Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica и ее мутантные формы: получение, свойства, применение

Диссертация: Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica и ее мутантные формы: получение, свойства, применение
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В настоящее время, известны первичные структуры 17 люцифераз, выделенных из различных видов насекомых. Сравнительный анализ первичной и третичной структуры люциферазы светляков из различных источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами и структура излучателя, идентичны для всех… Читать ещё >

Рекомбинантная люцифераза светляков Luciola mingrelica и ее мутантные формы: получение, свойства, применение (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • I. ВВЕДЕНИЕ
  • II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
    • 2. 1. Спектры биолюминесценции люцифераз
      • 2. 1. 1. Природные мутанты
      • 2. 1. 2. Искусственные мутанты (Точечные мутации аминокислотных остатков и их влияние на спектры биолюминесценции)
    • 2. 2. Структура люцифераз
      • 2. 2. 1. Первичные структуры люцифераз
      • 2. 2. 2. Активный центр фермента
      • 2. 2. 3. Мутации в активном центре фермента
    • 2. 3. Причины изменения спектров биолюминесценции
      • 2. 3. 1. Физико-химические представления об изменении цвета биолюминесции
      • 2. 3. 2. Механизмы изменения цвета биолюминесценции, предложенные в литературе
    • 2. 4. Взаимосвязь между структурой люцифераз и спектрами биолюминесценции
      • 2. 4. 1. Влияние белкового микроокружения эмиттера на спектры биолюминесценции нативных и мутантных люцифераз
      • 2. 4. 2. рН — чувствительные и рН — нечувствительные люциферазы
  • III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
    • 3. 1. Плазмида и штамм
    • 3. 2. Вещества и реагенты
    • 3. 3. Аппаратура
    • 3. 4. Методики проведения экспериментов 56 IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 4. 1. Получение мутантных форм люциферазы светляков Ь. т^геИса с точечными заменами №в433Туг, Н18 433А8П и Шз4338ег
    • 4. 2. Каталитические свойства и термостабильность исходной и мутантных форм люциферазы светляков Ь. т1щгеИса
    • 4. 3. Структура микроокружения остатка 1Ш433 в нативной люциферазе светляков и мутантных формах
    • 4. 4. Спектры биолюминесценции для люциферазы светляков Ь. т^геИса и ее мутантов
      • 4. 4. 1. Максимум биолюминесценции и поляризуемость остатка
      • 4. 4. 2. рН-зависимость спектров биолюминесценции для люциферазы светляков Ь. тт^еИса и ее мутанта с заменой 1Ш433Туг
      • 4. 4. 3. Возможные механизм изменения спектров биолюминесценции при мутациях
    • 4. 5. Разработка высокоактивного реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, для определения ультрамалых концентраций АТФ
      • 4. 5. 1. Препараты люциферазы светляков и их влияние на биолюминесцентный сигнал
      • 4. 5. 2. Влияние концентрации фермента и субстрата на стабильность биолюминесцентного сигнала
      • 4. 5. 3. Влияние различных стабилизаторов на форму биолюминесцентного сигнала и интенсивность
      • 4. 5. 4. Лиофилизованные АТФ-реагенты, их свойства и применение
  • V. ВЫВОДЫ

Биолюминесценция — присуща многим живым организмам, (например, бактериям, моллюскам, насекомым) и представляет собой уникальный случай биоконверсии химической энергии в световую [1,2]. В основе лежит катализируемое ферментом — люциферазой окисление органического субстрата — люциферина кислородом воздуха.

Одним из важнейших направлений фундаментального изучения люцифераз является выяснение связи между спектрами биолюминесценции и структурой люциферазы светляков.

В настоящее время, известны первичные структуры 17 люцифераз, выделенных из различных видов насекомых [3−14]. Сравнительный анализ первичной и третичной структуры люциферазы светляков из различных источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами и структура излучателя, идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых. В то же время максимумы спектров биолюминесценции могут варьироваться в интервале от 540 до 620 нм. Это различие в спектрах биолюминесценции для нативных и мутантных форм люцифераз до сих пор не нашло единого объяснения, хотя выдвинуто несколько теорий для объяснения механизма регулирования спектров биолюминесценции [15−17, 26].

Литературные данные показывают [18], что сдвиги в спектрах биолюминесценции могут наблюдаться при мутациях аминокислотных остатков, расположенных на различных участках аминокислотной последовательности. Мутации в активном центре фермента приводят как к сдвигу максимума биолюминесценции, так и к изменению формы спектра, при этом в десятки раз уменьшается каталитическая активность люциферазы, ухудшается связывание субстратов с ферментом. В тоже время природные мутации «ключевых» аминокислотных остатков, локализованных вне активного центра, вызывают сдвиги в спектрах биолюминесценции без существенного изменения ферментативной активности.

Таким образом, актуальным является выяснение механизма, благодаря которому реализуются наблюдаемые изменения в спектрах биолюминесценции, особенно при мутациях остатков, локализованных вне активного центра. Это, возможно, позволит получать мутантные формы люциферазы с различными максимумами спектров биолюминесценции без существенного изменения других физико-химические свойств фермента. Одним из таких остатков, по-видимому, является His433, мутация которого в люциферазе светляков Luciola cruciata случайным мутагенезом привела к сдвигу максимума биолюминесценции от 570 до 610 нм без существенного изменения ферментативной активности [19]. В связи с этим исследование остатка His433 вызывает интерес, поскольку он высококонсервативен для всех люцифераз насекомых, не входит в активный центр, но его мутации могут изменить спектр биолюминесценции.

С другой стороны, исследование биолюминесцентной системы имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, поскольку люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo [20]. Абсолютная специфичность люциферазы по отношению к АТФ (аденозин-5'-трифосфат), близкий к единице квантовый выход реакции, простота регистрации биолюминесценции обусловили большой интерес к люциферазе как высокоэффективному реагенту, позволяющему определять ультрамалые концентрации АТФ [21]. Актуальной задачей является получение высокоактивного и высокостабильного АТФ-реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, что позволит увеличить чувствительность и воспроизводимость определения АТФ, повысить активность АТФ-реагента, снизить расход фермента для получения реагента. Использование люцифераз, генерирующих свет в различной области видимого спектра, открывает дополнительные аналитические возможности для биолюминесцентного микроанализа [22].

Данная работа посвящена изучению физико-химических свойств рекомбинантной люциферазы светляков Ь. тт^еИса и ее мутантных форм по остатку № 8433. Целью работы являлось получение методом сайт-направленного мутагенеза мутантных форм люциферазы светляков L. mingrelica по остатку Шз433, изучение их каталитических свойств, термостабильности, спектров биолюминесценции и разработка метода получения высокоактивного и стабильного АТФ-реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Люцифераза светляков катализирует окисление люциферина светляков кислородом воздуха в присутствии М^АТР [21, 23, 24], которое сопровождается излучением видимого света с квантовым выходом около 90% [25]. Механизм окисления люциферина подробно изучен [23] и предложена схема реакции (рис. 1). На первой стадии фермент связывается с субстратами — люциферином (1) и аденозин-5'-трифосфатом (АТФ). В таком тройном фермент-субстратном комплексе люциферин ковалентно взаимодействует с АТФ, и в результате образуются смешанный ангидрид карбоновой и фосфорной кислот — люцифер ил-аде ни лат (2) и пирофосфат. Далее люциферил-аденилат через ряд промежуточных стадий окисляется кислородом воздуха, превращаясь в циклический пероксид — диокситанон.

3).

4а).

3) n n ч 8 8 он.

И V.

А,&trade-* > 600 пт.

4Ь) о.

— к Б.

— о Т са.

X та* = 560 пт.

Рис. 1. Схема окисления люциферина [23].

Транформация диокситанона приводит к образованию бирадикала, в результате декарбоксилирования которого образуется продукт реакцииоксилюциферин (4) в синглетном электронно-возбужденном состоянии. Кетоформа оксилюциферина (4а) быстро переходит в енольную форму (46) при удалении С5 протона. Затем электронно-возбужденный оксилюциферин дезактивируется с излучением кванта света. Структура эмиттера в биолюминесцентной системе светляков была выяснена при изучении флуоресцентных свойств оксилюциферина в модельных системах [26]. При рН выше 7,0 для оксилюциферина характерна желто-зеленая флуоресценция (А, маКс = 560 нм), а при понижении рН появляется красная флуоресценция (А, маКс = 612 нм).

V. выводы.

1. Методом ПЦР получены три плазмиды рЬЯ, содержащие ген люциферазы светляков Ь. тгп^еНса с точечными заменами №з433Туг, №з433Азп и №з433 Бег, которые были использованы для получения гомогенных препаратов исходной люциферазы и ее мутантных форм. Выход активности исходной люциферазы и мутантной формы №з433Абп составил ~ 80%, мутантной формы люциферазы №з433Туг -75%, а для №з4338ег — 53%.

2. Исследованы каталитические свойства и термостабильность люциферазы светляков и ее мутантных форм при температурах 3042 °C. Показано, что удельная активность мутантной люциферазы с заменой ЬПз433Туг не изменилась, а для мутантных форм с заменами Иб433А8п и №з4338ег — уменьшилась на 20% и в 200 раз, соответственно. Равновесные константы диссоциации (Кдисс) для димеров исходной люциферазы и ее мутантных форм при температурах 30 — 42 °C близки. Кинетические константы ассоциации и диссоциации для мутантных форм люциферазы с заменами Н1з433А8п, №з433Туг несколько выше, чем для исходной люциферазы. Для мутантной формы с заменой №з4338ег обе константы выше приблизительно в 1,5−2 раза. Константы необратимой инактивации мономера для мутантных форм №з433А5П, №э433Туг мало отличаются от таковых для исходной люциферазы, а для мутантной формы с заменой №з4338ег — в 3 раза выше.

3. Получены спектры биолюминесценции в рН-оптимуме каталитической активности (рН 7,8) для исходной люциферазы и ее мутантных форм. Показано, что Хмах для мутантных форм люциферазы с заменами № 8433Абп и № 8433 Бег совпадает с А, мах для исходной люциферазы, а при замене №з433Туг А, мах смещен на ~ 40 нм в красную область.

4. Получены спектры биолюминесценции для исходной люциферазы и ее мутантной формы с заменой His433Tyr в интервале рН от 5,6 до 10,2. Их анализ показал, что спектры биолюминесценции люциферазы являются суммой спектров биолюминесценции трех форм возбужденной молекулы оксилюциферина: кетона (Х, мах 618), енола (Х, мах 587) и енолят иона (Х, мах 556). Сделан вывод, что для исходной и мутантной люцифераз изменение максимума в спектре биолюминесценции при варьировании рН определяется изменением относительного вклада различных форм эмиттера в суммарный спектр биолюминесценции.

5. Разработан метод получения высокочувствительных и стабильных АТФ-реагентов для анализа АТФ на основе растворимой рекомбинантной люциферазы светляков (АТФ-реагент-1) и ее мутантной формы (АТФ-реагент-2) с максимумами биолюминесценции при 566 нм и 606 нм, соответственно, аналитические характеристики и стабильность которых близки. АТФ-реагенты представляют собой лиофилизованные многокомпонентные смеси, в состав которой входит люцифераза светляков, люциферин, компоненты буферных солей и стабилизаторы. Исследовано влияние различных стабилизаторов на растворимую рекомбинантную люциферазу светляков L. mingrelica и оптимизирован их состав. Показано, что наиболее эффективными стабилизаторами и протекторами фермента являются бычий сывороточный альбумин и Б (+)-трегалоза. Микромолярные концентрации пирофосфата натрия увеличивают и стабилизируют биолюминесцентный сигнал. АТФ-реагенты обладают высокой стабильностью при лиофилизации и длительным хранением в лиофилизованном состоянии. Нижний предел определения АТФ с помощью данных АТФ-реагентов.

1 «У составляет 1,0−10 М, а воспроизводимость измерения АТФ ± 5%.

Показать весь текст

Список литературы

  1. И. И., Чумакова Р. И. Биохимические основы биолюминесценции. // Успехи современной биологии. 1975. Т. 79. Вып. 1.С. 3−20.
  2. Hastings J. W. Chemical mechanisms and the evolutional origins of bioluminescent system. // J. Molec. Evol. 1983. V. 19. P. 309−321.
  3. De Wet J.R., Wood K.V., Helinski D.R., De Luca M. Cloning of Firefly Luciferase cDNA and the Expression of Active Luciferase in Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 78 707 873.
  4. Wood K.V., Lam Y.A., Seliger H.H., McElroy W.D. Complementary DNA Coding Click Beetle Luciferases Can Elicit Bioluminescence of Different Colors. // Science. 1989. V. 244. P. 700−702.
  5. Masuda Т., Tatsumi M., Nakano E. Cloning and Sequence Analysis of a cDNA for Luciferase of a Japanese Firefly Luciola cruciata. II Gene. 1989. V. 77. P. 265−270.
  6. Tatsumi H., Kajiyama N., Nakano E. Molecular Cloning and Expression in Escherichia coli of a cDNA Clone Encoding Luciferase of a Firefly Luciola lateralis. //Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1131. P. 161−165.
  7. Ye L., Buck L.M., Schaeffer H.J., Leach F.R. Cloning and Sequencing of a cDNA for Firefly Luciferase from Photuris pennsylvanica. II Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1339. P. 39−52.
  8. Ohmiya Y., Ohba N., Toh H., Tsuji F.I. Cloning, Expression and Sequence Analysis of cDNA for the Luciferases from the Japanese Fireflies, Pyrocoelia miyako and Hotaria parvula. II Photochem. Photobiol. 1995. V. 62. P. 309−313.
  9. Sala-Newby G.B., Thompson C.M., Campbell A.K. Sequence and Biochemical Similarities between the Luciferases of the Glow-worm Lampyris nocticula and the firefly Photinus pyralis. II Biochem. J. 1996. V.313.P. 761−767.
  10. Viviani V.R., Bechara E.J., Ohmiya Y. Cloning, sequence analysis, and expression of active Phrixothrix railroad-worms luciferases: relationship between bioluminescent spectra and primary structure. // Biochemistry. 1999. V.38.P. 8271−8279.
  11. Choi Y.S., Lee K.S., Bae J.S., Lee K.M., Kim S.R. Byung Rae Jin. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding the luciferase from the firefly, Hotaria unmunsana. II Biochemistry and Physiology. 2002. PartB 132, P. 661−670.
  12. White E.H., Rapaport E., Seliger H.H., Hopkins T.A. The chemi and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited state. // Bioorg. Chem. 1971. V. 1. P.92.122.
  13. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.A., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Firefly Luciferase Active Site Amino Acids: a Proposed Model for Bioluminescence Color. // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 1 322 313 230.
  14. Kajiyama N.K., Nakano E. Isolation and characterization of mutants of farefly lucifarase which produce different colors of light. // Protein Eng. 1991. V. 4. P. 691−693.
  15. Kricka L.J. Application of bioluminescence and chemiluminescence in biomedical sciences. // In Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence. Eds. M.M. Ziegler, and Т.О. Baldwin. 2000. P. 333 345.
  16. H.H., Бровко Л. Ю., Кутузова Г. Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ. // Биохимия. 1993. Т. 58. С. 13 511 372.
  17. Ohkuma Y., Abe К., Kosaka Y., Maeda M. Detection of luciferase havingtwo kinds of luminescent colour based on optical filter procedure: application to an enzyme immunoassay. // Luminescence. 2000. 15. 2127.
  18. Ugarova N. N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and regulation mechanism. // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. V. 4. P. 406 -418.
  19. Baldwin T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. // Structure. 1996. V. 4. P. 223−228.
  20. Seliger H.H., McElroy W.D., White E.H., Field G.F. Stereospecificity and firefly bioluminescence, a comparison of natural and synthetic luciferins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. V. 47. P. 1129−1134.
  21. Gandelman O.A., Brovko L.Yu., Ugarova N.N., Chikishev A.Yu., Shkurinov A.P. Oxyluciferin fluorescence is a model of native bioluminescence in the firefly luciferin luciferase system. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1993. V. 19. P. 187−191.
  22. Seliger H.H., McElroy W.D. The colors of firefly bioluminescence: enzyme configuration and species specificity. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1964. V. 52. P. 75.
  23. Biggley W.H., Lloyd J.E., Seliger H.H. The spectral distribution of firefly light. //J. Gen. Physiol. 1967. V. 50. P. 1681.
  24. Viviani V.R., Bechara E.J.H. Bioluminescence and biological aspects of Brazilian railroad-worms (Coleoptera: Phengodidae). // Ann. Entomol. Soc. Am. 1997. V. 90. P. 389.
  25. Colepicolo N.P., Costa C., Bechara E.J.H. Brazilian species of elaterid luminescent beetles. Luciferin identification and bioluminescent spectra. //1.sect. Biochem. 1986. V. 16. P. 803.
  26. Wood K.V., Lam Y.A., Mc Elroy W.D. Introduction to beetle luciferases and their applications. // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. V. 4. P. 289 301.
  27. Wood K.V., Lam Y.A., McElroy W.D. Bioluminescent click beetles revisited. //J. Biolum. Chemilum. 1989. V. 4. P. 31.
  28. Ohmiya Y., Hirano N., Ohashi M. The structural origin of the color differences in the bioluminescence of firefly lucifarase. // FEBS Lett. 1996. V. 384. P. 83−86.
  29. Arslan T., Mamaev S., Mamaeva N., Hecht S.M. Structurally Modified Firefly Luciferase. Effects of Amino Acid Substitution at Position 286. // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. N. 45. P. 10 878−10 887.
  30. Viviani V.R., Ohmiya Y. Bioluminescence colour determinants of Phrixothrix railroadworm luciferase: chimeric luciferases, site-directed mutagenesis of Arg215 and guanidine effect. // Photochem. Photobiol. 2000. V. 72. P. 267.
  31. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H. Protier N.C. The role of active site residue arginine 218 in firefly bioluminescence. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 13 223−13 230.
  32. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Portier N.C. and Zimmer M. Mutational studies of stringently conserved firefly luciferase active site residues. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2410−2418.
  33. Viviani V.R., Uchida A., Viviani W., Ohmiya Y. The influenceof Ala243
  34. Gly247), Arg215 and Thr226 (Asn230) on the Bioluminescence Spectra and pH-Sensivity of Railroad Worm, Clicl Beetl and Firefly Luciferases. //Photochem. Photobiol. 2002. V. 76. P. 538−544.
  35. Hirokawa K, Kajiyama N, Murakami S. Improved practical usefulness of firefly luciferases by gene chimerization and random mutagenesis. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. P. 271−279.
  36. Branchini B.R., Southworth T.L., Murtiashaw M.H., Boije H, Fleet S.E. A Mutagenesis Study of Putative Luciferin Binding Site Residues of Firefly Luciferase. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 10 429−10 436.
  37. Conti E., Franks N.P., Brick P. Crystal Structure of Firefly Luciferase Throws Light on a Superfamily of Adenylate-Forming Enzymes. // Structure. 1996. V. 4. N. 3. P. 287.
  38. De Luca M., Marsh M. Conformational Changes of Luciferase during Catalysis. //Arch. Biochem. Biophys. 1967. V. 121. N. 1. P. 233−240.
  39. Sandalova T.P., Ugarova N.N. Model of the active site of firefly luciferase. // Biochemistry. 1999. V. 64. P. 1143.
  40. Conti E., Stachelhaus Т., Marahiel M. A., Brick P. Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. // EMBO journal. 1997. V. 16.1 14. P. 4174−4183.
  41. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Histidine 245 in Firefly Luciferase: a Proposed Model of the Active Site. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 15 311−15 319.
  42. B.M., Угарова H.H. Консервативные мотивы в суперсемействе ферментов, катализирующих образованиеациладенилатов из ATP и соединений с карбоксильной группой. // Биохимия. 1996. Т. 61. С. 1511−1517.
  43. Franks N.P., Jenkins A, Conti E., Lieb W.R., Brick P. Structural Basis for the ingibition of Firefly Luciferase by a General Anestetic. // Biophys. J. 1998. V. 75. P. 2205−2211.
  44. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. Mutation of a Protease-Sensitive Region in Firefly Luciferase Alters Light Emission Properties. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 18 766−18 771.
  45. Дж. Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. // М. Мир. 1986. 496 С.
  46. Л.Ю., Чередникова Е. Ю., Чикишев А. Ю., Чудинова Е. А. Влияние микроокружения на спектрально-кинетические свойства люциферина светляков. // Вестник МГУ. Серия 3. Физика. Астрономия. 1998. N. 3. С. 26
  47. Е.И., Бровко Л. Ю., Дружинина Е. Н., Гандельман О. А., Угарова Н. Н. // рН-зависимость спектров биолюминесценции и кинетических кончтант люциферазы светляков Luciola mingrelica.// Биохимия 1986, Т. 51. С. 130−139.
  48. Н.Н., Бровко Л. Ю. Взаимосвязь структуры белковой глобулы и спектров биолюминесценции люциферазы светляков. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2001. № 10. С. 16 701 679.
  49. Viviani V.R. Review. The origin, diversity, and structure functhion relationships of insect luciferases. // CMLS. Cell. Mol. Life Sci. 2002. 59. 1833−1850.
  50. Wood K.V. The chemical mechanism and evolutionary development of beetle bioluminescence. // Photochem. Photobiol. 1995. V. 62. P. 662 673.
  51. Lundovskikh I.A., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Recombinant Luciola mingrelica firefly luciferases. // J. Biolum. Chemilum. 1998. V. 13. P. 217.
  52. Vadim R. Viviani, Akira Uchida, Suenaga N., Ryufuku M., Ohmiya Y. Thr226 is a key residue for bioluminescence spectra determination in beetle luciferases. // Biochem. Biophys. Res.Commun. 2001. V. 280. P. 1286- 1291.
  53. Ohmiya Y., Mina S., Viviani V. R, Ohba N. Comparative aspects of a luciferase molecule from the Japanese luminous beetle, Ragophthalmus ohbai. // Sci. Rep. Yokosuka City Mus. 2000. V. 47. P. 31−38.
  54. Wood K.V. Luc genes: introduction of colors into bioluminescence assays. //J. Biolum. Chemilum. 1990. V. 5. P. 107−114.
  55. Lundovskich I.A., Leontieva O.V., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Recombinant Luciola mingrelica firefly luciferase. Folding in vivo, purification and properties. // In: Proceedings of the 10th International
  56. Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21st Century. Eds. A. Roda, M. Pazzagli, L.J.Kricka, and P.E.Stanley, John Wiley & Sons. 1998. P. 420.
  57. И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B., Щеголев А. А., Березин И. В. Способ получения D-люциферина. // Авт. свид-во. N 1 192 324. 1983.
  58. .А., Кост А. Н., Кукарских Г. П., Юровская М. А. Синтез и масс-спектральное исследование люциферина светляков. // Химия природн. соед. 1974. Т. 3. С. 293−300.68. Handbook Q. 1995. Qiagen.
  59. Маниатис. Т, Фрич. Э., Сэмбрук.Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М. Мир. 1984. С. 480.
  60. А.Б. Полимеразная цепная реакция. // Молекулярная биология. 1991. Т. 25. N. 4. С. 926−936.
  61. Д. Гловер. Клонирование ДНК. Методы. // М. Мир. 1988.
  62. Р., Элиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М. Мир. 1991. С. 446.
  63. Л.Ю., Гандельман O.A., Поленова Т. Е., Угарова Н. Н. Кинетика биолюминесценции в люциферин-люциферазной реакции светляков. // Биохимия. 1994. Т. 59. N. 2. С. 273−281.
  64. Lundovskikh I.A., Dementieva E.I., Ugarova N.N. Kinetics and mechanism of thermoinactivation of mutant and native firefly luciferase. // In: Proceedings of the 10th International Symposium on
  65. Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21st Century. Eds. A. Roda, M. Pazzagli, L.J.Kricka, and P.E.Stanley, John Wiley & Sons. 1998. P. 134.
  66. O.M., Чухрай E.C. Кинетика и механизм каталитической инактивации ферментов с четвертичной структурой. // Вестник МГУ. 1979. Т. 20. N. 3. С. 195−211.
  67. О.М., Чухрай Е. С. Диссоциативная термоинактивация биокатализаторов. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. Т. 5. М. ВИНИТИ. 1986. С. 50−86.
  68. О.М., Чухрай Е. С. Кинетический анализ термоинактивации сложных белков на примере щелочной фосфатазы. // Журн. физ. химии. 1995. Т. 69. N. 2. С. 330−335.
  69. О.М., Чухрай Е. С., Торшин И. Ю. Диссоциативная термоинактивация, стабильность и активность олигомерных ферментов. // Биохимия. 1998. Т. 63. N. 3. С. 360−369.
  70. Travis J., McElroy W.D. Isolation and Sequence of an Essential Sulfhydryl Peptide of the Active Site of Firefly Luciferase. // Biochemistry. 1966. V. 5. N. 7. P. 2170−2176.
  71. Herbst R, Schafer U., Seckler R. Equilibrium Intermediate in the
  72. Reversible Unfolding of Firefly (Photinus pyralis) Luciferase. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 11. P. 7099−7105.
  73. Herbst R., Gast K., Seckler R. Folding of Firefly (.Photinus pyralis) Luciferase: Aggregation and Reactivation of the Unfolding Intermediates. // Biochemisrty. 1998. V. 37. P. 6586−6597.
  74. Л.Ю., Беляева Е. И., Угарова H.H. Субъединичные взаимодействия в люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль в проявлении активности фермента и процессе термоинактивации. // Биохимия. 1982. Т. 47. N. 5. С. 760−766.
  75. Н.Н., Бровко Л. Ю., Беляева Е. И., Филиппова Н. Ю., Березин И. В. Димеры каталитически активные частицы люциферазы светляков. // Доклады Академии Наук. 1981. Т. 260. N. 2. С. 358 360.
  76. Е.И., Железнова Е. Е., Кутузова Г. Д., Лундовских И. А., Угарова Н. Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. // Биохимия. 1996. Т. 61. N. 1. С. 152−158.
  77. Weiner S.J., Kollman P. A., Case D.A., Singh U.C., Ghio С., Alagona G., Profeta S.Jr., Weiner P. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. // J. Am. Chem. Soc. 1984. V. 106. P. 765−784.
  78. Weiner S.J., Kollman P.A., Nguyen D.T., Case D.A. An all atom forcefield for simulations of proteins and nucleic acid. // J. Сотр. Chem. 1986. V. 7. 230−252.
  79. H.H. Биоаналитические применения люциферазы светляков. // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. N. 2, С. 180 191.
  80. Н.Н., Бровко Л. Ю., Трдатян И. А., Райнина Е. И. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии. //
  81. Прикладная биохимия микробиология. 1987. Т. 23. N. 1. С. 1424.
  82. Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Beliaieva E.I. Immobilization of Luciferase from the Firefly Luciola mingrelica: Catalytic Properties and Thermostability of the Enzyme Immobilized on Cellulose Films. // Enz. Microb. Technol. 1983. V. 5. P. 60−64.
  83. Lee Y., Jablonski I., De Luca M. Immobilization of Firefly Luciferase on Glass Rods: Properties of Immobilized Enzyme. // Anal. Biochem. 1977. V. 80. N. 2. P. 496−501.
  84. Carrea C., Bovara R., Mazzola G., Girotti S., Roda A., Ghini S. Bioluminescent Continuous-Flow Assay of Adenosine-5 '-triphosphate using Firefly Luciferase Immobilized on Nylon Tubes. // Anal. Chem. 1986. V. 58. P. 331−333.
  85. Carrea G., Bovara R. Girotti S., Ferri E., Ghini S., Roda A. Continuous-Flow Bioluminescent Determination of ATP in Platelets Using Firefly Luciferase Immobilized on Epoxymetacrylate. // J. Biolum. Chemilum. 1989. V.3.P. 7−11.
  86. Gautier S.M., Blum L.J., Coulet P.R. Multi-Function Fibre-Optic Sensor for the Bioluminescent Flow Determination of ATP and NADH. // Anal. Chim. Acta. 1990.V. 235. P. 243−253.
  87. Ugarova N.N., Brovko L.Yu., Kost N.V. Immobilization of Luciferase from the Firefly Luciola mingrelica Catalytic Properties and Stability of the Immobilized Enzyme. // Enz. Microb. Technol. 1982. V. 4. P. 224 228.
  88. И.В., Бровко Л. Ю., Угарова H.H. Способ иммобилизации люциферазы светляков. // Авт. свид-во. N 660 378. 1982. Б.И. N47.
  89. И.А., Дементьева Е. И., Угарова Н. Н. Иммобилизованная рекомбинантная люцифераза светляков. Физико-химическиесвойства и применение. // Биохимия. 1998. Т. 63. N. 6. С. 820 826.
  90. Е.И., Кутузова Г. Д., Лундовских И. А., Угарова Н. Н., Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата. // Патент N 2 164 241 РФ. 1999.
  91. Suelter С.Н., De Luca М. How to Prevent Losses of Protein by Adsorption to Glass and Plastic // Anal. Biochem. 1983. V.135. P.112−119.
  92. Hlady V., Yeh P.Y., Andrade J.D. Adsorption of Firefly Luciferase at Interfaces Studied by Total Internal Reflection Fluorescence Spectroscopy. //J. Fluorescence. 1991. V. 1. P. 47−55.
  93. Н.Ю., Духович А. Ф., Угарова H.H. Приготовление люциферазы светляков. // Патент N 1 339 128 РФ.
  94. Felix Franks, Barry Aldous, Tony Auffret. Using Water-Soluble Glasses as a Strategy for Bioproduct Stabilization. // Genetic Engineering News. 1995.
  95. В. Г., Бровко JI. Ю., Карабасова М. А., Угарова Н. Н. Биолюминесцентный метод определения антибиотикочувстви-тельности микробных клеток в септической крови // Прикладнная биохиомия и микробиология. 1997. Т. 33. N. 4. С. 455−460.
  96. В. Г., Бровко Л. Ю., Бабунова B.C., Карташова В. М., Угарова Н. Н. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока // Прикладная биохиомия и микробиология. 1999. Т. 35. N. 3. С. 358−365.
  97. В.Г., Угарова H.H. Биолюминесцентное определение общей бактериальной обсемененности сырого молока. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. N. 6. С. 407−410.
  98. Фрунджян В. Г, Бабунова B.C., Угарова H.H. Биолюминесцентное определение микробной загрязненности сырого рубленого мяса. // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 2002. Т. 43. N. 6. С. 389−392.
  99. H.H. Контроль микробиологической чистоты косметических продуктов с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии. // Сырье и упаковка. 2003. Т. 31. N. 2. С. 8 -11.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!