Актуальность темы
Одним из основных направлений промышленной биотехнологии является обеспечение животноводства и ветеринарии эффективными и качественными препаратами. Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических препаратов, увеличение номенклатуры, совершенствование, улучшение качества и стандартизация диагностических тест-систем для практических лабораторий по-прежнему остается актуальной задачей.
Реализация идеи создания диагностических наборов требует решения сложных и разнообразных задач. Это, прежде всего, выделение и изучение структуры, физико-химических и иммунобиологических свойств антигенов вирусов и бактерий, детерминант или эпитопов, определяющих специфичность конкретного антигена, и определение их роли в формировании иммунитета. Получение высокоактивных специфических сывороток требует наличия очищенных антигенов, применение эффективных схем иммунизации, выбора адекватных животных-продуцентов, а также изучения возможности применения современных г эффективных иммуностимуляторов.
Каждый диагностический набор содержит строго индивидуальный состав специфических и химических компонентов, применение которых по отработанной для данной инфекции методике, позволяет достигать желаемой цели исследования.
Многообразие симптомов проявления вирусных и бактериальных болезней, а часто их ассоциация, затрудняют постановку диагноза, поэтому.
1 (.
1 этиологический диагноз должен основываться на результатах лабораторных исследований, включая серологический анализ (142).
В этой связи актуальным является совершенствование методов серологической диагностики вирусных и бактериальных инфекций и разработка технологии изготовления монои комплексных диагностических тест-систем.
Экспресс-анализ структуры заболеваний, определение этиологической роли каждого возбудителя в условиях ассоциативных форм инфекций и выработка мер борьбы с инфекционными болезнями, предполагает использование иммуноферментного анализа (ИФА) как экспресс-метода с применением комплексных диагностических тест-систем.
Обоснование выбора объектов исследования. К важнейшим задачам ветеринарной науки относится ликвидация опаснейшего заболевания животных и человека — бешенства. В настоящее время в Российской Федерации сложилась напряженная эпизоотическая ситуация с бешенством животных, имеющим социально-экономическое значение. Активные природные очаги бешенства зарегистрированы в различных регионах страны. Эпизоотии бешенства поддерживаются в основном за счет диких животных, однако в процесс активно вовлекаются бродячие собаки и кошки (Иванов B.C., 2003;Груздев К. Н., Недосеков В. В., 2001).
Основными средствами борьбы с бешенством являются эффективная иммунопрофилактика и своевременная диагностика. Достоверность диагностики бешенства находится в прямой зависимости от активности и специфичности антирабических иммуноглобулинов. В связи с этим актуальным представляется совершенствование технологии промышленного получения препаратов, входящих в диагностический набор.
Лептоспироз относится к числу распространенных природно-очаговых, зооантропонозных, опасных в социальном и экономическом отношениях болезней. Неоценимый вклад в изучение лептоспироза внесли отечественные ученые: Ананьин В. В., 1949;1951; Малахов Ю. А., 1971,1979,1992; Ежов Г. И., 1979,1983,1985; Белоусов В. И., 1984, Артюшин G.K., 1991. До настоящего времени общепринятым методомдиагностики лептоспироза остается реакция микроагглютинаци (РМА).
Фундаментальные исследования по изучению нуклеиновых кислот лептоспир, а также работы по геносистематике этих микроорганизмов позволяют сделать вывод о возможности применения методов биотехнологии для решения проблем, связанных с диагностикой лептоспироза. За рубежом ведутся интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир, анализируются возможности практического применения анализа ДНК и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации, позволяющие выявлять особенности сероваров на уровне хромосомной ДНК лептоспир (Le Febure R.B., 1987; Van Eys G., 1989; Pacciarini M.L., 1992; Merien F. et al., 1992).
Молекулярно-биологические методы играют важную роль в изучении систематики патогенных лептоспир, поиска возможностей их дифференциации и идентификации на основании сравнения генотипов: Так, используя метод ДНК-ДНК гибридизации, возможно выявление специфических фрагментов генома возбудителя лептоспироза, на основании которых делается заключение о наличии или отсутствии лептоспир в исследуемом материале.
Респираторные болезни КРС регистрируются во многихрегионах Российской* Федерации и странах СНГ, причиняя большой экономический ущербмясному и молочному скотоводству. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов они занимают ведущее место в, структуре заболеваний молодняка. Среди вирусных агентов, вызывающих заболевания с симптомами поражения дыхательных путей у крупного рогатого скота (КРС), вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной-(АВ) инфекции занимают особое место в связи с многообразием клинических проявлений и тяжестью течения болезней, вызываемых ими (Сюрин В.Н., 1978; Гуненков В. В., 1975; Крюков Н. Н., 1984; Мищенко В. А.,.
2001; Красочко ПЛ., 1997; Глотов А. Г., 2001; Кузнецова С. В., 1991; Юров К. П., 2001,2003; A. L.E. Lindberg, 2003).
В связи с этим, разработка и внедрение высокочувствительных и специфичных методов серологического мониторинга респираторных заболеваний КРС, которые при большой концентрации животных на ограниченных площадях, часто проявляются у молодняка в виде вирусно-бактериальных ассоциаций, имеют большое значение при проведении лечебно-профилактических мероприятий (Глотов А.Г., 2001).
С введением в практику ветеринарной вирусологии метода иммуноферментного анализа (ИФА) появилась возможность одновременной дифференциальной серологической диагностики респираторных заболеваний крупного рогатого скота. ИФА для диагностики бактериальных и вирусных инфекций пришел на смену трудоёмким, малопроизводительным и часто недостаточно чувствительным методам, основанным на феноменах агглютинации, преципитации, связывания комплемента.
Учитывая то, что диагностика многих моноинфекций решена на уровне практического применения наборов ИФА, и отсутствием наборов для серологического мониторинга вирусных респираторных заболеваний КРС, разработка комплексных тест-систем ИФА представляет значительный научно-практический интерес у ветеринарных специалистов РФ.
Перечисленные выше нерешенные вопросы свидетельствуют об актуальности проведенных исследований.
Цели и задачи исследований. Целью настоящей работы является совершенствование и разработка современных биотехнологических и иммунобиологических методов дляпромышленного производства компонентов монои комплексных диагностических тест-систем инфекционных болезней животных бактериальной и вирусной природы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Усовершенствовать технологию получения антирабической, а также специфических антисывороток к вирусам ИРТ, ПГ-3, ВДБС, PC, АВ и отрицательных-референс сывороток крови животных.
2. Клонировать ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе, создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты генома L. pomona. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.
3. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona, пригодный для использованияв качестве видоспецифичного гибридизационного зонда. Определить возможность применения клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.
4. Разработать технологию производства компонентов комплексной тест-системы иммуноферментного анализа для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и аденовирусной инфекции.
5. Разработать методику постановки, учета и критерии оценки результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и аденовирусной инфекций в биологических жидкостях организма животных.
6. Определить эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы для выявления-антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АВ инфекции в сравнении с методами аналогичной направленности.
Научная новизна. Усовершенствованы и разработаны: 1. Технология получения высокоактивной и специфичной антирабической сыворотки, применяемой для изготовления антирабических диагностических ФИТЦ-конъюгатов и референс-антирабической сыворотки для выявления специфических антител к вирусу бешенства в сыворотках вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа.
2. Впервые разработана технология получения компонентов комплексной иммуноферментной тест-системы для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ инфекции в биологических жидкостях организма КРСоптимизированы условия исследования «сывороток крови и молозива в одном разведении, показана высокая чувствительность и специфичность ИФА и установлена положительная корреляция (результатов, полученных с помощью ИФА и РН, РНГА (заявки на изобретения: «Способ применения комплексной тестсистемы иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления специфических антител к вирусным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» № 2 008 126 759- «Способ получения стандартной положительной панели сывороток крови для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» № 2 008 132 390).
3. Разработаны методы получения очищенных и концентрированных вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, РС и АВ.
4. Впервые разработана технология получения специфических антисывороток к вирусам ИРТ, ИГ-3, ВД-БС, РС, АВ и отрицательных референс-сывороток крови КРС для иммуноферментной тест-системы методом аффинной хроматографии (заявки на изобретения: «Комплексная тест-система иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям КРС» № 2 008 126 758- «Способ получения отрицательных референс-сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления специфических антител к вирусным респираторным инфекциям в биологических жидкостях организма КРС» № 2 008 132 387).
5. Впервые проведено молекулярное клонирование фрагментов ДНК L. interrogans серовара pomona и на их основе создан банк нуклеотидных последовательностей генома лептоспир, получен ДНК-зонд, позволяющий идентифицировать и дифференцировать производственные штаммы лептоспир.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Результаты исследований использованы в производстве диагностических препаратов: «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных», ТУ 9388−003−497 963−97 и «Набор компонентов для диагностики бешенства в РДП», ТУ 9382−006−497 963−92.
— Технология получения антисыворотки к вирусу бешенства с применением полиоксидония включена в «Инструкцию по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных», «Инструкцию по изготовлению компонентов для диагностики бешенства животных в РДП», утвержденные 02.10.2007 г. директором ВНИТИБГ1 и в «Инструкциюпо изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных», утверждена директором ВНИТИБП 2.02.2008 г.
— Технология получения протеина, А золотистого стафилококка, конъюгированного с ферментами (пероксидазой), микроносителями, сорбентами вошла в «Инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных», утверждена 22.01.2008 г. директором ВНИТИБП.
Результаты исследований использованы при составлении: — «Методических рекомендаций по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа», рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции «Ветеринарная биотехнология» ОВМ РАСХН, протокол № 1. -" Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП 17.09.1993 г. и используются во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственных и диких животных. -" Методических рекомендаций по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных методом иммуноферментного анализа", рассмотренные и одобренные 21 04. 2008 года на секции «Ветеринарная биотехнология» ОВМ РАСХН, протокол № 5.
Коллектив ВНИТИБП был награжден за разработку «Комплексной тест-системы ИФА для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям КРС» Дипломом с медалью на 6-й Международной специализированной выставке «Лаборатория» (2008 г.).
Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность по использованию комплексного набора ИФА не только для серологического мониторинга вирусных заболеваний КРС, но и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий с целью установления этиологической структуры респираторных заболеваний КРС.
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета и Методической комиссии ВНИТИБП, в виде ежегодных отчетов по темам заданий Российской НТП. Материалы диссертации доложены:
— на 7-й Европейской и 9-й Всесоюзной конференциях по лептоспирозу в Москве, 1991 г.;
— на Научно-практической конференции: «Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных», 1993 г.- -на Международной научно-практической конференции молодых ученых: «Научные основы производства ветеринарных биологических биопрепаратов», Щелково, 1991 г., 2002 г., 2005 г.;
— на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Коваленко Я. Р. 16−17 мая 2006 г.: «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», Москва, 2006 г.;
— на Международной научно-производственной конференции: «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва A.A., г. Воронеж, 2006 г.- -на Научно-практической конференции: «Актуальные проблемы молекулярной диагностики ветеринарной медицины и биологии», Феодосия, Крым, 2007 г.;
— на Всероссийской научной конференции: «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология», Киров, 2008 г.;
— на заседаниях секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Щелково, 2007;2008 гг.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 36 научных работ, в том числе 9 в рецензируемых изданиях, входящих в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов докторской диссертации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1 .Усовершенствованная технология получения высокоактивной антисыворотки к вирусу бешенства и применение ее при промышленном производстве диагностических антирабических ФИТЦ-коньюгатов и референс-антирабической сыворотки для иммуноферментной тест-системы определения антител в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных.
2. Результаты исследований по клонированию ДНК L. interrogans серовара pomona в плазмидном векторе и применению клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.
3.Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки «Иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC и АВ инфекций» и определение ее эффективности.
Теоретический анализ, экспериментальные исследования и обобщение результатов, выполнены автором самостоятельно.
Автор выражает благодарность за участие в выполнении отдельных фрагментов диссертации сотрудникам ВНИТИБП: директору, академику РАСХН, А .Я. Самуйленко, сотрудникам института В. И. Клюкиной, Д. П. Кузнецову, С. В. Кузнецовой, В. И. Белоусову, И. И. Кочиш, Т. Ю. Кочиш, С. Ю. Филиппову, В. А. Лукиной, Н. Н. Быковой, С. К. Артюшину (ВИЭВ).
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
5. ВЫВОДЫ.
1. Усовершенствована технология получения антирабической сыворотки при производстве диагностических ФИТЦ-антирабических коньюгатов. Применение полиэлектролита-полиоксидония в качестве адъюванта способствовало активации иммунокомпетентных клеток, стимулированию антителообразования, сокращению сроков иммунизации с 90 до 62 дней, повышению специфической активности антирабической сыворотки и уменьшению расхода антигенного материала для иммунизации.
2. Создана клонотека рекомбинантных плазмид, содержащих 67 фрагментов бактериального генома’лептоспир штамма ВГНКИ-6 Leptospira серогруппы Pomona. Получен банк 42 препаратов ДНК лептоспир референтных штаммов, 6-производственных, 7 штаммов серогруппы.
Pomona, изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах РФ.
3. Установлено, что рекомбинантная плазмида pLp 41 размером 3880 пар нуклеотидов, содержащая фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona может быть использована в качестве видоспецифического гибридизационного зонда. Показано, что плазмидный зонд гибридизуется только с ДНК лептоспир вида L. interrogans, и не гибридизуется с препаратами суммарных нуклеиновых кислот сапрофитных лептоспир, иерсиний, кишечной палочки, бруцелл, микоплазм и других бактерий.
4. Установлено в хромосомных ДНК сероваров tarassovi, sejroe, pomona, kabura, polonica, whitcombi, grippotyphosa, panama, castellonis, sarmin, szwajizak, bratislava, djatzi, louisiana, cynopteri присутствие области, гомологичной фрагменту ДНК L. pomona в составе рекомбинантной плазмиды pLp 41. Показано, что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир основных серогрупп Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa.
5. Показана возможность использования фрагмента ДНК L. pomona. рекомбинантной плазмиды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации. Установлено, что в хромосоме производственных штаммов лептоспир присутствуют различные по молекулярной массе области, несущие участки ДНК, гомологичные фрагменту ДНК L. pomona, входящего в состав плазмиды pLp 41.
6. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивающие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов, ограниченный сайтами рестриктазы EcoR I, а также не содержит сайты следующих рестриктаз: Pst I, Sma I, Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген Ыа, детерминирующий синтез бетта-лактомазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. coli, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и неконъюгативна.
7. Выявлено 8 структурных белков с мол. массой от 14 до 180 кД вируса ПГ-3 КРС, штамма «ЗКСМ», полученных обработкой вируссодержащей суспензии тритоном Х-100, и индуцирующих выработку специфических к вирусу ПГ-3 антител в организме восприимчивых животных.
8. Выделены и охарактеризованы 9 структурных белков с мол. массой от 28 до 180 кД PC-вируса штамм «Randall», репродуцированного в культуре клеток ЛЭК., 6 из которых с мол. массой от 42 до 180 кД индуцируют выработку специфических к вирусу PCB антител в организме восприимчивых животных.
9. Разработан одноэтапный метод аффинной очистки специфических антител из антисывороток и антигенов PC-вируса и ПГ-3 из вируссодержащих суспензий на анти-РС IgG BrCN-Сефарозе 4 В и анти-ПГ-3 IgG BrCN-Сефарозе 4 В при промышленном производстве компонентов тест-системы ИФА.
10. Определены оптимальные условия промышленного культивирования и инактивации штамма Staphylococcus aureus, получения хроматографически чистого и биологически активного протеина, А для конструирования иммуносорбентов.
11. Разработана комплексная иммуноферментная тест-система для выявления антител к антигенам вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, PC, АВ и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота в разведении 1:50. Установлен коэффициент связывания (Ксв.) равный 20%, позволяющий дифференцировать положительные и отрицательные сыворотки в ИФА.
12. Чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РН, РИГА составила 98,46%, специфичность- 94,02%, совпадаемость результатов-96,8%, коэффициент корреляции — 0,9 при Р<0,05. При исследовании молозива иммунных коров совпадаемость результатов ИФА и РИГА составила 92,16%, при г = 0,82, Р< 0,05. Показана эффективность комплексной иммуноферментной тест-системы в качестве скринирующего экспресс-метода при массовом серологическом обследовании крупного рогатого скота.
6. Практические предложения.
На основании проведенных исследований предлагаются для практики:
1. Рекомбинантная плазмида pLp 41 в качестве источника молекулярного зонда для идентификации патогенных лептоспир и дифференциации производственных штаммов лептоспир.
2. Разработаны:
Инструкция по изготовлению и контролю компонентов для диагностики бешенства животных в РДП", утверждена 21.02.2006 г. директором ВНИТИБП.
Инструкция по изготовлению и контролю глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных", утверждена 02.10.2007 г. директором ВНИТИБП.
Изменения в ТУ 9388−003−497 963−97 «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных», утверждены Департаментом ветеринарии МСХРФ 12.04.2004 г.
Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов и дифференциации Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", утверждены директором ВНИТИБП от 17.09.93, протокол N2;
Методические рекомендации по определению уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21 сентября 2007 года на секции «Ветеринарная биотехнология» ОВМ РАСХН, протокол № 1, утвержденные 18.03.2007 г. академиком РАСХН A.M. Смирновым.
Методические рекомендации по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)", рассмотренные и одобренные 21. 04.2008г. на секции «Ветеринарная биотехнология» ОВМ РАСХН, протокол № 5.
Технологический регламент на производство набора компонентов для определения уровня специфических антител к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной инфекции (PC), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), аденовирусной инфекции (АВИ) крупного рогатого скота в комплексной тест-системе иммуноферментного анализа (ИФА)", утвержден 21.07. 2007 г. директором ВНИТИБП.
Технологический регламент на производство набора компонентов для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утвержден 21.07. 2007 г. директором ВНИТИБП.
