Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализа

Актуальность темы

В связи с интенсивным развитием промышленного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных инфекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Своевременный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемлемой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.

Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе. Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы по-прежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуноферментного анализа (ИФА) занял ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода заключаются в скорости постановки, чувствительности, специфичности, безопасности, возможность автоматизации процесса. Коммерческие наборы для ИФА нашли широкое применение в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Европы и Америки.

В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве были предприняты попытки модернизации серологической диагностики с применением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тестируемых проб и уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследовании проб сывороток крови птиц в одном разведении. [307, 308,273].

Крупнейшие фирмы — производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц (IDEXX (США), Synbiotics (KPL, CII1A), Guildhay (Великобритания), Biochek (Голландия)) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg Т) от величины логарифма S/P отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля).

Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофотометров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном формате, позволило разработать методологию тестирования большого количества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода оптической плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматической обработки, хранения и создания баз данных [307].

Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мониторинг болезней списка МЭБ (особо опасных) и экономически значимых болезней кур — ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекционного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycoplasma synoviae (МС), которые определили перечень создаваемых отечественных диагностических тест-систем.

Гибель птиц при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может достигать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально зарегистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, www.oie.int), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа H5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2,8 млн. голов птицы.

С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать 90% [104], при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии [287]. Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ИБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам [87, 326].

Реовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного и кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени реовирус и M. synoviae, составляют от 80 до 120 млн. долларов [88].

Экономический ущерб от болезней, вызываемых M. gallisepticum и M. synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цыплят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят [217, 204].

В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения, яйценоскости -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца [130, 131].

Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20−50% [98, 99].

Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА. Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла необходимость разработать универсальную компьютерную программу, в которой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спектрофотометрами-ридерами разных производителей.

Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов зарубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является важной задачей.

Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каждым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к технологии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабораториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга [105, 242] с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» технологий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследований и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повышения производительности и безопасности работы персонала.

Цели и задачи исследований. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на основе иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

— усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;

— оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфических контрольных положительных сывороток;

— разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в одном разведении;

— определить чувствительность и специфичность при сравнительном анализе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;

— определить диагностическую значимость результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпизоотической ситуации в птицехозяйствах и оценке иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин;

— разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб);

— разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов отечественных и зарубежных фирм-производителей;

— разработать технологию производства коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств;

— провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;

— внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик комплексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизированного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.

Научная новизна. Впервые разработаны отечественные иммуноферментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в одном разведении.

Впервые в России создана комплексная система серологического мониторинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение надежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.

Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности реакций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.

Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицеводстве.

Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирм-производителей.

Утверждена научно-техническая документация и регламент для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: при визуальной детекции и инструментальном учете с применением программного обеспечения.

Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено результатами международных сравнительных испытаний, проведенных аккредитованной лабораторией (СО, Голландия) в 2006;2008 гг. при тестировании зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.

Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистрированную в Российском агенстве по патентам и товарным знакам.

Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом» (1998 г.) и «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций» (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных.

Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ныокаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 495 527−542 006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0043−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 495 527−0055−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0042−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 495 527−0057−2006 от 29.12.2006) и при тестировании в одном разведении (СТО 495 527−0044−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 495 527−0045−2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388−133−495 527−2005 от 15.02.2006) — наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 495 527−0056−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0041−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 495 527−382 006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388−117−495 527−2005 от 30.05.2006) — наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза (Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 495 527−0109−2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0111−2009 от 31.03.2009) — набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0034−2006 от 29.12.2006) — набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0086−2008 от 09.12.2008).

На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение с 1997 по 2009 г. г. было произведено около 21 000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 81 научная работа, в том числе 22 — в изданиях, рекомендованных в перечне ВАК РФ.

Апробация работы. Основные материалы исследований по теме диссертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, проводимых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997;2000, 2003, 2008) — на международной конференции «Птицеводство — мировой и отечественный опыт», Москва, 2002; на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий — субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабораторно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004; международных ветеринарных конгрессах по птицеводству, Москва, 2005, 2006; на международных научных конференциях и конгрессах в Российской Федерации (Москва, 2001; Казань, 2005; Покров, 1999, 2000; Новосибирск, 2008), в Украине (Харьков, 2001;2003, 2006;2008; Крым, 20 062 008), Казахстане (Алматы, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000; Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995;2009 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

— разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения антител к возбудителям девяти экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;

— результаты определения корреляционной зависимости при сравнении данных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тестов и коммерческих наборов зарубежного производства;

— программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов анализа «СИНКО-ИФА»;

— результаты исследований сывороток крови кур с применением разработанных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995;2008 гг.;

— результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006;2008 гг.;

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 41 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источников, из них 311 иностранных.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993;2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных, г. Владимир).

Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и анализе экспериментов. Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность: научному консультанту д.б.н., профессору Дрыгину В. В., д.в.н., профессору A.B. Борисову, д.в.н., профессору В. В. Борисову, д.в.н. Ирзе В. Н., к.в.н. Старову В. В., д.б.н. Пономареву А. П., к.б.н. Волковой М. А., к.б.н. Руниной И. А., к.б.н. Луговской H.H., к.в.н. Манину Т. Б., к.б.н. Оковытой Т. В., к.б.н. Куприянову, к.б.н. Меньщиковой А. Э., к.б.н. Колосову С. Н., к.б.н. Циванюк М. А, Зинковскому Ю. В., Хитровой JI. Б. и всем сотрудникам ФГУ «ВНИИЗЖ», участвовавшим в проведении отдельных этапов работы и оказывавших консультативную помощь.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.2. Общая характеристика (морфология, структура, химический состав, клинические признаки, иммунитет) возбудителей инфекционных заболеваний кур

Общая характеристика вируса ныокаслской болезни.

Ньюкаслская болезнь (НБ) — высококонтагиозное вирусное заболевание птиц, главным образом куриных, характеризующееся поражением органов дыхательного и пищеварительного трактов, центральной нервной системы. Первые вспышки ньюкаслской болезни были зарегистрированы в 1926 году на о. Ява (Индонезия) и в Англии (г.Ньюкасл), в настоящее время НБ широко распространена во многих странах Евразии, Африки и Америки [63, 64, 65, 293]. По данным Международного эпизоотического бюро только начиная с июня 2008 года по июнь 2009 были зарегистрированы вспышки в 87 странах мира [OIE, www.oie.intl, в том числе и в России.

В 60- ые годы эпизоотическая ситуация по ньюкаслской болезни в нашей стране характеризовалась увеличением количества неблагополучных пунктов с пиком заболеваемости в 1970;1971 гг. (более 400 вспышек). При этом заметно увеличилось количество хозяйств с бессимптомным течением НБ на привитом поголовье и проявлением чрезвычайно высоких титров специфических антител, снижением сохранности и продуктивности [36, 265].

Источником инфекции является больная птица. Резервуаром возбудителя служит домашняя птица других видов, а также дикие, синантропные и экзотические птицы [14,63]. Заражение происходит при контакте больной птицы со здоровой, а также опосредованно через воздух, воду, корм, перо, пух, одежду спецперсонала и т. п. [43].

Клинические признаки нъюкаслской болезни и патологоанатомические изменения. Ньюкаслская болезнь осложняется тем, что разнообразные изоляты и штаммы вируса могут индуцировать большое количество форм заболевания. Существует 5 форм болезни на основе клинических признаков у кур: висцеротропная велогенная, нейротропно-велогенная ньюкаслская болезнь, ньюкаслская болезнь, вызываемая мезогенными штаммами, лентогенными штаммами, которые обычно используются как живые вакцины и бессимптомная форма [239], главным образом, в виде кишечных инфекций без проявления болезни.

Как и клинические признаки, патологоанатомические изменения и их локализация по органам птиц, инфицированных ВНБ, зависят от штамма вируса, от хозяина и всех других факторов, которые могут воздействовать на тяжесть заболевания [53, 239].

Классификация и строение птичьих парамиксоеирусов. Вирус НБ (РМУ-1) относится к роду ЯиЬикупиз семейства Рагатухоутс1ае и по своему строению является классическим птичьим парамиксовирусом. Члены семейства Рагатухоут<�ЗаеРНКсодержащие вирусы со спиралевидной симметрией капсида с несегментированным одноцепочечным геномом негативной полярности. Они имеют оболочку, которая образуется из модифицированной клеточной мембраны по мере проникновения вируса через клеточную поверхность, после сбора капсида в цитоплазме [8].

Внешне вирус почти сферический, но часто встречается полиморфные формы. Размер сферических форм от 150 до 300 нм, нитевидных до 1000 нм. В двухслойной, содержащей липиды оболочке (толщина 10−15 нм), размещены 2 различные макромолекулы: гликопротеин гемагглютинин нейраминидазы (НИ) и гликопротеин слияния (Б) [255]. Гемагглютинин осуществляет прикрепление вириона к рецепторам клетки хозяина, содержащих нейраминовую (сиаловую) кислоту, а нейраминидаза разрушает рецепторы и тем самым помогает элюции вируса в процессе отпочковывания от клетки-хозяина. Б-белок осуществляет слияние с клеточной мембраной и несет ответственность за гемолиз и проникновение вируса в клетку [8,9]. Посттрансляционное расщепление белка предшественника БО на и Б2 осуществляется клеточными ферментами. Наличие дополнительных основных аминокислот на участке, кодирующем сайт разрезания белка Б, позволяет вирулентным штаммам вируса НБ пройти данное расщепление в присутствии широкого диапазона ферментов, тогда как для лентогенных изолятов требуются только трипсиноподобные протеазы [159]. Данное свойство широко используется для характеристики степени патогенности изолятов вируса ньюкаслской болезни [10, 11, 161, 162, 334].

Внутри вириона находится однонитевая, линейная, спиральная РНК диаметром 17−18 нм и длиной 1 мкм. Она содержит генетическую информацию для 6 структурных протеинов [196, 290, 359].

В окружающей среде вирус нестабилен, инактивация инфекционных свойств происходит при нагревании до 56−60°С (30−120 мин.) — рН 3- при прямом попадании солнечных лучей (максимально 30 мин.) — при применении альдегидов, поверхностно-активных веществ, полиаминов, соединений хлора, спиртов, фенолов, органических кислот, препаратов, расщепляющих кислород, йодоформа [45].

Иммунитет и специфическая профилактика. Способность ВНБ и других птичьих парамиксовирусов гемагглютинировать эритроциты связана с феноменом образования комплекса между НЫ протеином и рецепторами на поверхности эритроцитов. Эта особенность и специфическая ингибиция агглютинации антисыворотками имеет большое значение в диагностике заболевания.

В сыворотке крови птиц антитела появляются на 6−10 день после заражения, а их наивысший титр наблюдается на 3−4 неделю [43]. Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, продолжительность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм [43]. Так как титр антител, определенный в реакции нейтрализации (РН) сопоставим с титрами в РТГА, последняя реакция часто использовалась для оценки защитного ответа, особенно после вакцинаций [67]. Антитела, направленные против одного из двух функциональных поверхностных гликопротеидовЫМ и Б полипептидов, могут нейтрализовать вирус НБ, тем самым, вызывая защиту против инфекции [247, 294, 295, 296]. Несушки с антителами к вирусу НБ передают пассивный иммунитет цыплятам через яичный желток [63, 67]. Материнский иммунитет является защитным, и таким образом должен приниматься во внимание при разработке графика вакцинации цыплят.

Эпизоотическое благополучие птицеводческих хозяйств обеспечивается за счёт применения вакцин. В идеале, вакцинация против НБ должна приводить к иммунитету против заражения и размножения вируса. Реально, птица защищена от проявления клинических признаков болезни, но не от репликации вируса и его распространения [271, 272, 282, 283].

Живые вакцины против ВНБ делятся на две группы — лентогенные и мезогенныепоследние по настоящему пригодны только для вторичной вакцинации птиц по причине своей высокой вирулентности. В первую группу относятся такие штаммы как Ла-Сота, Бор-74, Бор-82, Р, В1, У4, во вторуюН, Мик^еБхуаг, Кошагоу, Лоакт. Главное преимущество живых вакцин в том, что они создают напряжённый иммунитет в сжатые сроки, а также применяются массовыми методами. Одним из самых широко распространённых способов вакцинации является выпойка [63, 269].

Преимуществами инактивированных вакцин являются: очень низкий уровень побочных реакций у вакцинированной птицывозможность использования в ситуации, непригодной для применения живых вакцин, особенно при наличии коинфекцийвозможность достижения очень высоких защитных титров антител на длительное время. На инактивированные масляноэмульсионные вакцины не оказывает значительного влияния материнский иммунитет и они могут быть использованы на однодневных цыплятах и взрослой птице независимо от иммунного фона [67]. К недостаткам инактивированных вакцин можно отнести их дороговизну в производстве и трудоёмкость при применении. В Российской Федерации иг странах СНГ меры борьбы с НБ основаны на комплексном применении живых и инактивированных вакцин. При этом в последнее время наблюдается тенденция отказа от применения вакцинных препаратов по жёстким схемам и переход на корректировку сроков иммунизации в зависимости от результатов серологических исследований.

Общая характеристика вируса гриппа птиц.

Грипп птиц (ГП) — заболевание, известное также под названием классическая чума птиц, вызывается вирусами, относящимися к семейству ОЛотухоушёае, типу А. Наиболее восприимчивыми к вирусу гриппа являются куры и индейки. Патогенность вирусов гриппа птиц в значительной степени варьирует в зависимости от подтипа, зависит от генетической принадлежности вируса и вида хозяина. Вирусы гриппа всех подтипов широко распространены среди диких водных птиц. [134, 135, 274, 313, 314, 342].

Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) подтипов Н5 и Н7 наносит громадный экономический ущерб промышленному птицеводству [41, 42]. Считается, что эти два подтипа вируса гриппа птиц представляют опасность, даже если их инфекция у домашней птицы протекает бессимптомно или в легкой форме. [60, 61, 230]. На протяжении последних десяти лет ситуация по гриппу птиц в мире значительно осложнилась. Значительные экономические потери имели место в промышленном птицеводстве различных стран. Так в 2005 г. потери в сельскохозяйственном секторе стран Азии оценивались приблизительно в 10 млрд. долларов. Впервые вспышки гриппа птиц H5N1 были зарегистрированы в России в июле 2005 г. в Новосибирской области. По данным Россельхознадзора с 2005 г. по 2008 г., было зарегистрировано 179 очагов заболевания гриппом птиц H5N1 в 20 субъектах Российской Федерации и суммарные потери в птицеводстве составили более 2,8 млн. птиц.

Вирусы гриппа типа, А разделены на подтипы, основанные на антигенном родстве поверхностных гликопротеинов, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). В настоящее время существует 16 НА подтипов (HIHI 6) и девять подтипов NA (N1-N9). Вирусы гриппа поражают различные виды птиц [59,113, 135, 235, 278, 298, 331,334], включая диких, домашних и декоративных и были выделены от представителей большинства семейств диких птиц во всем мире. По последним данным вирус был выделен от 105 видов диких птиц, относящихся к 26 семействам [298, 275, 339].

Механизм передачи вирусов гриппа от одной птицы к другой и способность вызывать инфекцию еще не достаточно хорошо изучены. В результате ряда экспериментов для оценки путей передачи вирусов НПГП и ВПГП среди домашней птицы было выяснено, что эти механизмы чрезвычайно сложны и зависят от штамма вируса, вида птицы, и экологических факторов [235, 264, 146, 335, 279, 349].

Морфология, структура, химический состав Популяция представлена главным образом сферическими структурами диаметром 80−120 нм (Болезни, 2003). Однако нередко встречаются нитевидные формы с тем же диаметром и различной длиной [5]. Молекулярная масса вирионов составляет 270Т06−290−106 дальтон [5, 45]. Нуклеокапсид вириона — спирально организованный рибонуклеопротеид, состоящий из однонитчатой РНК в комплексе с белком и содержащий также минорные белковые компоненты (РВ1, РВ2 и РА). На поверхности вирусной частицы расположены шиловидные отростки (гемагглютинин и нейраминидаза), погруженные в двойной липидный слой. Между билипидной оболочкой и нуклеокапсидом расположен матриксный белок [5, 22].

Вирнонная РНК представлена 8 фрагментами [21, 22] с молекулярными массами от 3-Ю5 до МО6 дальтон, составляющими в сумме 4,9−106 дальтон [21, 22]. В общей сложности геном вируса гриппа содержит информацию для синтеза 10 белков [22, 28].

Гемагглютинин — один из двух поверхностных гликопротеидов вируса гриппа, составляющий 30−34% массы всех белков вириона. Посттрансляционное расщепление его на 2 фрагмента: НА1 (тяжелая цепь) и.

•Э <7.

НА2 (легкая цепь) с молекулярными массами 46−10 -47−10 и 28−10 -29−10 дальтон соответственно, осуществляется клеточными протеазами [46, 93]. Расщепление гемагглютинина необходимо для инициации инфекции [45]. Второй гликопротеид — нейраминидаза, является высокоспецифичным ферментом, расщепляющим гликозидную связь N-концевого остатка ацетилнейраминовой кислоты с остальной частью рецептора. Функционирование нейраминидазы необходимо для освобождения вирусных частиц из инфицированной клетки [26, 62, 164], предотвращения их агломерации и, возможно, для эффективного расщепления гемагглютинина [62].

Белки полимеразного комплекса: РВ1, РВ2 и РВА (молекулярная масса — от 84−10 до 96−10 дальтон) составляют 1,1−2,2% массы всех полипептидов вириона. Вероятно, белки РВ1 и РА вовлечены в синтез комплиментарной, а РВ2 — вирионной РНК [93]. о.

Белок NP с молекулярной массой 55−10 дальтон [гп35], составляющей до 20% массы белков, является структурной основой рибонуклепротеида. Он участвует в репликации вируса [93].

До 35% массы всех белков вирусной частицы приходится на долю о матриксного белка М1. Его молекулярная масса — 28−10 дальтон [93]. Этот полипептид играет основную роль в поддержании структуры вириона. Неструктурные вирусспецифические белки NS1 и NS2 с молекулярными массами 11−103 и 25-Ю3 дальтон [124], вероятно, входят в состав репликативного комплекса и/или участвуют в регуляции белкового синтеза [124, 261]. Эти белки можно выявить в инфицированной клетке, a NS1 связан с включениями в цитоплазму [93]. Наибольшей чувствительностью для действия вируса обладают клетки органов дыхательной и пищеварительной систем. Впоследствии вирус может распространяться по всему организму и поражать поджелудочную железу, почки, сердце и мозг. В течение адсорбционной фазы НА связывается с гликопротеиновыми рецепторами, содержащими сиаловую кислоту на поверхности клетки. Гемагглютинин вируса постоянно видоизменяется, что позволяет ему связываться с различными типами сиаловой кислоты, продуцируемой клетками людей и птиц [218].

Вирусы низкопатогенного гриппа птиц (НПГП) кур и индюков подтипов Н5 и Н7, без принятия соответствующих мер по ликвидации инфекции, в конечном счете, меняли свои свойства и становились высокопатогенными (штат Пенсильвания, США, 1982;83- Мексика, 1994; Италия, 1999;2000). Изменение патогенности вируса связанно с приобретением дополнительных основных аминокислот на сайте разрезания гемагглютинина [299]. В лабораторных условиях после проведения 24 пассажей в цыплятах был получен вирус ВПГП из вируса НПГП подтипа Н5, выделенного от водоплавающей птицы. Установлено, что низкопатогенные вирусы гриппа птиц на сайте разрезания НАО имеют одну основную аминокислоту — аргинин, в то время как вирусы ВПГП имеют несколько основных аминокислот (аргинин и лизин), расположенных недалеко от сайта нарезания и способных расщепляться обычными протеазами [342].

Вирус гриппа может оставаться инфекционным в воде озера в течение 4 дней при 22 °C и более 30 дней при 0 °C. При температуре 55 °C вирус ГП инактивируется за 1 ч, при 60 °C — за 10 мин, при 65−75°С — за 2−5 мин. При низких температурах и в лиофилизирванном состоянии (при минус 30 °C в запаянных ампулах в темном месте) сохраняется до 2-х лет.

Гемагглютинирующая и инфекционная активности вируса обычно сохраняются при минус 60 °C несколько лет, а при 4 °C — несколько недель. [45].

Антигенная вариабельность Вирусам гриппа свойственна необычайно высокая частота рекомбинаций (до 25—32% общего урожая смешанной популяции) и высокая пластичность, что выражается как в их способности к адаптации, так и к естественной изменчивости [274]. Изменения могут происходить двумя способами — дрейфом и шифтом. Антигенный дрейф приводит к незначительным антигенным изменениям в НА и/или ЫА. Антигенный шифт несет ответственность за основные антигенные изменения в НА и/или ЫА. При антигенном дрейфе происходят точечные мутации в генах, несущих информацию о белках НА и/или ЫА. Он ответственен за выбор новых вариантов в иммунной популяции. Антигенный дрейф ярче всего проявляется среди вирусов гриппа человека. Однако известно, что это возможно также и для штаммов птиц. [43].

Патогенез и патоморфологические изменения Вирусы Н5Ш могут проникать в организм хозяина аэрозольно через органы дыхательной системы или орально-фекальным путем через пищеварительный тракт [230]. Продолжительность инкубационного периода болезни обычно составляет от суток до трех недель [45]. Птицы, зараженные вирусом гриппа, показывают разнообразие клинических признаков, которые могут включать в себя изменения в функционировании дыхательной, пищеварительной, репродуктивной, или нервные систем. Пораженные вирусами гриппа птицы могут иметь один или комплекс клинических признаков. В некоторых случаях инфекции вирусами ВПГП, заболевание может быть настолько острым, что птицы находят мертвыми без каких-либо видимых клинических признаков. [20].

Эпизоотологические данные. Филогенетические исследования вирусов ГП, выделенных от домашних или диких птиц показали, что различное происхождение основано на географии, а не на времени появления или виде хозяина. Например, вирусы подтипа Н7 делятся на американские, евразийские, австралийские изоляты, а также вирусы лошадей подтипа Н7 [235]. Сходные данные были получены для вирусов ГП подтипа Н5 [264]. Частота, с которой вирусы НПГП или ВПГП появляются и распространяются среди домашней птицы, зависит от уровня биобезопасности и концентрации домашней птицы вблизи первичных вспышек. Хотя водоплавающая птица и другие дикие птицы в большинстве случаев, прямо или косвенно, ответственны за распространение гриппа среди домашней птицы, не исключены также и другие способы передачи.

Иммунитет, лечение и профилактика Так же как и вакцинация, заражение вирусами ГП стимулирует гуморальный иммунный ответ и приводит к выработке антител на системном и мукозальном уровнях [149, 269]. Интенсивность гуморального иммунного ответа варьирует в зависимости от вида птицы. Количество антител к вирусу ГП уменьшается у разных видов птиц в следующем порядке: куры, фазаныиндейкиперепелаутки.

Антитела против поверхностных белков являются нейтрализующими и протективными. Защита, прежде всего, связана с антителами к гемагглютинину. Однако антитела к нейраминидазе также снижают проявление клинических признаков и соответственно уровень смертности после заражения вирусами ВПГП, имеющими гомологичный ИА подтип. Продолжительность иммунитета вариабельна и зависит от многих факторов.

Хотя и считается, что вакцинация является наиболее эффективной профилактической мерой для контроля инфекции гриппа, развитые страны должны стремиться к уничтожению вспышек вируса ГП без использования вакцин. В настоящее время наибольшее распространение получили инактивированные вакцины. Как правило цельновирионную вакцину получают из инактивированной формальдегидом или (З-пропиолактоном аллантоисной жидкости зараженных вирусом гриппа куриных эмбрионов. Для получения субъединичной или сплит-вакцины очищенный вирус обрабатывают эфиром или детергентом. Иммунизацию инактивированными вакцинами проводят внутримышечно или подкожно. При разработке вакцин [134], использующих методы генной инженерии, учитывали, что патогенность вирусов гриппа в первую очередь определяется способностью разрезания гемагглютинина.

Живые гриппозные вакцины вызывают системный и местный мукозальный иммунный ответ, включающий в себя выработку секреторного иммуноглобулина A (IgA) в дыхательных путях, которые являются основным порталом для проникновения вируса в организм. Они также ответственны за выработку клеточного иммунитета, который осуществляет лучшую защиту по сравнению с инактивированными вакцинами. Живые аттенуированные вакцины осуществляют более широкую защиту против. вирусов, подвергшихся антигенному дрейфу. В настоящее время использование при пандемиях живых гриппозных вакцин ограничено возможностями производства. Недавно были разработаны аденовирусные векторные вакцины Н5 с низким уровнем репликации, имеющие хорошие гемагглютининспецифичный гуморальный и клеточный иммунные ответы, дающие протективный эффект при заражении гомологичным и антигенно отличным штаммами H5N1 у мышей и у цыплят [149, 173].

Без сомнения, при правильном использовании, в комплексе с другими мерами, такими как повышение биобезопасности, отказ от применения вакцин может быть мощным инструментом в уничтожении инфекции ГП. Существует опасность, что некачественная вакцинация может привести к уменьшению проявлений болезни, не затрагивая передачу, приводя к появлению эндемичных вирусов. В Мексике вирус ВПГП был уничтожен, но вирус НПГП H5N2 продолжал циркулировать, несмотря на использование более чем 3 миллиардов доз вакцины. Через 10 лет у вируса наблюдали значительные антигенные отличия от исходного и вакцинного штаммов вируса [214]. В Пакистане в 2004 г. все еще выделяли вирусы ВПГП H7N3 генетически близкие к исходному вирусу ВПГП [98, 99, 262, 263].

Общие характеристика вируса инфекционной бурсальной болезни.

Инфекционная бурсальная болезнь (инфекционный бурсит, болезнь Гамборо) — широко распространенное высококонтагиозное заболевание, поражающее цыплят в возрасте 2−22 недельного возраста [43, 311]. Инфекционное заболевание с признаками поражения фабрициевой сумки (клоакальной бурсы) и других органов впервые зарегистрированноу в 1957 г. в местечке Гамборо, штат Делавар, США, в дальнейшем было определено как «болезнь Гамборо» или «бурсальная болезнь» [43]. В начале 1960;х гг. инфекционная ' бурсальная болезнь (ИББ) регистрировалась во многих птицеводческих хозяйствах США и Англии. В 1972 г. для вируса ИББ было показано характерное свойство — способность вызывать у инфицированной птицы иммунодепрессию, что обусловило особое внимание к этой болезни [68]. К середине 1970;х гг. диагноз на ИББ был подтвержден в большинстве стран с развитым птицеводством, включая Австралию [211].

В связи с созданием достаточно эффективных препаратов специфической профилактики [156, 158, 167, 327]. к настоящему времени ИББ не проявляется в виде эпизоотии. Однако, во всех хозяйствах, где ранее был поставлен положительный диагноз на ИББ постоянно осуществляется вакцинация.

Возбудителем ИББ является РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Birnaviridae роду Avibirnavirus, который не обладает внешней липопротеидной оболочкой, имеет икосаэдрический капсид диаметром около 50 нм, состоящим примерно из 132 белковых морфологических субъединиц [108, 122]. Геном вируса представлен двумя сегментами (А и В) двуцепочечной РНК, которая составляет 9−10% от веса вирусной частицы. Размеры сегментов — 3129 и 2795 пар нуклеотидов для, А и В, соответственно [122].

Структура вириона включает четыре полипептида: Vpl (94 кДа), который является РНК-зависимой РНК-полимеразойосновной структурный белок Ур2 (54 кДа), содержащий эпитопы для вируснейтрализующих антителструктурный белок УрЗ (30 кДа), несущий группо-специфические антигены, и Ур4 (29 кДа), который является вирусной протеазой. Кроме того, имеются сообщения о положительно заряженном минорном полипептиде Ур5 с неизвестной функцией [122, 259, 260]. о.

Молекулярная масса вириона составляет 55×10 кДа, плавучая плотность полных вирионов в градиенте хлористого цезия — 1, 33 г/см [259]. Вирус ИББ достаточно термостабилен и не инактивируется при 60 °C в течение 30 минпри 25 °C сохраняет активность в течение 21 дняустойчив в диапазоне рН от 3 до 9- устойчив к хлороформу, не изменяет инфекционных свойств при воздействии 0,5% раствора формалина в течение 6 часов [43].

Для вируса ИББ установлены два серотипа (I и II), внутри которых идентифицировано определенное число субтиповых антигенных вариаций [183, 185]. Считается, что антигенные свойства вируса в основном определяются полипептидом УР2 [238].

Большинство природных изолятов, выделенных от цыплят, отнесено к серотипу I, изоляты выделенные от индеек, классифицированы как серотип II [186]. В ИФА и иммунофлуоресцентном тесте для серотипов вируса ИББ показано наличие общих антигенов [183, 186], которое, однако, не подтверждается, ни в реакции нейтрализации, ни в иммунологическом исследовании при перекрестном испытании на цыплятах [82].

Патогенез и клинические признаки болезни. Вероятно, что в естественных условиях инфекционная бурсальная болезнь, в основном, передается алиментарным путем. Мишенью вируса являются В-лимфоциты, на поверхности которых находятся иммуноглобулины класса М и макрофаги [227], поэтому, наиболее характерные патологические изменения происходят в фабрициевой сумке. В итоге происходит дистрофия фабрициевой сумки и потеря главной ее функции — воспроизводства иммунокомпетентных клеток. Некроз лимфоидных клеток, несколько меньшей степени, отмечен в селезенке, тимусе, гардеровой железе и др. органах [43].

Клинические признаки болезни проявляются через 2−3 дня после заражения. В инфицированном стаде наблюдают: угнетение птиц, отказ от корма, диарею, загрязнение и взъерошенность перьев, а затем, в более поздней стадии — нарушение координации движений. Больные птицы имеют пониженную температуру тела [227]. Типичная клиническая форма заболевания наблюдается у птиц в возрасте 3−6 недель. С увеличением возраста восприимчивость к заболеванию снижается [43].

Птицы, перенесшие инфекцию в субклинической форме, приобретают иммунодепрессию, которая выражается в снижении гуморального и клеточного иммунитета, что, в конечном счете, ведет к возрастанию заболеваемости птиц гепатитом кокцидиозом, болезнью Марека, геморрагической анемией и гангренозным дерматитом, инфекционным ларинготрахеитом, инфекционным бронхитом, сальмонеллезом и колибактериозом [288, 346].

Эпизоотология. Заболеванию подвержены куры всех пород. Однако? отмечено, что птицы яйценоских пород более чувствительны к заражению, чем породы мясного направления. Например, цыплята кросса Белый леггорн переболевают особенно тяжело с высоким летальным исходом [250]. Болезнь проявляется внезапно, охватывая практически все восприимчивое поголовье. При клинической форме заболевания летальность может достигать 20−30% [227], а некоторые высоковирулентные штаммы вызывают и 90% отход птиц [104, 145, 311, 317].

Иммунитет и специфическая профилактика. Естественное заражение, переболевание или вакцинация, как живой, так и инактивированной вакциной обуславливает выработку у птиц активного иммунитета. Вирус ИББ обладает высокой антигенностью [43]: полипептид УР2 индуцирует вируснейтрализующие антитела, обеспечивающие эффективную защиту организма от инфекции вирулентного агента [187, 227].

Установлена трансовариальная передача материнских антител против вируса ИББ. Поэтому одним из наиболее рациональных подходов для защиты цыплят от заболевания в раннем возрасте является создание у молодняка высокого уровня пассивного иммунитета путем вакцинации кур-несушек. [92, 304, 312, 329, 243]. В настоящее время признано, что наиболее надежным направлением в ликвидации инфекционной бурсальной болезни является комплексное применение живых и инактивированных вакцин. Как правило, инактивированными вакцинами иммунизируют птиц в возрасте 110−120 дней, у которой уже присутствует определенный уровень гуморального иммунитета, приобретенного после применения живых вакцин [2, 43]. Инактивированная вакцина при внутримышечном введении позволяет получить у птиц родительского поголовья высокий и довольно однородный уровень антител с длительным сроком циркуляции [2,43]. Установлено, что при вакцинации родительского поголовья у 80−100% цыплят в сыворотках крови присутствуют материнские антитела, которые способны защитить их от естественного и экспериментального заражения [43].

Общие характеристика вируса инфекционного бронхита кур

Инфекционный бронхит кур (ИБК) — острое респираторное, высококонтагиозное заболевание, вызываемое вирусом, относящимся к семейству Coronaviridae, который включает два рода: Coronavirus и Torovirus [102, 180]. Род Coronavirus объединяет в себе вместе с вирусом ИБК также коронавирусы индеек и, по крайней мере, девяти видов млекопитающих.

Впервые «новая респираторная болезнь цыплят» была выявлена в США в штате Северная Дакота в 1930 году. Schalk & Hawn в 1931 году описали клинические проявления заболевания и дали ему название инфекционного бронхита. Заболевание получило широкое распространение во всем мире [111, 132]. В США, начиная с 50-х годов, в добавление к уже известному типу Массачусетс были идентифицированы еще несколько серотипов [153]. В Европе с 1940 года выделяли штаммы типа Массачусетс, а также штаммы других серотипов, отличных от североамериканских [224]. Получено несколько изолятов нефропатогенных штаммов вируса ИБК в Австралии [297]. На территории бывшего Советского Союза ИБК впервые был зарегистрирован в 1982 году у цыплят, завезенных из Венгрии, когда из легких павших птиц выделили антигенно родственный серотипу Массачусетс вирус. В дальнейшем ИБК распространился и на другие бройлерные фабрики страны [13].

Инфекционный бронхит кур является источником проблем в промышленном птицеводстве, так как вызывает падеж птицы, особенно молодняка, снижение яйценоскости кур-несушек и ухудшение качества яиц.

Наибольшая смертность наблюдается у цыплят 1−30-дневного возраста, обычно в пределах 10−35%. При циркуляции нефропатогенных штаммов падеж составляет 57−70% от общего поголовья птицы [43, 180].

У кур старше 6 месяцев ИБК может вызывать длительное снижение яйценоскости на 30−80%, которая со временем восстанавливается, но не достигает прежнего уровня [43]. Куры, перенесшие заболевание в возрасте менее двух недель, в период половой зрелости не могут нестись нормально и становятся «ложными несушками». Яйца больных кур имеют мягкую тонкую или грубую деформированную скорлупу.

Морфология. Структура. Химический состав Вирион ИБК представляет собой плеоморфную частицу, обычно округлой формы, приблизительно 120 нм. Вирус инфекционного бронхита содержит одноцепочечную РНК положительной полярности, которая кодирует три структурных белка. Пепломерный «S» гликопротеин локализуется на поверхности вириона и состоит из двух субъединиц S1 и S2 с молекулярным весом 92К и 84К, соответственно. Мембранный «М» гликопротеин с молекулярным весом в пределах от 23К до 36К частично находится на поверхности вириона. Нуклеокапсидный «N» белок, фосфорилированный нуклеопротеин, имеет молекулярный вес 52К и размещается внутри вириона, окружая молекулу РНК [102, 316].

Гликопротеин выполняет несколько различных биологических функций. Эпитопы на белках 82 и N в одинаковой степени консервативны и поэтому дают перекрестную реакцию антител, в то время как эпитопы на белке гораздо менее консервативны [102]. Показано, что антитела на белки 81, 82 и N появляются одновременно и детектируются в иммуноферментном анализе (ИФА) через две недели после введения живой вакцины вируса ИБК, что также совпадает с появлением вируснейтрализующих антител. Белок 82 имеет участок на 1Г-конце аминокислотной последовательности, который, по данным ЬепБ^а 1.А. е1 а1. (1989), является иммунодоминантным районом [215]. Коронавирусы прикрепляются к рецепторам клеток-мишеней своими пепломерами. При репликации вирионы отпочковываются от мембран шероховатого эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, при этом белки клетки-хозяина исключаются из вирионов и заменяются вирусными гликопротеинами. Вирусные частицы скапливаются в местах, недосягаемых для иммунной системы животного, чем объясняется длительная персистенция вируса в организме, обладающем иммунитетом.

Большинство штаммов инактивируются при 5б°С в течение 15 минут, при 45 °C — в течение 90 минут. Лиофилизованные вируссодержащие аллантоисные жидкости в запаянных под вакуумом ампулах не теряли инфекционности в течение 30 лет [102]. Все штаммы вируса ИБК относительно устойчивы к кислой среде до рН 3.0 и чувствительны к щелочной среде с рН 11.0.

Классификация шталтов Наиболее распространено классифицирование вирусов по серотипам. Главный антигенный домен, определяющий серотип вируса, находится на субъединице 81 [102, 84]. Штаммы вируса ИБК, имеющие ограниченное число аминокислотных замен в белке 81, при проведении реакции серонейтрализации могут быть отнесены к различным серотипам. Показано, что точечные мутации могут приводить к возникновению новых полевых вариантов вируса ИБК [190]. Однако основным механизмом возникновения вариантных штаммов вируса ИБК является рекомбинация [207]. Этому может способствовать применение для вакцинации более чем одного штамма вируса, или совместная репликация вакцинного вируса и полевого [118].

К настоящему времени уже идентифицировано свыше 30 серотипов, которые условно можно разделить на три группы: американские, европейские, австралийские. К американским относятся такие серотипы, как Massachusetts, Connecticut, Iowa 97 и Iowa 609, Gray, Holte, SE 17, Arkansas, California, Florida, варианты a, b, с, d, e, f, Delaware, PP14. Европейские серотипы — A (Mass), В (D207), С (D212), D (D3128), Е (D3896), UK7918/67, UK/82, UK/84, UK/86, 793/B. Австралийские серотипы — A (Vac-1), В (Ql/76), С (N1/62), D (N9/74), E (Ql/73), F (V2/71), G (Vl/71), H (N1/75), I (N2/75), J (N3/62), К (Tl/82), L (N1/88), M (Q3/88), N (N25/87), О (V18/91) [7].

Однако исследование только антигена не устанавливает иммунологического родства между штаммами. Изоляты вируса ИБК, идентифицированные вирусной нейтрализацией, как принадлежащие к разным серотипам, могли вызывать частичную или полную перекрестную защиту [117, 118]. При вакцинации штаммом HI20 наблюдали 30 000-кратное снижение титров вируса штамма Т, использованного для контрольного заражения, хотя вируснейтрализующий тест in vitro не определил серологического родства между этими штаммами [119].

Патогенез и эпизоотология заболевания Штаммы вируса ИБК обладают ярко выраженным тканевым тропизмом. Спектр воздействия вируса на организм птиц очень широкий и не ограничивается респираторным трактом. Верхние дыхательные пути — основное место размножения вируса ИБК, за которым следует виремия (попадание вируса в кровь), и вирус получает широкое распространение в других тканях [102, 119]. Вирус является, в основном, эпителиотропным.

Клиническими проявлениями ИБК при поражении респираторного тракта являются одышка, кашель, трахеальные хрипы, носовые выделения.

Смертность обычно низкая и вызывается асфиксией, обусловленной блокированием нижней трахеи или бронхов пробками слизи [119]. У несушек снижение яйценоскости, изменения в скорлупе и ухудшение качества яиц могут сопровождаться слабыми респираторными симптомами, иногда респираторная клиника отсутствует. Некоторые штаммы вызывают только изменения в окраске скорлупы. У кур, инфицированных вирусом ИБК штамма М41, вирусный антиген обнаруживался в эпителии яичников между 6 и 9 днями после заражения. [102].

Нефропатогенные штаммы вызывают первоначально респираторные симптомы с признаками почечных повреждений (повышенное потребление воды и жидкий помет). Несколько штаммов вируса ИБК изолированы из железистого желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника [84].

Распространение инфекции может происходить как горизонтальным, так и вертикальным путем. Основным источником инфекции служат больные и переболевшие цыплята и куры, которые выделяют вирус во внешнюю среду или остаются носителями до 49−105 дней после переболевания. Степень устойчивости и восприимчивости кур к вирусу инфекционного бронхита зависит от возраста птицы, пола, иммунного статуса, питания, окружающей среды и др. [69, 111]. Показано, что наиболее выраженный синергизм обнаруживается при совместном протекании ИБК и сопутствующих инфекций таких, как микоплазмоз, болезнь Ньюкасла, инфекционный ларинготрахеит кур, инфекционный колибактериоз [43].

Иммунитет и специфическая профилактика При переболевании ИБК и иммунизации развивается общий и тканевый иммунитет с соответствующим клеточным и гуморальным ответом. У птиц обнаруживается хороший гуморальный ответ на вирус ИБК, который можно оценить в ИФА, в реакции торможения гемагглютинации [115] уже на 4 день после заражения или в реакции нейтрализации вируса.

Вирусспецифические антитела осуществляют защиту эпителия трахеи после заражения, и, вероятно, предотвращают распространение вируса из трахеи к другим чувствительным органам таким, как почки и яичники. [160]. Специфические к вирусу ИБК IgA и IgG обнаруживаются в трахеальных смывах инфицированных кур [117]. Переболевшая птица устойчива к заражению гомологичным вирусом в течение 5−6 месяцев [119].

Для специфической профилактики применяют живые и инактивированные вакцины, особенно эффективны эмульгированные вакцины из концентрированного вируса. Терюханов А. Б. и др. установили, что введение инактивированной вакцины в 3 и 16-недельном возрасте давало такой же эффект, как и прививка живыми вакцинами Н120 (120 пассажей на куриных эмбрионах) и Н52 (52 пассажа на куриных эмбрионах). Наиболее выраженный иммунный ответ у 100% цыплят получали при вакцинации в 3-недельном возрасте живой вакциной орально или интраназально из штамма Н120, а в 16-недельном возрасте — инактивированной эмульгированной вакциной [47].

Однако, несмотря на широкое использование вакцин против инфекционного бронхита, вспышки заболевания описывали неоднократно, и выделяли штаммы вируса ИБК у вакцинированного поголовья [153, 343, 188]. Многие из этих полевых изолятов по антигенным свойствам отличаются от вакцинных штаммов. В последнее время в ряде стран широкое распространение получают вирусы ИБК, относящиеся к разным генотипам. Так голландские варианты вируса ИБК (D1466, D274) становились доминирующими в 80-е годы, UK793B (4/91) — в начале 90-х, итальянские штаммы (IT-02) — в конце прошлого века и начале этого, а в последнее время в странах Европы широко распространился вирус, относящийся к генотипу QX [326].

Вирусы, относящиеся к генотипу QX, вызывают патологические изменения в почках и были выявлены как от невакцинированных птиц, так и от вакцинированных [222]. Показано, что штаммы QX были выявлены в РФ на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [87], затем вирус был обнаружен и в европейской части РФ. За последний год было выявлено 5 изолятов, относящихся к генотипу QX в Ивановской, Ростовской, Ульяновской областях и Краснодарском крае. В настоящее время нет никакой информации о происхождении QX вируса ИБК, и способах его распространения. Выявление вируса в разных географических зонах может быть объяснено распространением вируса дикими птицами [223].

Общие характеристика возбудителей респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита.

Респираторный микоплазмоз — инфекционная контагиозная болезнь птиц, вызываемая Mycoplasma gallisepticum (МГ) и характеризующаяся развитием хронического респираторного синдрома у кур. Микоплазмозный синовит — инфекционная болезнь птиц, вызываемая микроорганизмами Mycoplasma synoviae (МС) и характеризующаяся, преимущественно, развитием патологических изменений суставов и сухожильных влагалищ [25, 133]. Возбудители респираторного микоплазмоза и микоплазмозного синовита кур и индеек принадлежат к группе плевропнемниоподобных организмов (PPLO) [127, 133, 165].

Структурная организация микоплазм достаточно проста. Их клетки ограничены трехслойной цитоплазматической мембраной толщиной 10 нм по своей структуре напоминающей мембрану клеток эукариот. В цитоплазме имеется нуклеоид, дифференциально распределенный в виде нитей ДНК, рибосомы и иногда внутрицитоплазматические мембранные структуры. Геном микоплазм представлен примерно 750 тыс. нуклеотидных пар. М. gallisepticum и M. synoviae являются факультативными аэробами и культивируются на искусственных питательных средах, содержащих факторы роста, такие как холестерин, липопротеин и аминокислоты — аргинин, аспарагин, цистеин метионин и другие [76, 354]. На плотных питательных средах (1,3% агара) микоплазмы образуют колонии с плотным врастающим в агар центром и нежной поверхностной периферией, похожие на яичницу-глазунью. Размеры варьируют от 50 до 500 мкм.

Многие наблюдения свидетельствуют об ограниченном количестве ферментов в клетках микоплазм, обуславливающем низкую биохимическую активность.

Микоплазмы чувствительны к температурам выше 39° С, но при минус 25° С они остаются жизнеспособными до 3-х лет, при минус 70° С до 10 лет [352]. Отношение микоплазм к антибиотикам определяется отсутствием у них клеточной стенкиони устойчивы ко всем препаратам, действие которых связано с биосинтетическими процессами белков клеточной стенки [25, 194].

Антигенная структура микоплазм является сложной. Например для M. gallisepticum по разным данным выявлено от двух до восьми серологических типов, из которых наиболее распространены So (вид M. gallisepticum) с выраженными антигенными свойствами и слабопатогенный С (вид Mycoplasma gallinarum) с низкой антигенной активностью, между которыми возможны переходные формы (вид Mycoplasma iners) [25, 352, 353]. Причем белки и липопротеины с молекулярной массой 60−70 кДа считаются иммунодоминантными адгезинами и гемагглютининами.

Внешние, или периферические антигены, многие из которых имеют белковую природу, высокоиммуногенны [73, 151, 233, 336]. Эти антигены определяют специфику иммунологического ответа и обуславливают в наибольшей степени серологическую внутрии межвидовую гетерогенность микоплазм, свидетельствующую о том, что эти микроорганизмы активно эволюционируют. Наиболее иммуногенны поверхностные антигены, содержащие углеводы в составе сложных мембранных комплексов — гликолипидов, липогликанов, содержащих полисахариды, ковалентно связанные с липидами, и гликопротеинов, которые включают в себя фукозамин, гексозамин, галактозамин и глюкозамин. [128, 233].

Все микоплазмы в той или иной степени способны вызывать гемолиз эритроцитов за счет гемолизина. У М. gallisepticum и М. synoviae гемолизины относятся к перекисям, в отличие от бактерий, гемолизины которых являются белками или липидами [289, 336]. Однако не все серотипы микоплазм обладают гемолитическими свойствами.

Патогенностъ Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae В зависимости от вирулентности штаммов микоплазм, входных ворот инфекции, а также от условий содержания и резистентности организма птиц, развивается или латентная инфекция, или явное заболевание с поражением различных отделов органов дыхания и суставов (микоплазмозный синовит). Воспалительно-дистрофические изменения, возникающие на ранних стадиях развития микоплазменной инфекции в респираторных тканях (на 7−10 день после заражения) и характеризующиеся развитием в различных отделах органов дыхания экссудативных процессов, создают благоприятные условия для развития вторичной микрофлоры [281].

Трансовариальная передача микоплазм, по-видимому, также является результатом бактериемии, развивающейся в организме кур-несушек, хотя в данном случае нельзя полностью исключить возможность передачи микоплазм со спермой петуха [25].

Вакцинация птиц, больных респираторным микоплазмозом, против псевдочумы, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита и оспы живыми вирусвакцинами, особенно через органы дыхания, провоцирует более тяжелое клинико-морфологическое проявление этой болезни. Для птиц, больных инфекционным синовитом, таким стресс-фактором является живая вирусвакцина против реовируса птиц [88].

Патогенез и патоморфологические изменения По клинико-морфологическим проявлениям заболевания, вызываемые микоплазмами сходны с заболеваниями, вызванными другими микроорганизмами: хламидиями, вирусами, грибами и с некоторыми другими инфекционными заболеваниями, имеющими полиэтиологическую природу [88]. Инкубационный период при естественном и искусственном заражении колеблется от 4 до 22 дней. Провоцирующее влияние стресс-факторов, таких как секундарные вирусные инфекции, отравления недоброкачественными кормами, инвазии, приводит к клиническому проявлению болезни с признаками общих расстройств — вялостью, депрессией, отсутствием аппетита [25].

Восприимчивы все возрастные группы. Заболевание сопровождается снижением аппетита, яйценоскости и привесов. В 2−3 месячном возрасте у кур наблюдаются первые признаки болезни, проявляющиеся, прежде всего в расстройстве функций органов дыхания. Появляются одышка, кашель, трахеальные хрипы, дыхание с открытым клювом, однако, ведущим признаком респираторного микоплазмоза, по мнению ряда авторов, является наличие аэросаккулита [25].

Для микоплазмозов характерно медленное распространение в стаде и хроническое течение, зачастую со стертой клинической картиной. Смертность среди бройлеров доходит до 20−30%, у взрослых кур она бывает низкой. Однако в случае смешаных инфекций тяжесть заболевания усиливается и смертность может достигать 80%.

Эпизоотология. Респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит широко распространены в птицеводческих хозяйствах различных стран мира [43, 143]. Этому способствует высокая концентрация поголовья на ограниченной территории, что связано с использованием промышленной технологии в птицеводческих предприятиях и специализации их по производству мяса, яиц и выращиванию племенного молодняка. В патологии «перенаселения» важное место принадлежит инфекционным болезням органов дыхания.

Источником возбудителя респираторного микоплазмоза являются больные птицы и микоплазмоносители [25]. В неблагополучных пунктах при отсутствии клинических признаков заболевания серологическим методом с различными антигенами, обнаруживают до 77−100% позитивно реагирующих птиц. В распространении болезни основное значение имеет трансовариальный способ передачи. Ряд исследователей сообщает о влиянии условий содержания на проявление и течение микоплазмозов, например указывается на то, что в птицеводческих помещениях промышленного типа птица полностью изолирована от естественных условий обитания, поэтому соблюдение условий микроклимата служит необходимым фактором профилактики респираторных болезней. [139].

Проявлению инфекционного процесса, кроме неблагоприятных условий содержания, способствуют транспортировка птиц, перемещение внутри хозяйства, применение живых противовирусных вакцин против инфекционного ларинготрахеита, болезни Ньюкасла, бронхита кур, пастереллеза и влияние других факторов, ослабляющих естественную резистентность организма [5,58]. В свою очередь микоплазмоносительство является одной из основных причин недостаточной иммунологической реактивности птиц в ответ на вакцинацию против различных заболеваний.

Иммунитет, лечение и профилактика Микоплазмы могут вызывать локальную инфекцию. Однако нередко наблюдается диссеминация возбудителя в организме, что приводит к генерализации процесса и способствует хроническому рецидивирующему течению инфекции с длительным персистированием возбудителя в организме [107]. В этой связи следует уделять особое внимание бессимптомным и стертым формам, а также учитывать, что клиническое благополучие, наступающее после активной специфической терапии, часто не сопровождается гибелью возбудителя, а способствует переходу острой формы в латентную, затрудняющую индикацию возбудителя.

При естественных и экспериментальных микоплазменных инфекциях протективный иммунитет складывается из местных защитных реакций, а также генерализованного клеточного и гуморального иммунного ответа [136, 177]. Что касается гуморального иммунитета, необходимо отметить, что его уровень в значительной степени определяет степень резистентности птиц к микоплазменным инфекциям. Так у бурсэктомированных птиц уровень специфических антител к М. gallisepticum и М. яупогу1ае значительно ниже, чем у птиц с фабрициевой сумкой, главным лимфоидным органом Вгуморального иммунитета, и устойчивость к инфекции находятся в прямой зависимости от количества сохраненной лимфоидной ткани [177]. Клеточный иммунитет также играет важную роль в протективном иммунитете при заболеваниях микоплазменной этиологии, что подтверждается данными реакции бласттрансформации лимфоцитов. Микоплазмы индуцируют синтез антител всех классов, динамика накопления которых отслеживается с помощью серологических реакций. Существующие меры борьбы включают антибиотикотерапию, вакцинопрофилактику, искоренение инфекции путем уничтожения серопозитивных птиц [23, 352].

Наибольший эффект достигается при применении сульфаниламидных препаратов. Эффективность профилактики тилозином для контроля микоплазмозов у птиц была установлена более десяти лет назад [194]. Также широко используются для этих целей тилан и байтрил.

Для специфической профилактики заболевания применяют живые и инактивированные вакцины (бактерины) [336]. Достаточно широкое распространение живых вакцин в настоящее время связано с одной стороны с их способностью поддержания иммунитета на относительно высоком уровне при условии совместного содержания разновозрастной птицы, с другой стороны с их относительно невысокой стоимостью. Во многих странах используют • бактерины, содержащие инактивированную Mycoplasma gallisepticum в составе водно-масляной эмульсии или сорбированную на гидроокиси алюминия (ГОА) [25, 136].

Преимущество бактеринов перед живыми вакцинами заключается в их безвредности, а также в невозможности реверсии возбудителя. Наличие у вакцинированных птиц антител к М. gallisepticum не оказывает негативного влияния на эффективность бактеринов. Вакцинация не предупреждает инфекции, но купирует клиническое проявление заболевания, позволяет почти наполовину сократить потери от снижения яйценоскости и понизить степень вертикальной передачи возбудителя [23, 204].

Общая характеристика вируса синдрома снижения яйценоскости.

Синдром снижения яйценоскости-76 (Egg drop Syndrome-76, литьё яиц, аденовирусная болезнь птиц) — вирусная болезнь кур-несушек, характеризующаяся размягчением, отсутствием или депигментацией скорлупы яиц и сопровождается значительным снижением яйценоскости. Болезнь, получившая название «синдром снижения яйценоскости» -76 (ССЯ-76), впервые описана голландскими учеными J.H.Van Eck et al. [131], которые выделили вирус в 1976 году. J.B.McFerran [241] впервые выделил вирус в Северной Ирландии из слизистой оболочки носовой полости и гортани кур, у которых отмечалось снижение яйцекладки. Изолированный им штамм вируса ССЯ-76 в настоящее время известен как штамм 127. В различное время в ряде стран были выделены штаммы вируса ССЯ-76 BC-14-в Великобритании, В8/78 в Венгрии, Е77-в Италии, 3877- во Франции JPA -1 В Японии и некоторые другие. Все полученные изоляты оказались серологически полностью идентичны первому выделенному штамму 127.

В начале восьмидесятых годов были выявлены случаи ССЯ-76 в нашей стране, что было подтверждено обнаружением в крови переболевших птиц антигемагглютининов к вирусу ССЯ-76 [35,315].

ССЯ-76 чрезвычайно широко распространён в странах с высокоразвитой технологией промышленного птицеводства. В крупных птицеводческих хозяйствах ССЯ-76 наносит весьма существенный экономический ущерб. Потери складываются из недополучения яиц от несушек во время пика яйцекладки, снижения товарного качества коммерческих яиц и яиц, полученных от племенных несушек. В отдельных случаях экономические потери от ССЯ-76 составляли до 50 яиц на одну несушку за продуктивный период. Количество яиц с дефектами скорлупы может достигать 38−40% [131].

Основным источником возбудителя инфекции при ССЯ-76 являются больные куры. В естественных условиях резервуар возбудителя болезнидомашние и дикие утки всех пород [362, 363]. Было установлено, что 65 100% проб сыворотки крови гусей с разных ферм Венгрии содержали антитела к вирусу ССЯ-76 [362]. При ССЯ-76 отмечена как горизонтальная, так и вертикальная передача возбудителя. Горизонтальное распространение ограничено и осуществляется контактным путём. Скорость распространения инфекции при этом зависит от трёх факторов: инфекционности вируса, степени его экскреции из заражённого организма и плотности размещения птицы [241]. Помимо горизонтального основным путём передачи инфекции является вертикальныйчерез яйца, снесённые инфицированными птицами [49,131,362,363].

Основной характерный клинический признак инфекции в стаде-снижение яйценоскости до 15% и выше [277], иногда этот процент достигал 30. Пик яйцекладки может задерживаться до 4−5 недель, восстанавливаться через 4−6 недель, но первоначального уровня уже не достигает. Указанные признаки сохраняются в неблагополучном стаде 2−12 недель [338].

Классификация и структура аденовирусов птиц В течение нескольких последних лет ряд авторов разделяли аденовирусы птиц на три группы (1,2 и 3), на основании иммунологических различий между представителями этих групп. Первая группа включает аденовирусы кур (БАУ 1−12) и аденовирусы, выделенные от ряда других видов птиц. Группа 2 включает вирусы болезни мраморной селезёнки фазанов и гемморагического энтерита индюков. В группу 3 выделяют единственный серотип, представленный вирусом ЕБ8−76 [49, 170].

Морфология и химический состав вируса ССЯ-76. По морфологии и физико-химическим свойствам вирус ССЯ-76 во многом сходен с аденовирусами птиц [208, 277, 330]. Аденовирусы лишены липопротеиновой оболочки, имеют форму икосаэдра диаметром от 65 до 80 нм [49]. От каждой из вершин икосаэдра отходит структурный компонент, называемый «фибер», чья длина варьирует у различных серотипов аденовирусов [270]. Белковая оболочка (капсид) состоит из 252 субъединиц (капсомеров), 240 из которыхгексоны и 12- пентоны [170]. Вирус ССЯ-76 имеет 13 структурных полипептидов, по крайней мере 7 из них были аналогичны полипептидам куриного аденовируса типа 1 [325,357]. Геном вируса ССЯ-76, представленный линейной двухцепочечной молекулой ДНК, имеет длину 34 000 пар нуклеотидов и молекулярную массу (24″ 10бД), что значительно меньше ДНК птичьих аденовирусов (БАУ-1, БАУ-3, РАУ-4), имеющих мол. массу (28'106Д) [325, 356]. Тропизм аденовируса в большей степени зависит от фибера, поскольку он является белком, взаимодействующим со специфическим клеточным рецептором [225]. Данные электронной микроскопии вирионов и субвирусных компонентов (при негативном контрастировании) также подтверждают, что вирус ССЯ-76 не типичен для аденовирусов птиц [131, 240] Репликация и сборка осуществляются в ядре (синтез полипептидных цепей происходит в цитоплазме), а вирионы освобождаются в результате разрушения клетки.

Штаммы вируса ССЯ-76 отличаются от других 12 серотипов аденовирусов кур гемагглютинирующей активностью. Все штаммы этого вируса агглютинируют эритроциты кур, гусей, индеек и уток [131, 240,357]. Гемагглютинирующая активность вируса ССЯ-76 зависит от системы репродукции. Наибольший титр гемагглютинина выявлен в вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости утиных эмбрионов (1:4000) и как правило, все штаммы этого вируса, будучи выращеными в культуре клеток, имеют более низкий титр гемагглютининов [131], а в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов он исчезает совсем или очень низок. Гемагглютинин вируса ССЯ-76 инактивируется трипсином, мочевиной и пиридином [325].

Иммунитет и специфическая профилактика Цыплята, выведенные от серопозитивных родителей, до 4-нед. возраста содержали материнские антитела, период полураспада которых составлял 3 дня. От таких цыплят, как правило, не удается изолировать вирус, и в ответ на заражение их вирусом ССЯ-76 у них не образуется активных антител. Однако антитела, пассивно передаваемые потомству, не полностью нейтрализуют вирус, передаваемый вертикально, и вирус в скрытой форме в организме цыплят проявляет себя как патогенный лишь в стрессовый период, связанный с началом яйцекладки [362, 363].

Эпизоотическое благополучие птицеводческих хозяйств, выращивающих птицу, восприимчивую к инфекции ССЯ-76, обеспечивается за счёт применения вакцин. Ещё в 1977 году У. Вахепс1а1е [79] показал возможность вакцинопрофилактики этой инфекции с помощью инактивированной масляной вакцины, содержащей вирус ВС-14. В 1980 году А.2апе11а е1. а1. 357] разработали и успешно испытали бивалентную вакцину против ССЯ-76 и болезни Ньюкасла, затем была предложена комбинированную инактивированная эмульгированная вакцина против ньюкаслской болезни, синдрома снижения яйценоскости-76 и болезни Гамборо.

Вопрос об оптимальных сроках вакцинации птицы, по сообщению ряда исследователей [50, 51] в общем решается однозначно. Птицу лучше всего вакцинировать в 14−16 недельном возрасте или за 2−4 недели до начала яйцекладки, если ее перемещают к возможно инфицированной птице. Если же птицу перемещают к заведомо благополучной в отношении ССЯ-76 птице, то вакцинацию рекомендуется завершить до конца перемещения, так как препарат может не полностью проявить свои протективные свойства через 10 дней после вакцинации. В случае необходимости птицу рекомендуют ревакцинировать. Уровень антител определяют через 14−21 день после вакцинации. Пик титров наблюдали между 2 и 5 неделями [241]. Продолжительность иммунитета составляла один год [35, 48].

Общая характеристика вируса инфекционного энцефаломиелита птиц.

Инфекционный энцефаломиелит птиц (ИЭП) или эпидемический тремор — широко распространенное контагиозное заболевание, характеризующееся острым течением с проявлением комплекса нервных признаков (атаксия, параличи, парезы конечностей, тремор головы и шеи) у цыплят раннего возраста, с последующим развитием слепоты вследствие образования катаракты у части переболевшего поголовья [18, 86, 332]. У птицы, инфицированной в более позднем возрасте, заболевание протекает бессимптомно, у взрослых кур может сопровождаться временным уменьшением яичной продуктивности и выводимости молодняка [18, 24, 86, 171]. Заболевание впервые обнаружила в США у двухнедельных цыплят породы Rhode — Island Red Элизабет Джоунс в 1930 году [96, 99], единственным симптомом у них был тремор. В настоящее время инфекционный энцефаломиелит птиц распространен практически на всех континентах земного шара, особенно в странах с развитым промышленным птицеводством [19, 321].

Возбудителем инфекционного энцефаломиелита птиц является однонитевой РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Picornoviridae, роду Enterovirus. Он не обладает липопротеидной оболочкой, но образует стабильные кристаллы. Рентгеноструктуктурный анализ таких кристаллов указывает на наличие у них икосаэдрической симметрии. Диаметр вирионов составляет 20−30 нм, капсид состоит из 60 капсомеров, суперкапсидная оболочка отсутствует [46, 205, 246]. Вирус устойчив к действию высоких температур, хлороформу, кислоте, трипсину, пепсину и ДНК-азе, а в лиофилизированном виде защищен от нагрева двухвалентными ионами магния, что противостоит действию тепла [46]. Вирус кислотоустойчив и сохраняет жизнеспособность при рН 3,0, поскольку на пути к своему местообитанию — кишечнику — должен пройти через кислую среду в желудке.

Геном представляет нефрагментированную однонитевую молекулу РНК с молекулярной массой (2,6−103) Д и содержит 7500±400 нуклеотидов. Структура вириона включает четыре вирусоспецифических белка: VP1, VP2, VP3, VP4, с молекулярной массой: 43 000, 35 000, 33 000 и 14 000 соответственно [178]. Все изоляты инфекционного энцефаломиелита птиц антигенно родственны. Тем не менее, существуют два патотипа вирусов: энтеротропный и нейротропный. Первый, представленный природными полевыми штаммами, патогенен для цыплят первых дней жизни, клинически проявляется признаками поражения центральной нервной системы (атаксия, тремор, парезы и параличи конечностей) [168]. Энтеротропный вирус патогенен и для кур продуктивного периода, вызывая у них снижение яйценоскости. Другая группа включает нейротропные штаммы, адаптированные к куриным эмбрионам, и вызывающие эмбриопатическое действие, проявляющееся изменениями в куриных эмбрионах (общее недоразвитие, атрофия и дистрофия мускулатуры конечностей) при интрацеребральном или парентеральном введении.

Эпизоотология и клинические признаки.

Основной путь передачи возбудителя ИЭП — вертикальный, но существует также и раннее горизонтальное контактно-алиментарное заражение [18, 46]. Вирус передается потомству через яйцо до 2−3-х недель после заражения кур-несушек.

К вирусу восприимчивы цыплята до 6 — недельного возраста, но чаще болеют в возрасте от 6 до 20 дней. Клинические признаки болезни в естественных условиях проявляются в полной мере при достижении цыплятами 1−2 — недельного возраста. У больных постепенно возникают характерные признаки поражения центральной нервной системы (слабость, сонливость, тремор головы и шеи, нарушение координации движения, парезы, а затем и параличи). Цыплята погибают от истощения [иэп 321]. Вирус ИЭП размножается в центральной нервной системе (ЦНС) или в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), вызывая поражения клеток [6]. У больных к 6 дню после заражения вирус накапливается в головном мозге, поджелудочной железе, 12-перстной кишке, желудке, печени. У птицы, достигшей возраста 2−3 недели, наблюдается заметная возрастная устойчивость к развитию клинических признаков при действии инфекции. У взрослой птицы возможно временное снижение яйценоскости (5−10%), а нервные симптомы при этом могут и не проявляться [176].

В естественных условиях заболевание проявляется только среди цыплят 1−2 — недельного возраста. Смертность в среднем составляет 25%, но может достигать и 50% [98].

Илшунитет и специфическая профилактика.

У птиц после естественного и экспериментального заражения образуются циркулирующие антитела, которые, помимо сыворотки крови, обнаруживаются и в желтке яиц [98]. В сокращении продолжительности инфекции основную роль играет гуморальный, а не клеточный иммунитет. Иммунные куры передают через яйцо материнские антитела [27], которые защищают цыплят в течение первых 6 недель жизни. На фоне этого пассивного иммунитета они могут заражаться инаппарантно, что вызывает у птицы образование активного иммунитета [98]. Инфицированная птица выделяет вирус с пометомнесушки передают вирус через яйцо в течение 2−3 недель после заражения. Эта эпизоотологическая особенность позволяет бороться с ИЭП с помощью специфической вакцинопрофилактики [96, 97]. В настоящее время перспективна систематическая вакцинация до яйцекладки, которая предохраняет от вспышек болезни и от передачи вируса потомству через яйцо [300, 302].

Живыми вакцинами из штамма «Calnek 1143» прививают поголовье будущих родителей и прародительских стад однократно в возрасте 10−14 недель методом выпаивания [99]. Кроме живых вакцин за рубежом используется инактивированная В-пропиолактоновая вакцина (штамм «Van Roekel»). Преимущество инактивированной вакцины заключается в том, что она не снижает яичной продуктивности, которая иногда встречается в случае вакцинации несушек живыми вакцинами, и исключает возможность вертикальной передачи вакцинного вируса. Однако применение таких препаратов целесообразно в тех случаях, когда возникает необходимость прививать птицу во время продуктивного периода. Показателем поствакцинального иммунитета является уровень вируснейтрализующих антител до вакцинации и через несколько недель после нее [99].

Общая характеристика реовируса птиц.

Инфекционный агент реовирусной инфекции впервые был выделен Fahey J.E. и Crawley J.F. в 1954 году в Канаде от цыплят с хронической респираторной инфекцией, а затем он распространился во всех странах с развитой птицеводческой индустрией [285], где была описана болезнь, названная теносиновитом кур (ТСК). Теносиновит кур или артритконтагиозное заболевание, характеризующееся хромотой, связанной с воспалением сухожилий и суставов конечностей [123, 245]. Заболеваемость ТСК может достигать 100%, в то время как смертность обычно не более 6% [201]. Острые реовирусные ТСК отмечают у цыплят до 12-ти недельного возраста и у взрослых кур старше 20-ти недельного возраста. Хронические ТСК сопровождают инфицированную птицу в течение всей жизни. ТСК поражает преимущественно бройлеров, реже — яичные породы кур [201, 285]. Это связано с предрасположенностью суставов у кур тяжелых пород к структурным изменениям. Малабсорбционный синдром имеет большое число других названий, указывающих на многообразие клинических признаков [318]. Болезнь протекает главным образом в двух формах: кишечной в 10-дневном возрасте у цыплят и респираторной — до 6-недельного возраста. Количество цыплят с отставанием в росте может доходить до 10−15%. Еще ни разу не удалось воспроизвести МАБ контрольным заражением кур выделенным реовирусом, а лишь комбинацией патогенных агентов вирусной и бактериальной природы [292]. По мнению некоторых авторов реовирус играет лишь роль «катализатора» в патологическом процессе [191, 285].

Реовирус наносит экономический ущерб птицеводству, связанный с нарушением формирования скелета у птицы, с уменьшением привеса на 1015%, ослаблением половой активности племенного стада, со снижением яйценоскости на 6−10%, с ухудшением категорийности тушек и увеличением смертности на 4−7%. Уровень заболеваемости различен, но обычно составляет 10% [318]. Часто инфекция протекает в скрытой форме и может быть подтверждена только серологическими методами или выделением вируса [285]. Реовирусы выделяют как у здоровой птицы, так и у птицы с незначительными отклонениями от нормального развития, такими как нарушение пигментации и структуры оперения — «вертолетная болезнь» [75]. По данным ряда авторов [166], РВП вызывает изменения размеров бурсы и селезенки, числа белых кровяных телец и фолликулярную атрофию в бурсе.

Источник РВП — больная и переболевшая птица [182]. Для реовируса птиц характерна горизонтальная и вертикальная передача [57]. Основной путь передачи возбудителя — алиментарный. В инфицированном стаде лишь незначительное количество цыплят получают вирус родителей, однако, роль вертикальной передачи вируса в распространении РВП значительна [182]. После инфицирования реовирусом куры-несушки начинают нести зараженные яйца уже через 19 дней. Трансовариально зараженные цыплята становятся «ядром» инфекции, заражая весь выводок. Резистентность птицы к РВП в первую очередь обусловлена ее возрастом. Возрастную резистентность обуславливает гуморальный и, в большей мере, клеточный иммунитеты. При ассоциированной инфекции реовирус птиц стимулирует инфекционную активность специфического агента вирусной анемии цыплят [244], Енпепа асегуиНпа и Енпепа тШэ [292], вируса ИББ [251] и др. Наиболее выраженные ТСК отмечают преимущественно при ассоциативном течении реовирусной инфекции и синовиального микоплазмоза. Более того, главными причинами артритов у кур считают микоплазмозы или стафилококковые инфекции, протекающие на фоне реовирусзависимой иммуносупресии [31].

Классификация. Реовирусы птиц выделены в отдельную группу в составе рода ОгШогеоу^Б семейства Леоушёае [125]. Количество серотипов реовирусов птиц окончательно не установлено. Серотипизация реовирусов птиц строилась на основе данных исследования в РДП, РСК, РН и иммуннофлуоресценции [56]. В настоящее время в мире выделено несколько сотен изолятов реовируса птиц, 85−90% из которых апатогенны. Большинство вакцинных штаммов входит в Американскую группу реовирусов птиц. Близкое генетическое родство штаммов 81 133, 1733 и 2408 было подтверждено определением первичной структуры генома возбудителя РВП [347]. Доказана высокая вероятность образования реассортантов при смешанной инфекции, вызванной штаммами из разных серотипов [248]. Возможно, именно широкое распространение реассортантов обуславливает высокое серологическое родство реовирусов в регионах [37].

Морфология и структура вириона. Структурная организация вирионов реовирусов птиц является типичной для рода Огйюгеоукш [43, 248, 351]. Вирионы реовирусов безоболочечные и состоят из двух капсидных слоев, образованных капсомерами и расположенных в форме икосаэдра [103]. Диаметр внешнего капсидного слоя, собранного из 92 белковых капсомеров, — 70−80 нм, внутреннего, содержащего вирусный геном, — около 50 нм. Двухнитевая РНК фрагментирована на 10 сегментов, Каждый сегмент имеет транслируемую область и нетранслируемые участки. Нетранслируемые последовательности сегментов занимают примерно 3−8% от общей длины генома и участвуют в сборке вирусных частиц и в регуляции процесса транскрипции. Реовирусы птиц и млекопитающих отличаются по структуре сегментов М и Б, а также по структуре и функции кодируемых ими белков [137, 266]. Белки реовирусов птиц делятся по величине на три класса: большие Х-, средние р, — и малые а-белки. Девять белков (АА, А. С, |хА, р, В/р, 2 В, стА, стВ, аС) являются структурными и два — неструктурными [175, 333, 349, 351]. Известно, что группоспецифическими антигенами являются белки АВ и стВ, а типоспецифическим — белок стС [248, 337, 350]. Более того, последние исследования антигенных свойств белка аС дают основание предположить, что в его состав входят и типоспецифический и группоспецифический домены [248].

В серологических реакциях было показано, что все известные 11 серотипов возбудителя РВП имеют общий антиген [248]. Эпитопы, вызывающие образование вируснейтрализующих антител, имеют белки АЛЗ, стВ и аС. Вирусспецифические антитела экспериментально получали на" другие белки [336]. Так, ТакеЬага К. е1. а1. изучили 13 моноклональных антител, полученных против реовируса птиц штамма 11сЫс1а [320]. Из них только три (МАЫ, МАЬ2 и МАЬЗ) нейтрализовали вирус, причем МАЫ и МАЬ2 нейтрализовали штаммы ИсЫёа, С8−108 и ТБ-142, а МАЬЗ — только штамм ИсЫёа. Эти результаты подтвердили существование у реовирусов птиц и группоспецифических и типоспецифических эпитопов.

Обычно антитела появляются в течение 7−14 дней [258, 285] с пиком накопления к 6 неделям после введения антигена. Нейтрализующие антитела против РВП выделяют на 7−10 дни после заражения цыплят [191, 245, 285], а преципитирующие — только через 2 недели с максимальным их накоплением в крови через 6 недель. Снижение уровня антител против реовируса птиц идет в зависимости от достигнутого титра, но значительно медленее, чем выработка.

Патогенностъ. При изучении и характеристике возбудителя РВП принято опираться на клинические признаки заболевания птицы, от которой изолят был выделен [156]. Неоднократно было показано, что практически все изоляты реовируса птиц способны вызывать поражения суставов у кур. Некоторые авторы [201] в своих иследованиях не обнаружили какой-либо связи между серотипом вируса и клиникой заболевания. Однако известно, что большинство реовирусов, выделенных из сухожилий цыплят с артритами, дают значительную перекрестную реакцию в серонейтрализации [191, 285], а большинство штаммов, выделенных у цыплят с МАБ, вообще принадлежат к одному серотипу [137].

Иммунитет и специфическая профилактика при реовирусной инфекции Клеточно-опосредованный иммунитет играет огромную роль в защите птицы от РВП. Pertile et. al. обнаружили в клеточном инфильтрате, полученном после заражения птицы реовирусом птиц из синовии, большое количество активных Т-лимфоцитов и плазматических клеток [276].

Несмотря на активный гуморальный иммунитет многие полевые изоляты реовируса птиц могут долгое время персистировать в организме взрослой птицы [191, 192]. Более того, на фоне высокого уровня антител инфекция способна протекать в хронической форме. Установлено, что материнские антитела защищают от контрольного заражения реовирусом и цыплят и куриные эмбрионы [191].

В мире основное направление в профилактике РВП занимает разработка и применение живых и инактивированных вакцин. В связи с тем, что наиболее чувствительны к заражению реовирусом цыплята в раннем возрасте, программы вакцинации направлены на создание иммунитета именно в этот период жизни птицы, что, в свою очередь, предположительно можно достичь за счет активной иммунизации цыплят и/или путем создания пассивного иммунитета через вакцинацию родительского стада. Для активной иммунизации цыплят предусматривается применение живых аттенуированных вакцин [172, 192].

Инактивированные вакцины против РВП обладают способностью стимулировать развитие высокого уровня вирусспецифических антител, но их применение возможно лишь на взрослой птице. Поэтому в последнее время практикуется комбинированное применение и живых и инактивированных вакцин против РВП.

Единой программы вакцинации против РВП не существует. В большинстве современные реовирусные вакцины имеют в основе вакцинный штамм S1133. Однако полевые наблюдения и лабораторные исследования по контрольному заражению показали, что степень защиты напрямую зависит от степени родства вакцинного и «полевого» штаммов [319]. Так, в последнее время особенно актуальны исследования возможности вакцинации птицы поливалентными вакцинами, а так же разработка схем иммунизации, применимых к конкретной ситуации в хозяйстве. Giamborne для изготовления живых вакцин рекомендуют использовать штаммы S1133 и UMI203, а для инактивированных — штаммы S1133, С08, 1733, 2408 и WVU [156]. Эти штаммы реовируса птиц в сочетании обладают широким спектром антигенных свойств.

5. ВЫВОДЫ.

1. Создана система комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней кур в промышленном птицеводстве с применением иммуноферментных тест-систем и программного обеспечения для получения, обработки, учета и хранения данных.

2. Усовершенствованы методики очистки и концентрирования антигенов НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем. Под контролем электронной микроскопии и электрофореза определены условия получения л очищенных антигенов с концентрацией не менее 1−5 мг/см .

3. Отработаны схемы иммунизации кур для получения контрольных положительных сывороток с активностью препаратов не менее 1:3200, определены допустимые значения оптических плотностей контрольных сывороток при постановке реакции в одном разведении, находящиеся в диапазоне 0,4−1,050 для положительных контролей и 0,04−0,160 для отрицательных сывороток.

4. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня специфических антител к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении: определены оптимальные концентрации (для антигенов, конъюгата) и условия взаимодействия компонентов реакциивыбрано рабочее разведение тестируемых сывороток (1:400), установлены критерии качественной и количественной оценки результатов, выведены уравнения линейной регрессии и определены коэффициенты для формулы расчета числового значения титра по одному разведению испытуемых сывороток.

5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании свыше 3000 проб сывороток с помощью разработанных тест-систем ИФА, базовой реакции РТГА и коммерческих наборов производства фирмы ЗупЬюйсБ (КРЬ, США), зарегистрированных на территории РФ.

Корреляция составила от 84% до 96%, относительная чувствительность — от 89% до 98% и относительная специфичность — от 79% до 94%.

6. За период с 1998 по 2008 гг. разработанные тест-системы проверены при исследовании проб сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ для оценки иммунного статуса поголовья при контроле трансовариального, поствакцинального иммунитета против возбудителей экономически значимых болезней кур в промышленном птицеводстве.

7. На основе разработанных иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения уровня антител к возбудителям выбранных болезней птиц в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении разработана и утверждена Россельхознадзором научно-техническая документация и регламенты для опытно-промышленного производства 16 наименований коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на 180 проб).

8. Создана и зарегистрирована в Российском агентстве по патентам и товарным знакам универсальная компьютерная программа «СИНКО-ИФА» для сбора, анализа и хранения результатов ИФА с учетом возможности работы с иммуноферментными наборами, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ», и зарубежных фирм-производителей.

9. Разработана технология, организовано опытно-промышленное производство и оптимизирован контроль качества 16 коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств.

10. Проведена оценка качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в 8 международных сравнительных испытаниях, проводимых аккредитованной референтной лабораторией (Голландия) и установлено, что статус зашифрованных проб определяется не менее чем в 75%.

11. В ветеринарных лабораториях и на птицефабриках РФ внедрена комплексная система серологической диагностики, основанная на постоянном мониторинге иммунного статуса птицы разного возраста, с использованием наборов для ИФА, комплекта стандартизированного оборудования для постановки реакции и компьютерной программы для обработки и хранения полученных результатов анализа. В РФ и странах СНГ установлено и используется свыше 100 комплектов оборудования с универсальной компьютерной программой.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом» (1998 г.) и «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций» (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 1 б наборов для ИФА, утвержденные Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 495 527−542 006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0043−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 495 527−0055−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0042−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 495 527−0057−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0044−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 495 527−0045−2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388−133−495 527−2005 от 15.02.2006) — наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 495 527−0056−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0041−2006 от 27.06.2007) — наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 495 527−0038−2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388−117−495 527−2005 от 30.05.2006) — наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза {Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 4 955 270 109−2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0111−2009 от 31.03.2009) — набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 495 527−0034−2006 от 29.12.2006) — < набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 4 955 270 086−2008 от 09.12.2008).

На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение 1997 — 2009 гг. было произведено около 21 000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.