Роль иммунологических механизмов в развитии противоопухолевого эффекта антител против белка р53

Актуальность темы

Белок р53 дикого типа (vtp53) содержится в нормальных клетках в латентном состоянии и не выявляется обычными методами, но оказывает противоопухолевое действие. Более половины всех случаев рака у человека сопровождаются мутациями р53-гена, во многих других случаях выявляется потеря функциональной активности р53-белком без мутации в гене. И в том, и в другом случае р53 накапливается в злокачественно трансформированной клетке в значительных количествах. р53 подходит для заместительной генной терапии, так как является мощным индуктором апоптоза раковой клетки. Однако терапия с использованием р53-гена имеет существенные ограничения. Учитывая это, для лечения опухолей, содержащих нормальный или мутантный р53-белок, становятся более актуальными иммунологические подходы. Возможно проведение иммунотерапии путем введения р53-белка. Однако, как аутоантиген, он слабо иммуногенен, даже в своей мутантной форме. Остается открытым вопрос о противоопухолевой эффективности введения самого белка р53 или анти-р53-антител, действие которых может быть опосредовано выработкой и противоопухолевым действием анти-идиотипических антител. Канцерогенез сопряжен с серьезными повреждениями иммунной системы, лимфоидной ткани с нарушениями функций Ти В-лимфоцитов. Опухолевый рост, как правило, идет на фоне выраженного иммунодефицита. В связи с этим представляло интерес изучение влияния иммунизации белком р53 и введения антител против р53 на лимфоидную ткань в условиях химически индуцированного канцерогенеза. Актуальность настоящего экспериментального исследования связана с поиском новых путей иммунотерапии опухолей с использованием антител, направленных против белка р53, и изучением иммунологических механизмов их противоопухолевого действия.

Цель исследования. Изучить роль иммунологических механизмов в развитии противоопухолевого эффекта антител, направленных против белка р53.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить экспрессию белка р53 в кишечнике крыс в динамике химически индуцированного канцерогенеза.

2. Оценить влияние введения крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина на интенсивность химически индуцированного канцерогенеза.

3. Изучить иммуноморфологические изменения в селезенке животных, получивших р53-антиген-липосомный комплекс или анти-р53-иммуноглобулин на фоне химически индуцированного канцерогенеза.

4. Оценить влияние введения крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина на экспрессию белка р53 и показатели, косвенно отражающие активность канцерогенеза и противоопухолевого действия в органах-мишенях канцерогенного действия.

5. Изучить экспрессию промотора р53 у трансгенных мышей на фоне химически индуцированного канцерогенеза и введения анти-р53-антител.

Научная новизна.

Впервые было проведено комплексное изучение противоопухолевого действия анти-р53-антител. Впервые показано увеличение содержания белка р53 в эпителиальных клетках толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза в ответ на введение анти-р53-иммуноглобулина. На модели трансгенных мышей впервые показано, что введение анти-р53-антител усиливает экспрессию промотора р53 и увеличивает содержание белка р53 в клетках кишечника. В экспериментах зарегистрирован выраженный противоопухолевый эффект введения крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-иммуноглобулина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы.

Выявленное в экспериментах резкое возрастание содержания белка р53 в злокачественных тканях при введении анти-р53-антител представляет интерес для обсуждения гипотезы о роли антиидитипических антител, соответствующих «внутреннему образу» антигена.

Зарегистрированное параллельное увеличение выраженности апоптоза, экспрессии р53-белка и количества Т-лимфоцитов в инфильтратах и примыкающих к опухолям тканях можно рассматривать как результат активации иммунной системы в ответ на введение р53 антиген-липосомного комплекса или анти-р53-антител.

Полученные экспериментальные данные могут служить основой для разработки принципиально новых методов иммунотерапии злокачественных опухолей.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Показано возрастание уровня экспрессии белка р53 в эпителиальных клетках толстого кишечника крыс в процессе химически индуцированного канцерогенеза.

2. В ответ на введение анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза усиливается экспрессия промотора р53 и повышается содержание белка р53 в эпителиальных клетках кишечника.

3. При введении крысам р53-антиген-липосомного комплекса или анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза зарегистрирован выраженный противоопухолевый эффект.

4. При введении крысам анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза предотвращалось развитие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и возрастало количество дендритных клеток и макрофагов в селезенке.

5. При введении крысам анти-р53-антител на фоне химически индуцированного канцерогенеза отмечено усиление локальной инфильтрации опухолей С025±клетками и процесса апоптоза в опухолях.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное выполнение всех иммунологических и молекулярно-биологических исследований, интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивается предоставлением в его распоряжение ряда оригинальных моноклональных антител и трансгенных мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 15 международных научных конференциях и доложены на научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2002 г.). Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 05 октября 2004 г.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 16 печатных работ, в том числе 14 статей в научных журналах и 2 тезисов конференций.

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 22 таблицы и 12 рисунков.

Список литературы

состоит из 168 наименований, из них 20 работ принадлежат отечественным авторам и 148 — зарубежным.

выводы.

1. Уровень экспрессии р53 белка в ядрах и цитоплазме клеток коррелирует с прогрессией развития злокачественных опухолей толстой кишки, индуцированных канцерогенами у крыс.

2.

Введение

липосомного комплекса с р53-антигеном оказывает выраженный противоопухолевый эффект при химически индуцированном раке толстой кишки крыс.

3.

Введение

крысам антител, направленных против белка р53, способствует повышению экспрессии белка р53 в клетках слизистой толстой кишки и в клетках опухолей, индуцированных канцерогенами.

4.

Введение

крысам антител против р53 белка, выделенного от крыс с доброкачественными опухолями, оказывает сильный противоопухолевый эффект, предотвращая развитие опухолей и злокачественную трансформацию доброкачественных опухолей.

5.

Введение

крысам анти-р53-антител предотвращает развитие В-иммунодефицита, характерного для крыс-опухоленосителей, и вызывает повышение количества дендритных клеток и макрофагов в селезенке.

6.

Введение

крысам анти-р53-антител вызывает усиление инфильтрации опухолей С025^клетками и активизацию процессов апоптоза в опухолях, индуцированных канцерогенами.

7. У р53 трансгенных мышей экспрессия промотора р53 под действием канцерогена снижается как в слизистой тонкой, так и в слизистой толстой кишки.

Введение

трансгенным мышам анти-р53-антител приводит к увеличению экспрессии р53 промотора и к уменьшению иммуносупрессивного влияния канцерогенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белок р53 дикого типа (vtp53) содержится в нормальных клетках в латентном состоянии и не выявляется обычными методами, но оказывает противоопухолевое действие. Более половины всех случаев рака у человека сопровождаются мутациями р53-гена, во многих других случаях выявляется потеря функциональной активности р53-белком без мутации в гене. И в том, и в другом случае р53 накапливается в злокачественно трансформированной клетке в значительных количествах. р53 подходит для заместительной генной терапии, так как он является мощным индуктором апоптоза раковой клетки. Однако терапия с использованием р53-гена имеет существенные ограничения. Учитывая это, для лечения опухолей, содержащих нормальный или мутантный р53-белок, становятся более актуальными иммунологические подходы. Так как в нормальных неопухолевых клетках содержится необнаружимо малое количество р53-белка, а в опухолевых — очень большое, то возможно проведение иммунотерапии путем введения р53-белка, однако, как собственный антиген, он слабо иммуногенен, даже в своей му-тантной форме. По этой причине мы попытались исследовать не только иммунизацию самим р53-белком, но и введение антител против р53 и изучить возможные иммуно-тропные эффекты. Канцерогенез сопряжен с серьезными повреждениями иммунной системы, с нарушениями функций Ти В-лимфоцитов. Канцерогены оказывают повреждающее действие на лимфоидную ткань. Опухолевый рост, как правило, идет на фоне выраженного иммунодефицита. В связи с этим изучался вопрос о возможном влиянии иммунизации белком р53 и введения антител против р53 на лимфоидную ткань в условиях химического канцерогенеза. Наши данные свидетельствуют о том, что увеличение апоптоза, экспрессии р53-белка и числа С025+ Т-лимфоцигов в инфильтратах и примыкающих к опухолям тканях можно рассматривать как результат активации иммунной системы в ответ на введение анти-р53^С или р53-антиген-липосомного комплекса.

Обработанные канцерогеном крысы без опухоли имели существенные изменения пролиферативной активности лимфоидных компонентов селезенки, макрофагов и дендритных клеток. Онкогенез толстой кишки вызвал глубокие изменения в селезенке. Елатрансформация снизилась по сравнению с крысами, у которых не появилась опухоль в результате канцерогенной обработки. Некоторые из зародышевых центров и слой мантии были опустошены. Количество плазматических клеток в красной пульпе резко уменьшилось. Уменьшение апоптоза было замечено в ткани ТК и в ПАЛМ селезенки. Все эти изменения отражают состояние супрессии как Т, так и В-систем иммунитета. Резкое увеличение количества дендритных клеток, CD25+ Т-клеток, макрофагов и ней-трофилов может рассматриваться как компенсаторная реакция селезенки на сильное антигенное воздействие.

Выраженность этих изменений снижалась как при введении анти-р53 IgG, так и при иммунизации р53-антиген-липосомным комплексом. Морфологически противоопухолевые эффекты выражались в повышении пролиферативной активности лимфоидной ткани в пределах опухолей и в окружающих их тканях. Апоптотический индекс имел тенденцию к повышению в ткани ТК и опухолях.

Мы обнаружили некоторые различия в селезеночном ответе на иммунизацию р53-антигеном по сравнению с введением антител против р53. Эти различия проявлялись, главным образом, в области, занятой различными составляющими белой пульпы. В целом, области белой и красной пульп, ПАЛМ и маргинальной зоны крыс, обработанных канцерогенными веществами, изменялись сходным образом после иммунизации р53-антигеном или введения анти-р53-антител. С другой стороны, фолликулы и их главные составляющие, зародышевый центр и слой мантии, реагировали различным образом.

Таким образом, недостаточность иммунной системы отмечалась в основном у несущих опухоли неиммунизированных крыс, это выражалось в значительном уменьшении областей белой пульпы, мантии, ПАЛМ и маргинальной зоны. В то же время, у иммунизированных крыс отмечена высокая активность В-клеточной системы селезенки. Т-система этих крыс была менее защищена, чем Т-система крыс, получивших антитела против р53 и имевших большие области ПАЛМ и значительное количество CD25 Т-клеток.

Возможность супрессии онкогенеза через иммунную систему организма была проверена нами путем введения крысам анти-р53 1⁰ уже после индукции опухолей. Морфологическое исследование показало, что животные без опухоли, получившие канцероген и, впоследствии, антитела, развивают более мощную иммунную реакцию, чем те, которые получили только канцероген. Это проявлялось в расширении фолликулов и слоя мантии, в повышенном количестве дендритных клеток в фолликулах, макрофагов в маргинальных зонах, и плазматических клеток и лимфобластов в красной пульпе. Признаки недостаточности иммунной системы отсутствовали.

Недостаточность иммунной системы была найдена у получивших антитела крыс-опухоленосителей. Симптомы недостаточности были, однако, более слабо выражены, чем у крыс опухоленосителей, не пролучивших антител. Таким образом, обработка канцерогеном, сопровождаемая введением поликлональных анти-р53-антител, приводила к стимуляции селезеночной В-системы. Кроме того, введение антител также активизировало продукцию макрофагов и дендритных клеток. Активация Т-клеточной системы обнаруживалась только иммуногистохимическими методами.

Мы нашли, что канцерогенные вещества, даже в низких дозах, не приводящих к возникновению опухолей, вызывали существенные изменения структуры селезенки. Это проявлялось, главным образом, в увеличении бластгрансформации лимфоцитов.

Уменьшение общего количества лимфоидных клеток в фолликулах (В-зона) и ПАЛМ (Т-зона) отражает умеренную недостаточность лимфоидной системы селезенки, как ответ на действие низких доз канцерогенного вещества.

Введение

трансгенным мышам антител против р53 (анти-р53 ^в) вызывало интенсивную бласттрансформацию и существенную экспансию белой пульпы и фолликулярных зародышевых центров, но уменьшало бласттрансформацию в ПАЛМ и в маргинальной зоне. Это указывает на то, что антитела к р53, вызывают, главным образом, ответ В-клеточной системы и, в меньшей степени, реакцию Т-клеточной системы.

Введение

мышам различных антител с последующей БМН-обработкой приводило к изменениям в селезенке, которые были подобны тем, что описаны после одного DMH и несколько изменялись под влиянием антител.

Введение

р53-трансгенным мышам анти-р53 IgG, или моноклональных антител D01 и Pab 421 стимулировало селезеночную Т-систему, и поэтому могло уменьшить он-когенный эффект канцерогенных веществ.

Мы предполагаем, что введение анти-р53 IgG стимулирует продукцию антиидио-типических антител (АЬ2). Эти антитела — иммуноглобулины со специфичностью к детерминантам, расположенным в пределах переменной области специфичных к антигену антител (АЫ). Некоторые АЬ2 распознают идиотип в пределах участка объединения антигена и АЫ и могут имитировать пространственную структуру антигена, против которого АЫ были получены [102, 10, 11, 12]. Связанные с опухолью антигены (ОАА) часто экспрессируются в течение нормального эмбрионального развития и, возможно, представлены в нормальных тканях [34]. Как следствие, организм обычно толерантен к ОАА и эффективного антиопухолевого иммунного ответа не наблюдается. На основании полученных результатов нами был предложен новый подход для стимулирования противоопухолевого иммунного ответа к ОАА с использованием иммуномиметических молекул — антиидиотипических антител — АЬ2 [129, 10, 11, 12]. АЬ2 вступают в реакцию с участком антител, направленных против ТАА, и могут воспроизводить «внутренний образ» антигена [39]. Недавние эксперименты показали, что АЬ2 могут вызывать антиопухолевый эффект, непосредственно подавляя рост ОАА-экспрессирующих раковых клеток, или активируя иммунный противоопухолевый ответ через индукцию следующего поколения антител (АЬЗ) [30].

Можно предположить, что анти-р53 IgG стимулирует генерацию антиидиотипических антител по пути, подобному описанному в литературе [129, 39, 30, 10, 11, 12]. Аналогичный эффект эндогенных антиидиотипических антител был найден (Ter-Grigorov, 1992) в экспериментах с иммунизацией мышей, инфицированных вирусом (Rauscher) лейкоза, аутоантителами против Н-20Ь антигена [142]. Были получены антиидиотипиче-ские человеческие антимышиные антитела, индуцированные при иммуносцинтиографии с мышиными Анти-СА 125-моноклональными антителами, которые продлевали жизнь пациентам с карциномой яичника [30].

Хотя р53 не относится к поверхностным антигенам клетки, олигопептидные фрагменты этого белка, в комплексе с антигеном гистосовместимости первого типа, пре-зентируются на клеточной поверхности и становяться мишенью для атаки СВ25+Т-лимфоцитов [44, 144]. В нормальных условиях концентрация белка р53 в тканях ничтожна, и его распад по убиквитиновому пути приводит к полной элиминации. При ма-лигнизации происходит нарастание уровня р53 за счет большей устойчивости мутантно-го р53, при этом его синтез снижается. Ситуация резко меняется при введении антител к белку р53. Возрастает экспрессия промотора, что является показателем усиления транскрипции специфической мРНК с последующим ускорением трасляции белка р53. Это, в свою очередь, приводит к образованию избыточного количества олигопептидов и их презентации в комплексе с МНС-1, по общепризнанным механизмам. Хотя в нашем распоряжении нет фактов, непосредственно подтверждающих противоопухолевое действие таких лимфоцитов, обнаружение массивной инфильтрации С025+Т-лимфоцитами может косвенно свидетельствовать об этом.

Теоретическая и практическая значимость результатов экспериментального исследования состоит в том, что впервые было проведено комплексное изучение противоопухолевого действия анти-р53-антител. Полученные данные о резком возрастании содержания белка р53 в злокачественных тканях при введении анти-р53 -антител могут служить основой для разработки принципиально новых методов экспериментальной терапии злокачественных опухолей.