостатических систем организма — системы регуляции агрегатного состояния крови (PACK). Имеются работы, в которых рассматривается значение ее функциональных составляющих в локальных проявлениях синдрома ишемии-реперфузии [52,69,74,152], ряд авторов указывают на развитие местного ДВС-синдрома [201]. Однако комплексная оценка функционального состояния системы гемостаза и активности регулирующих ее факторов, в частности процессов свободнорадикального окисления (окислительный стресс), эндогенной интоксикации, лейкоцитарной реакции, при синдроме ишемии-реперфузии до настоящего момента не производилась.

Особый интерес в плане коррекции нарушений гомеостаза организма в настоящее время привлекают «естественные» факторы, в том числе вещества, относимые к группе так называемых «острофазовых белков». Одним из перспективных представителей данной группы является белок II эшелона альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид, серомукоид, КГП), существующий в виде лекарственной формы — препарата «Орозин». Приоритет в разработке данного препарата принадлежит кафедре биохимии ЧелГМА, а технология производства освоена Челябинской областной станцией переливания крови. Спектр возможных показаний для применения данного препарата требует расширения. Концентрация альфа-11кислого гликопротеина в плазме нарастает в 3−5 раз при различных экстремальных воздействиях на организм уже через 18−24 часа.

95,203]. Данные литературы позволяют характеризовать орозомукоид как нормальный компонент сосудистой стенки, участвующий в регуляции ее проницаемости, как регулятор функционального состояния нейтрофилов и других клеток крови [29,33,211,212]. Имеются указания на наличие антиоксидантной и антицитокиновой активности [140,226]. В последние годы орозомукоид привлекает внимание исследователей как корректор состояния организма при экстремальных состояниях (шок, бактериальная инфекция) [111,124], а также как фактор местной защиты тканей при ишемии-реперфузии [80]. В то же время информация о системном влиянии альфа-1-кислого гликопротеина, в том числе и при ишемии-реперфузии не формирует целостной картины. Исходя из этих предпосылок, были определена цель и задачи исследования.

Цель исследования.

Определить патогенез нарушений гемостаза при синдроме ишемии-реперфузии и их коррекцию белком острой фазы альфа-1-кислым гликопротеи-ном Задачи исследования.

1. Разработать адекватную модель синдрома ишемии-реперфузии, позволяющую получить выраженные изменения гомеостаза целостного организма.

2. Изучить нарушения системы гемостаза при ишемии-реперфузии: системы тромбоцитов, свертывающей, антикоагулянтной и фибринолитической систем.

3. Определить возможные механизмы нарушений системы гемостаза: изменения свободнорадикальных процессов в плазме и тромбоцитах, состояния эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов, выявить взаимосвязи между нарушениями системы гемостаза и факторами, регулирующими гемостатические процессы.

4. Выявить влияние «Орозина» на основные патогенетические механизмы, наблюдаемые при синдроме ишемии-реперфузии: состояние системы гемостаза, состояние свободнорадикальных процессов, состояние эндогенной интоксикации, реакцию системы лейкоцитов.

5. Выявить влияние «Орозина» на состояние компонентов системы гемостаза в условиях in vitro.

Научная новизна. Впервые показано, что изменения системы гемостаза в динамике экспериментального синдрома ишемии-реперфузии носят фазный характер. Ранняя стадия характеризуется изменениями, подобными ДВСК-синдрому. Функциональная активность тромбоцитов повышается в раннем периоде синдрома и снижается в позднем. В ранней фазе (1 час реперфузии) активация свертывающей системы происходит по внутреннему пути, а в позднем периоде (24 часа) — по внешнему пути. Одновременно происходят фазные согласованные изменения активности процессов СРО в плазме и тромбоцитах. Показано, что синдром ишемии-реперфузии сопровождается развитием острофазовой реакции организма, а также преходящей реакцией системы лейкоцитов, проявляющейся нейтрофильным палочкоядерным лейкоцитозом на фоне лейкопении.

Впервые изучено действие препарата «Орозин» на состояние организма при ишемии-реперфузии. Показано, что белок снижает повышенную агрегаци-онную способность тромбоцитов и не оказывает эффекта при пониженной агре-гационной активности, нормализует адгезивную способность тромбоцитов. В условиях ишемии-реперфузии препарат оказывает антиоксидантный эффект вне зависимости от срока, опосредованный через повышение общего антиокси-дантного потенциала плазмы и активности каталазыснижает выраженность лейкоцитарной реакции.

В условиях in vitro впервые показано, что альфа-1-кислый гликопротеин игибирует функциональную активность тромбоцитов за счет второй волны агрегации. Влияние на адгезивную способность и продукцию свободных радикалов в тромбоцитах различно в условиях in vitro и in vivo при синдроме ишемии-реперфузии.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты диссертационного исследования уточняют роль нарушений системы гемостаза, изменений свободнорадикальных процессов, уровня эндогенной интоксикации в патогенезе синдрома ишемии-реперфузии, а также патофизиологическую значимость альфа-1-кислого гликопротеина как фактора неспецифической защиты организма. Экспериментально обосновано применение препарата «Орозин» при состояниях, в основе которых лежит синдром ишемии-реперфузии, с целью коррекции нарушений тромбоцитарного, коагу-ляционного гемостаза и антикоагулянтной системы, нормализации свободнорадикальных процессов за счет усиления мощности антиоксидантной системы. Разработанная модель синдрома ишемии-реперфузии является аналогом ряда ситуаций в клинике сосудистой хирургии и может применяться для проведения дальнейших научных исследований.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационной работы внедрены в преподавание патофизиологии, биохимии в разделах «Патофизиология системы крови», «Обмен белков» в Челябинской государственной медицинской академии.

Разработанный «Способ моделирования синдрома ишемии-реперфузии» внедрен на кафедру патофизиологии Челябинской государственной медицинской академии для проведения дальнейших научных исследований.

Положения, выносимые на защиту.

1. Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается фазными изменениями состояния системы гемостаза, которые могут быть расценены как ДВСК-синдром и включают как процессы нарушения гемостаза, так и процессы компенсации.

2. Изменения системы гемостаза опосредованы за счет изменения состояния свободнорадикальных процессов и эндогенной интоксикации.

3. Препарат «Орозин» оказывает антиагрегантное и антикоагулянтное действие в условиях синдрома ишемии-реперфузии, опосредованное через изменение состояния свободнорадикальных процессов и уровня эндогенной интоксикации.

4. Препарат «Орозин» оказывает стереотипное антиоксидантное действие, опосредованное за счет повышения активности каталазы и общей антиокислительной активности.

5. В условия ишемии-реперфузии препарат «Орозин» снижает выраженность лейкоцитарной реакции и уровень эндогенной интоксикации.

Апробация работы.

Основные положения работы изложены на научной конференции «Молекулярные основы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию со дня рождения П. М. Альбицкого (Санкт-Петербург, 2003), научно-практической конференции «Биохимия: от исследования молекулярных механизмов — до внедрения в клиническую практику и производство» (Оренбург, 2003), I итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2003), научно-практической конференции «Актуальные вопросы кардиологии и внутренней патологии», посвященной 70-летнему юбилею ЮУЖД (Челябинск, 2004), II итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2004), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), II конференции «Гемостаз и патология сосудов» (Омск, 2005).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, со-стояит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, библиографического указателя. Диссертация иллюстрирована 62 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 194 — зарубежных авторов.

1. Разработана и апробирована адекватная модель массивного синдрома ише мии-реперфузии, приводящая к выраженным изменениям состояния орга низма.

2. Массивный синдром ишемии-реперфузии сопровождается изменениями сис темы гемостаза, аналогичными ДВСК-синдрому. Гиперкоагуляция в ран нюю фазу синдрома (1 час реперфузии) ишемии-реперфузии опосредована за счет «внутреннего» механизма, в позднюю фазу (24 часа реперфузии) — за счет «внешнего» механизма. Одновременно происходит прогрессивное сни жение показателей антикоагулянтной системы и активации фибринолиза.

3. Число тромбоцитов снижается в раннюю стадию и нормализуется через 24 часа. Изменения агрегационной способности тромбоцитов в динамике ре перфузионного повреждения носят фазный характер, с повышением в ран ней фазе и со снижением в более поздний период. Адгезивная способность тромбоцитов в динамике синдроме ишемии-реперфузии прогрессивно сни жается.

4. Реперфузионное повреждение сопровождается развитием острофазовой ре акции организма, что подтверждается повышением уровня фибриногена и церулоплазмина через 24 часа.

5. Ранняя фаза синдрома ишемии-реперфузии характеризуется снижением ан тиоксидантной защиты и повышением уровня продуктов ПОЛ, поздняя ста дия — обратными соотношениями.

6. Синдром ишемии-реперфузии сопровождается реакцией системы лейкоци тов, выраженной в виде палочкоядерного нейтрофильного сдвига влево (только на сроке 1 час) на фоне абсолютной лейкопении (все сроки).

7. Изменения функциональной активности тромбоцитов в значительной степе ни опосредованы за счет изменений процессов СРО в плазме и уровня эндо генной интоксикации,.

8. Препарат «Орозин» оказывает антикоагулянтный эффект, препятствует снижению активности антитромбина и чрезмерной активации фибринолиза.

Препарат «Орозин» снижает повышенную агрегационную способность тромбоцитов до уровня ниже нормальных значений, ингибирует адгезивную способность тромбоцитов и блокирует секреторную реакцию.

9. Действие препарата «Орозин» на функциональное состояние тромбоцитов опосредовано через регуляцию процессов СРО и уровня эндогенной инток сикации в плазме.

10.Действие препарата «Орозин» на состояние СРО в плазме является стерео типным и характеризуется снижением уровня продуктов ПОЛ и повышени ем активности каталазы и обш, ей АОА. Препарат «Орозин» снижает уровень эндогенной интоксикации и выраженность нейтрофильного лейкоцитоза.