Биохимические изменения в облученной дезоксирибонуклеиновой кислоте

Курсовая работа на тему:

«Биохимические изменения в облученной дезоксирибонуклеиновой кислоте»

Харьков 2007

Нуклеиновые кислоты выполняют важнейшие функции в сложном комплексе биохимических процессов, лежащих в основе того, что мы называем жизнью. Например, вся генетическая информация индивида содержится именно в нуклеиновых кислотах.

Тот факт, что нуклеиновые кислоты занимают ключевую позицию в биологических процессах, делает изучение воздействия излучения на ДНК главным аспектом многих исследований, как биохимических, так и физико-химических либо же исследований молекулярной радиобиологии.

Основная задача курсовой состоит в том, чтобы связать потерю биологической активности с физическими и биохимическими изменениями, проследить за действием излучения на нуклеиновые кислоты, и, таким образом, добиться понимания многих механизмов.

В курсовой работе будут рассмотрены биохимические и химические изменения в облученных нуклеиновых кислотах, будет обсуждаться роль прямого и непрямого действия излучения, а также рассмотрено влияние облучения на биологическую активность нуклеиновых кислот, т.е.описаны процессы, указывающие на подавление некоторых биологических функций. Будут раскрыты такие понятия как разрыв полинуклеотидных цепочек ДНК, а так же разрыв водородных связей.

Чтобы лучше понять цель работы приведем следующие факты:

Один высокоэнергичный фотон или одна частица, поглощенные клеткой, могут повредить ДНК, а это повреждение может привести к раку. Но тело взрослого человека получает от естественных источников около 15 тыс. гамма — квантов или частиц в 1 с, т. е. более 1 млрд в день. Кроме того, ДНК в каждой клетке в норме ежедневно теряет около 5 тыс. пуриновых оснований из-за разрушения связей с дезоксирибозой под действием естественного тепла. Еще больше разрушений приносят нормальные процессы клеточного деления и репликации ДНК. Но самые большие разрушения — около 1 млн. нуклеотидов ДНК в каждой клетке ежедневно — вызывают свободные радикалы, естественные продукты метаболизма. Из-за радиации чаще, чем в нормальном процессе метаболизма, возникают двойные разрывы в ДНК, а такие повреждения устранить труднее, чем одиночные разрывы. [2]

Заключительной частью курсовой работы будет исследование изменения генетического материала вследствие воздействия излучения на ДНК. Так же рассмотрим частоту ошибок, возникающих в процессе репликации вследствие излучения.

Изложение экспериментальных методов и полученных результатов станет понятнее, если предварительно сделать краткий обзор о структуре ДНК.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — полимер, мономерами которого являются нуклеотиды. Последовательность нуклеотидов в неразветвленной полинуклеотидной цепи — первичная структура ДНК — строго индивидуальна и специфична для каждой природной ДНК и представляет собой кодовую форму записи биологической информации — генетический код. В каждой молекуле две полинуклеотидные цепи объединены в одну двойную цепь, в которой основания расположены парами друг против друга и соединены водородными связями.

К образованию пар способны только комплементарные, т. е. «подходящие» друг другу, основания. Цепь закручена в спираль вокруг общей воображаемой оси, причем основания расположены перпендикулярно этой оси. Такую двойную спираль называют вторичной структурой ДНК, третичную же структуру образуют, например, в хромосомах, двойные спирали, соединенные с белками ионными связями.

Перед делением клетки ее ДНК удваивается или реплицируется, в результате чего каждая новая клетка получает ДНК, несущую такую же генетическую информацию, которая имелась в исходной клетке.

Строение и функции обычной ДНК тяжело обхватить одним кратким обзором. А что же произойдет, если воздействовать на эту ДНК ионизирующим излучением? Так же, следствием такого сложного строения живых систем становится неоднозначность их отклика на действие ионизирующего излучения — в одном и том же облучаемом объекте может возникнуть множество разных эффектов. В нашем случае могут наблюдаться разрывы молекул нуклеиновых кислот, хромосомные нарушения, изменение нормальной процедуры деления клетки, наконец, гибель клетки — и все эти неблагоприятные последствия проявляются вместе или порознь. Одним словом, поглощенная энергия ионизирующих излучений способна «запускать» целую цепочку заранее неизвестных событий, расстраивающих тонкий механизм жизнедеятельности. [3]

При облучении в ДНК возникают разнообразные изменения. Прежде всего в различных участках молекулы ДНК образуются свободные радикалы, что может быть исследовано в сухой ДНК. Образование этих первичных продуктов приводит к химическим изменениям, таким как дезаминирование или дегидроксилирование, разрыв связи основание — дезоксирибоза, окисление дезоксирибозы или же высвобождение фосфатной группы. Эти реакции в конечном счете приводят к изменениям макромолекулярной структуры ДНК. В этой связи нужно различать однои двухцепочечные разрывы (т.е. совпадающие и соседние разрывы двух нуклеотидных тяжей) и поперечные сшивки двух и более молекул ДНК. Эти изменения в структуре макромолекул в результате облучения имеет первостепенную важность.

Вопрос в том, какие типы поражения молекул влекут за собой потерю биологической активности, т. е. инактивацию. Так же различается чувствительность больших и малых молекул, например чувствительность в нативном состоянии (с соответствующей конформацией) отличается от чувствительности этих же молекул в денатурированном состоянии. Одни и те же остатки аминокислот могут иметь различную чувствительность к облучению в зависимости от их локализации в молекуле (находится ли группа на поверхности или внутри молекулы, связана ли она со специфическими структурами, а так же от природы соседних групп). Произведенный эффект так же зависит от типа излучения, прямого или непрямого действия радиации. [4]

Начнем рассматривать эффекты, производимые облучением на ДНК, по порядку.

1. Облучение ДНК

Свободные радикалы представляют собой чрезвычайно активные образования (молекулы, то есть частицы, имеющие неспаренные электроны), точнее, непарный электрон на последнем электронном уровне, который делает их крайне нестабильными.

Из-за этого такие молекулы очень легко вступают в химические реакции. Нестабильная частица, сталкиваясь с другими молекулами, «крадет» у них электрон, что существенно изменяет структуру «пострадавших» молекул. Поскольку эти «завоеватели» стремятся отнять электрон у других полноценных молекул, в свою очередь «пострадавшая» молекула сама становится свободным радикалом — развивается разрушительная цепная реакция, губительно действующая на живую клетку. Отнимая электрон у молекулы, свободные радикалы инактивируют клетки, тем самым нарушая хрупкий химический баланс организма. При этом происходят необратимые изменения. Эта цепная реакция может повредить миллионы молекул за доли секунды, пагубно отражаясь на структуре жизненно важных клеток в нашем организме. [5]

Как же они индуцируются в ДНК?

Этот процесс характерен для начальной фазы биохимических изменений в облученных нуклеиновых кислотах и может наблюдаться с помощью ЭПР — скопии. ЭПР-скопия применяется для определения выхода радикалов, индуцируемых облучением в ДНК и ее составных частях.

Записывается только первая производная сигнала поглощения. Сигналы оснований не обладают сверхтонкой структурой. Исключение составляет сигнал тимина, главный компонент которого состоит из характерного восьмилинейного спектра.

Очень близкие спектры получают после облучения при низких температурах с последующим измерением при комнатной температуре. Количество радикалов в образце определяется по интенсивности спектров ЭПР (двукратным интегрированием спектров).

Выход радикалов увеличивается в следующем порядке: основание<�нуклеозид<�нуклеотид Причина этого становится ясной после обсуждения ЭПР — спектроскопии. Выход радикалов и спектры, полученные в опытах с ДНК, в большой степени зависят от типа ДНК.

Выход радикалов в спектры, полученные в опытах с ДНК, в большой степени зависят от типа ДНК и препаративных процедур.

Именно по этой причине значения, измеренные в разных лабораториях при 77^оС, варьируют между 0,2 и 12. Это различие еще больше если опыты производятся при комнатной температуре.

Используя качественные изменения ЭПР, можно попытаться идентифицировать радикалы, определяющие спектр облученных нуклеиновых кислот.

Характерно, что восьмилинейный спектр тимина имеет различную интенсивность и, обусловлен продуктом присоединения атомарного водорода (табл. 2) к С₆-атомама тимина Первый спектр (а), по крайней мере частично, может состоять из триплета с расщеплением 35э, который можно идентифицировать с радикалом гуанина.

Не меньше трех линий содержится в четвертом спектре. Неясно в каком месте молекулы ДНК радикал локализуется.

Существуют трудности, возникающие при попытке сопоставить основную структуру сигнала ДНК с определенными радикалами. Они приводят к тому, что анализ ЭПР должен включать и изучение спектров составных компонент ДНК.

Дезоксирибоза образует радикалы посредством утраты атома водорода и раскрытия кольца. Поэтому понятно, что основания образуют меньше радикалов, чем нуклеозиды, а те, в свою очередь, меньше, чем нуклеотиды. Более высокий выход радикалов в нуклеозидах и нуклеотидах обусловлен дополнительной атакой атомов водорода, которые отщепляются от остатка дезоксирибозы. В дезоксирибозе вовсе не стабилизируется или стабилизируется очень незначительное количество радикалов.

Теперь рассмотрим проблему внутримолекулярного переноса спина (перестройки) в нуклеиновых кислотах и, в частности, в ДНК или его составных частях. Спин переносится через, а водородные мостики в кокристалле. Опыт, проведенный Мюллером, доказывает возможность этого.

Опыт: образец облучался в сухом состоянии при температуре 77 и при этой же температуре измерялись сигналы. При нагревании образцов до 300К изменялась форма спектра. Это означает, что сигнал ДНК, полученный при комнатной температуре, не образуется простым наложением первичного спектра отдельных составных частей ДНК, на него оказывают влияние эффекты перестройки.

Тем не менее, на основании опыта нельзя утверждать, что перенос энергии по водородным связям пар оснований действительно происходит в молекуле ДНК. [1]

2. Биохимические изменения в облученной ДНК

В то время, как с помощью ЭПР, о которых речь шла выше, позволяют составить представление о парамагнитной природе процессов, происходящих при облучении сухой ДНК, описываемые опыты, касаются радиолиза ДНК и его компонентов в водных системах. Выясним действие ионизирующего излучения.

Распад свободных оснований, облученных в водных растворах, можно определить по уменьшению оптического поглощения в УФ — части спектра или с помощью бумажной хроматографии, а так же по специфическим химическим реакциям (например с бромом и ли солями серебра). Эти опыты показывают, что пиримидины (G=1.9−2.1) почти в два раза чувствительнее пуринов (G=1.1−1.3). В пиримидинах ОН — радикалы воздействуют главным образом на 5,6 — двойную связь. В аэробных условиях это приводит к образованию пиримидин — окси — оксиперикиси, а в анаэробных условиях при действии двух ОН — радикалов — к образованию гликоля. Окси — гидроперекиси урацила и цитозина неустойчивы и при взаимодействии образуют соответственно гликоль и изобарбитуровую кислоту.

Радиационно — химические изменения пуринов не были так подробно изучены. В анаэробных условиях разрушается главным образом имидазольное кольцо, в то время как в присутствии кислорода наблюдается пероксидация 5,6 — двойной связи. Образующийся в результате этого процесса оксигидроперекись так и не удалось выделить, очевидно, из-за ее нестойкости. Были так же обнаружены циклонуклеотды, которые играют роль в образовании поперечных сшивок.

При облучении смеси из четырех оснований ДНК в растворе еще раз обнаружилось, что распад пиримидиновых оснований в этом случае в два раза выше, чем у пуринов. Подводя итоги, можно сказать, что распад оснований уменьшается в следующем порядке: свободное основание>нуклеозид>нуклеотид>ДНК. Как мы уже знаем, образование радикалов снижается в том же порядке в сухой ДНК.

В таблице 3 приведены значения для распада отдельных оснований в облученном растворе ДНК:

Как видно из таблицы 3, в присутствии кислорода разрушается в два раза больше оснований, чем в анаэробных условиях, а распад тимина совершается быстрее, чем распад любого другого основания. Разрушение оснований происходит в четыре раза чаще, чем потеря основания из облученной ДНК в сходных экспериментальных условиях. Следует отметить, что на этот последний эффект не оказывает влияния присутствие кислорода.

3. Изменения дезоксирибозы

Высвобождение неповрежденных оснований происходит главным образом в результате действия химических веществ на дезоксирибозную группу и молекулы ДНК, и вызывается, по сей вероятности, гидролизом N — гликозидной связи. В анаэробных условиях восстанавливающие радикалы воды атакуют остаток дезоксирибозы (хотя и обладают высоким сродством к двойным связям оснований), поскольку значение G для образования Н₂ в облученном растворе нуклеотида равно 1.0, а в чистой воде при тех же условиях — 0.6, в соответствии с этими данными, при отнятии водорода от дезоксирибозы, G будет равно 0,4.

Помимо химических изменений в облученной ДНК были обнаружены многочисленные конечные продукты составных частей ДНК, поврежденных излучением (гидроперекиси, перекись водорода, аммиак и др.) [1]

4. Разрывы полинуклеотидных цепей

Изменения макромолекулярной структуры ДНК определяют как правило по изменению ее молекулярного веса. На распределение молекулярных весов непосредственное влияние оказывают одно, двухцепочечные разрывы и поперечные сшивки между двумя молекулами.

Однонитевые разрывы не очень опасны для клеток. Однако они приводят к нарушению и повреждению ДНК, когда копируются при репликации. Однонитевые разрывы влияют на распределение молекулярных весов только при денатурации облученной ДНК.

Для определения молекулярного веса макромолекул обычно используют весьма разнообразные методы, такие как измерение фоторассеяния, осмоса, вязкости и седиментации. С помощью этих методов сопоставимые результаты получают только в случае, если объект содержит молекулы с достаточно однородным распределением молекулярных весов. Но зачастую пробы состоят из фрагментов с различными молекулярными весами, что является следствием процедуры выделения ДНК. Такого рода распределение можно характеризовать двумя средними величинами:

Среднечисленным молекулярным весом (1)

И средневесовым молекулярным весом (2)

Где n_i — число молекул с молекулярным весом М_і.

Для случайного распределения молекулярных размеров (применимых ко многим препаратам ДНК) справедливо отношение:

(3)

При определении молекулярного веса в нестандартных образцах получают средние величины, зависящие от способа изменения. Большую часть применяемых способов дает результат, лежащий между M_n и M_w.На основании этих данных можно рассчитать скорость разрывов и поперечных сшивок. Поскольку первоначальный размер облученных молекул может меняться, обычно рассчитывается не число разрывов на молекулу, а их частота. Одноцепочечные разрывы часто выражаются в расчете на нуклеотид (B₁), а двухцепочечные — на пару нуклеотидов (B₂).

Облучение сухой ДНК вызывает однои двухцепочечные разрывы, частота которых линейно возрастает с дозой. Значение G, рассчитанное на графике, равно0,63 для одноцепочечных и 0,11 для двухцепочечных разрывов, т. е. одноцепочечные разрывы встречаются в пять-шесть раз чаще чем двухцепочечные. Если облучение проводится в атмосфере кислорода, то число двухцепочечных разрывов увеличивается очень незначительно (G=0.16), ВТО время как число одноцепочечных разрывов сильно возрастает (G=3.4). Тот факт, что присутствие кислорода незначительно увеличивает частоту двухцепочечных разрывов был отмечен при опытах с ДНК тимуса теленка и ДНК фага Т7.

Как было замечено, число двухцепочечных разрывов в облученной сухой ДНК увеличивается линейно с дозой.

Это означает, что двойной разрыв в системе вызывается одиночным событием потери энергии, а не случайным совпадением двух соседних одиночных разрывов. При облучении фага Т7 ускоренными ионами аргона одноцепочечные разрывы встречаются только в 2,3 раза чаще, в то время как для г-облучения эта величина достигает 5 или 6.

Разрыв двойной спирали происходит только в случае, если два одиночных разрыва точно или приблизительно противостоят друг другу. В последнем случае для обнаружения двойного разрыва необходимо раскрытие водородных связей на участке между двумя разрывами.

Принимая во внимание формулу (4) получим число двухцепочечных разрывов на пару нуклеотидов в растворе:

(5)

Где — число нуклеотидов между двумя двухцепочечными разрывами, вызывающими двойной разрыв, и в — число одноцепочечных разрывов до облучения. В необлученных пробах в настолько мало (например, 10^-4) что им можно пренебречь при высоких дозах.

Сравнения G для образования разрывов в облученной ДНК, полученных разными авторами, показало, что для водных растворов, большая часть полученных значений находится в диапазоне 0.3−0.8, а для ДНК, облученной в сухом состоянии, в клетках или в виде нуклеопротеидного геля — в диапазоне 0.3−0.7, т. е. примерно одно и то же количество энергии требуется для одноцепочечного разрыва в сухом состоянии и растворе. Поскольку количество двойных разрывов в растворе возникает пропорционально квадрату дозы, значения G в общепринятом смысле слова определить нельзя. Первоначально образуются лишь одноцепочечные разрывы, но с увеличением дозы доля двойных разрывов постепенно возрастает. Поэтому можно было бы ожидать, что в водной системе, если избранный критерий наблюдается только после двухцепочечного разрыва, кривые доза-эффект будут иметь плечо. Как упоминалось выше, в сухой ДНК число двойных разрывов возрастает линейно с дозой. При этом, по данным различных исследований, значения G лежат в диапазоне 0.1−0.15. В присутствии кислорода они несколько выше, чем при облучении ДНК в атмосфере азота или в вакууме. [1]

При облучении сухой ДНК могут возникать сшивки между отдельными молекулами ДНК, а так же разрывы полинуклеотидных цепей. Обратим внимание на рис. 4. Распределение коэффициентов седиментации в контроле отражает неоднородность молекулярных весов высушенной ДНК тимуса.

(Седиментация — направленное движение частиц в поле действия гравитации или центробежных сил. Скорость седиментации зависит от массы, размера и формы частицы, вязкости и плотности среды, а также от ускорения силы тяжести и действующих на частиц центробежных сил.)

После облучения максимум сдвигается к меньшим значениям S, (S-единица коэффициента сидементации, 1 S=10^-3сек). Это означает, что основная часть ДНК осаждается с меньшей скоростью, т. е. молекулярный вес в этом случае ниже, чем средний молекулярный вес контрольного образца. Это дополнительное доказательство наличия двухцепочечных разрывов при облучении сухой ДНК. На ряду со сдвигом максимума кривой распределения вправо на графике наблюдается увеличение количества ДНК в области 30−55 S. Эта фракция состоит из связанных друг с другом молекул с молекулярным весом от 20 до 100*10⁶ дальтон. Она намного меньше при облучении в азоте. Выход G для поперечной сшивки равен 0.16 в присутствии кислорода и 0.37 в вакууме.

Образование поперечных сшивок облученной ДНК происходит при участии свободных радикалов, способных при взаимодействии с кислородом превращаться в перекисные радикалы, благодаря чему тормозится образование части поперечных сшивок.

При облучении ДНК в водных растворах возникает гораздо более сложная ситуация, чем при облучении в сухом состоянии. Скорость образования возникающих поперечных сшивок зависит от многих параметров, включая размер, конформацию и концентрацию макромолекул, ионную силу растворителя, полярные эффекты, и т. д. Результаты опытов с синтетическими макромолекулами показали, что имеется оптимальная концентрация для образования поперечных сшивок. При более высоких концентрациях скорость их образования на единицу дозы уменьшается, постепенно приближаясь к величине, полученной при облучении в сухом состоянии.

При уменьшении концентрации частота возникновения поперечных сшивок снижается до тех пор, пока они совсем не исчезают при концентрации ниже критической. По мере увеличения молекулярного веса облученной молекулы критическая концентрация снижается. Если облучение проводится в диапазоне промежуточных концентраций, поперечные сшивки возникают с самого начала, но с возрастанием дозы деградация может уменьшить молекулярный вес фрагментов и тем самым поднять критическую концентрацию выше уровня концентрации фрагментов ДНК. Следовательно, в эти условиях образование поперечных сшивок не наблюдается даже после действия высоких доз.

К сожалению, скорость образования поперечных сшивок ДНК, облученной в водном растворе, до сих пор не исследовалась как функция различных параметров. Можно только отметить, что облучение вызывает появление поперечных сшивок у молекул также и в растворе Кокерель и другие облучали растворы ДНК бактериофага Т1 (концентрация 0.2 мг/мл) и определяли распределение молекулярных весов, измеряя вязкость и скорость седиментации при различных концентрациях.

При центрифугировании необлученной ДНК фага градиент (т.е. переход о т растворителя к раствору) очень четкий. Это указывает на однородность препаратов ДНК, которая достигается при очень тщательном выделении ее из бактериофага.

После дозы 1 крад часть ДНК остается неизменной, приблизительно треть деградировала и треть увеличилась в размере. После дозы 4 крад всего лишь несколько молекул сохраняют прежний размер, около 70% облученного материала имеют более низкий молекулярный вес, чем необлученная ДНК, и примерно 30%, благодаря поперечным сшивкам, обладают более высоким молекулярным весом, чем контроль. При дозах свыше 8 крад деградация преобладает над поперечными сшивками. Можно рассчитывать отношение разрывов к поперечным сшивкам, если для распределения известны средневесовой молекулярный вес М_w и среднечисленный молекулярный вес M_n. В описываемых опытах на каждые 4.7 двойных разрывов образуется одна поперечная сшивка. Это отношение будет зависеть главным образом от условий эксперимента. [1]

5. Разрыв водородных связей

облучение водородный полинуклеотидный цепь Число разорванных водородных связей в облученной молекуле ДНК можно измерить например с помощью электрометрического титрования кислоты, необходимой для денатурации ДНК. Степень денатурации ДНК можно также определить, используя гиперхромный эффект (уменьшение интенсивности поглощения при нарушении структуры ДНК). Это возможно благодаря тому, что оптическое поглощение нативной двухцепочечной ДНК меньше, чем можно было бы предсказать по числу нуклеотидов, т. е. коэффициент поглощения оснований в одиночной цепи или же в свободных нуклеотидах приблизительно на 30% выше, чем в инактной молекуле ДНК, в которой обе цепи соединены водородными связями.

Если число водородных связей уменьшается в результате облучения, то при этом должно возрастать оптическое поглощение. Такое явление наблюдается в подавляющем большинстве случаев. Однако увеличение само по себе не есть мера числа разорванных водородных связей, так как одновременно разлагается часть оснований, тем самым снижая абсорбцию. Эти два противоположных процесса можно выявить, измеряя поглощения в нейтральных и кислых растворах.

Поглощение, вызываемое гиперхромностью, увеличивается на 30−40% при денатурации необлученной двухцепочечной ДНК при pH<3,5. В противовес этому поглощение облученной ДНК выше в нейтральном растворе и ниже в кислом по сравнению с необлученным контролем. Снижение абсорбции при pH<3,5 целиком обусловлено разрушением оснований, тогда как увеличение поглощения в нейтральном растворе происходит благодаря наложению гиперхромности на снижение, вызванное распадом оснований. Если представить поглощение при pH<2,5 в зависимости от дозы, наблюдается линейная зависимость, за исключением случаев облучения с очень высокими дозами.

Такая же кривая получается, когда ДНК гидролизуют после облучения муравьиной кислотой, таким образом высвобождая все основания. Это показывает, что поглощение в области с низким рН является мерой числа неповрежденных оснований при условии, что продукты, образованные при облучении, не поглощаются при 260 нм. Правильность предположения подтверждается наблюдением, что при больших дозах, разрушающих водородные связи, величины абсорбции совпадают в нейтральной и кислой областях и уменьшаются с увеличением индуцированного радиацией распада оснований.

Разрыв водородных связей не может коррелировать с распадом оснований. Так, при 140 крад более 90% этих оснований все еще не повреждены, несмотря на то, что гиперхромность уменьшилась на 20% по сравнению с исходной величиной. Однако непосредственно на основании этих данных нельзя определить число разорванных водородных связей, поскольку не существует линейной зависимости между количеством неповрежденных водородных связей и изменением абсорбции под влиянием денатурации.

На основании кривых, определяется величина G=6.6 для разрыва одной водородной связи. Значения G, полученные другими авторами, лежат в диапазоне 2,7−60. такая широкая вариабельность часто может объяснятся недооценкой нелинейных отношений между гиперхромностью и числом разорванных водородных связей.

Утверждают, что при низких дозах на один одноцепочечный разрыв приходится примерно 14−25 разрывов водородных связей. Это значит, что в месте разрыва от трех до четырех пар нуклеотидов больше не связаны водородными связями. Эта цифра согласуется с приведенными ниже данными, показывающими, что одноцепочечные разрывы каждой цепи ДНК на расстоянии, меньшем трех нуклеотидов, приводят к образованию двойного разрыва. Относительно высокое число водородных связей, раскрывающихся на каждый одноцепочечный разрыв, можно объяснить проникновением молекул воды в двойную спираль после разрыва одной из цепей. В результате этого водородные связи между комплементарными основаниями частично замещаются связями между отдельными основаниями и молекулами воды, так что полинуклеотидные цепи эффективно «разносятся». Этот процесс, безусловно, должен до некоторой степени ограничиваться, т.к. в противном случае не останется ни одной двухцепочечной ДНК в водном растворе. Исходя из положений термодинамики, можно утверждать, что в системе, состоящей из двух перевитых цепей, раскручивание дает первоначальный выигрыш энтропии на развернутую связь. Выигрыш имеет максимальное значение и доходит до предела, когда развернутый участок цепи достигает некоторой «равновесной длины». Неразвернутый участок цепи содержит 15−25 водородных связей. [2]

6. Образование денатурированных участков

Образование денатурированных участков может быть выявлено хроматографически с помощью колонок из метилированного альбумина на кизельгуре. Фракция элюированного материала экспоненциально снижается с дозой при облучении водного раствора ДНК. Если ДНК после облучения разрушать ультразвуком до одной четверти от исходного молекулярного веса, доля элюированного материала возрастает в четыре раза. Из этого следует, что и этим способом можно делить молекулы на поврежденные и неповрежденные. Связанные с МАК-колонкой молекулы ДНК содержат «денатурированные области». Это небольшие области, примерно такого же размера, как и участки, получаемые при нагревании или действии сил сдвига, в которых два нуклеотидных тяжа больше не соединены водородными связями. Повреждения такого рода ренатурировать не удается. Увеличение числа одноцепочечных разрывов ДНКазой не влечет за собой одновременного увеличения числа денатурированных областей. Это означает, что упомянутые выше повреждения следует отличать от тех, которые являются результатом простых одноцепочечных разрывов, чем зон денатурации. [1]

Изменения, происходящие в молекулах ДНК, могут сохраняться в ряду поколений, поскольку они воспроизводятся в процессе репликации.

Мутации, причины возникновения которых нам неизвестны, называются спонтанными. Повышать частоту мутаций по сравнению со спонтанным фоном, т. е. индуцировать их, могут физические, химические и биологические факторы, действующие на генетический материал клетки. Физические факторы — это прежде всего коротковолновое излучение (ультрафиолетовые и рентгеновские лучи). К химическим мутагенам относятся аналоги оснований, производные акридина, алкилирующие и дезаминирующие агенты. Биологические факторы — это в первую очередь мигрирующие элементы (транспозоны и IS-элементы).

Мутации, независимо от того, имеют ли они спонтанное происхождение или индуцированы каким либо мутагеном, по характеру перестроек, происшедших в ДНК, можно разделить на мутации, состоящие в изменении одного нуклеотидного остатка молекулы ДНК, так называемые точковые мутации, и мутации, при которых наблюдается изменение участка молекулы ДНК размером больше одного нуклеотида. Точковые мутации в свою очередь могут быть разделены на несколько классов в зависимости от того, какие конкретно химические перестройки происходят в молекуле ДНК в рамках одного нуклеотидного остатка: замена, вставка или выпадение. К мутациям, затрагивающим сегмент бактериальной хромосомы, ведут выпадение нескольких оснований или даже генов, перемещение их в пределах одной хромосомы, умножение или удвоение части хромосомы.

Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых излучением, является образование пиримидиновых димеров в результате ковалентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже излучение вызывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных поперечных сшивок и поперечных сшивок между ДНК и белком. Ионизирующие излучения всех видов вызывают главным образом одноцепочечные разрывы в ДНК; разрывов, поражающих обе цепи, обычно на порядок меньше. Различные химические мутагены индуцируют образование внутрицепочечных и межцепочечных поперечных сшивок и одноцепочечные разрывы ДНК.

В процессе эволюции были выработаны способы защиты генетического материала от повреждающего воздействия облучения и различных химических факторов. В клетках прокариот обнаружены эффективные системы репарации мутационных повреждений. [6]

Наиболее изученными механизмами восстановления повреждений ДНК являются фотореактивация, вырезание повреждений и пострепликационное, или рекомбинационное, восстановление. Фотореактивация — наиболее простой механизм, восстанавливающий лишь индуцированные излучением повреждения ДНК, сопровождающиеся образованием пиримидиновых димеров. Особенность фотореактивации в том, что ее действие распространяется только на одну цепь ДНК и не зависит от того, является ли молекула в ДНК одноили двухцепочечной. Осуществляется фотореактивация светозависимым фотореактивирующим ферментом, обеспечивающим специфическое расщепление пиримидиновых димеров.

Вырезание повреждений — основной темновой механизм восстановления различных одноцепочечных повреждений ДНК, в том числе и пиримидиновых димеров. Особенность этого механизма репарации в том, что восстановление одноцепочечных повреждений происходит только тогда, когда неповреждена комплементарная цепь молекулы ДНК. В процессе темновой репарации происходит вырезание в одной из цепей молекулы ДНК коротких сегментов (длиной около 30 нуклеотидов), содержащих поврежденный участок, и последующее заполнение образовавшейся бреши комплементарными нуклеотидами с использованием неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы.

Механизмы, обеспечивающие восстановление повреждений в обеих цепях молекулы ДНК, зависят от характера повреждений. Принципиальная схема заключается в следующем. ДНКполимераза, катализирующая репликацию ДНК, «встретив» на своем пути повреждение, «перескакивает» через него, и процесс репликации продолжается. Образуются две дочерние молекулы, одна из которых содержит в одной цепи первичное повреждение, в другой — брешь, возникшую при репликации и располагающуюся напротив повреждения.

Заделывание бреши происходит путем генетического обмена между идентичными цепями сестринских двухцепочечных молекул. В результате каждая из них имеет теперь по одной неповрежденной цепи, которая может служить матрицей в процессе репарации повреждений разного типа.

Фенотипическое проявление мутаций. Поскольку мутация — это стабильное изменение наследственного материала клетки, она реализуется по тем же каналам, что и любая другая генетическая информация. На этом пути судьба мутаций различна. Некоторые из них не влияют на признаки организма, оставаясь «молчащими». Такие мутации могут не проявляться в процессе трансляции, т. е. не приводить к изменению аминокислотной последовательности синтезируемого белка. В другом случае изменение может происходить вдали от активного центра фермента и потому не сказываться на его функции. Если же мутация приводит к изменению в активном центре или резко влияет на его структуру, это сразу сказывается на функциях фермента. Диапазон изменения функциональной активности фермента в этом случае велик: от незначительного понижения активности до полной ее потери. В последнем случае это часто приводит к гибели организма.

Для проявления мутации необходимо, чтобы прошел по крайней мере один цикл репликации ДНК, в которой исходно имело место изменение нуклеотидной последовательности (премутация). Только если это исходное изменение закрепится после репликации в дочерней молекуле ДНК, оно становится стабильным, а отсюда и наследственным. Для выражения мутации в фенотипе необходимо прохождение этапов транскрипции и трансляции. Иногда для проявления мутационно измененного признака, т. е. фенотипического выражения мутации, необходимо несколько клеточных делений. Так, если мутация привела к нарушению способности синтезировать какой-либо витамин, например тиамин, то в течение нескольких генераций потребность в тиамине у мутантных клеток не обнаруживается. В этот период мутантные клетки доиспользуют тиамин, содержащийся в исходной немутантной клетке. Когда же запасы витамина иссякнут, мутанты смогут размножаться только при добавлении экзогенного тиамина.

На проявление мутантных признаков влияет также количество копий хромосомы, содержащихся в клетке. Все прокариоты гаплоидны, имеют набор генов, локализованных в одной хромосоме. В определенных условиях в клетке можно обнаружить несколько копий одной хромосомы. Если в такой клетке произошла мутация, приведшая к нарушению синтеза определенного метаболита, то она сразу (после одного цикла репликации-транскрипции-трансляции) не проявится, поскольку синтез необходимого клетке метаболита будет осуществляться в результате функционирования неповрежденных генов, содержащихся в остальных хромосомных копиях. Для фенотипического выражения мутантного гена необходимо, чтобы он содержался в клетке в «чистом» виде, т. е. клетка имела одну копию хромосомы с мутантным геном, или чтобы все копии хромосомы в клетке имели одинаковый генотип. Это происходит через несколько клеточных делений.

Выводы

В курсовой работе были приведены примеры использования биои физико-химических методов исследования изменений в облученной ДНК. Показаны типы различных изменений в такой ДНК. Некоторые химические, биологические и физические свойства облученной ДНК связаны воедино и невозможно изменение одной грани без изменения общей картины. Дальнейшее совершенствование методик исследования должно дать значительный вклад в понимание молекулярных механизмов действия излучения на ДНК и внести большой вклад в медицину, генетику, биологию и науку в целом.

Геномные мутации, возникающие как следствие облучения ДНК, и ее дальнейшего изменения, а так же возникающие нарушения, например хромосомные перестройки — причина многих наследственных заболеваний и врождённых уродств у человека. Поэтому ограждение человека от действия мутагенов — важнейшая задача. Огромное значение в этом отношении имеет запрещение испытаний ядерного оружия в атмосфере, загрязняющих окружающую среду радиоактивными веществами. Очень важно тщательное соблюдение мер защиты человека от радиации в атомной индустрии, при использовании радиоактивных изотопов, рентгеновских лучей и т. п. Необходимо изучение возможного мутагенного действия различных новых лекарственных средств, пестицидов, химических препаратов, применяемых в промышленности, и запрещение производства тех из них, которые окажутся мутагенными. Профилактика вирусных инфекций имеет значение и для защиты потомства от мутагенного действия вирусов. [8]

Некоторые ученые считают, что радиация в малых дозах может быть полезна, некоторые им противоречат. Еще в начале 20-го века, до открытий Беккереля, Марии и Пьера Кюри, люди даже не знали о существовании такого явления — радиоактивность, радиация. А после ряда техногенных катастроф это направление в науке повернуло в новое русло. Мне показалось будет интересным связать в курсовой работе облучение ДНК и пошагово, слой за слоем исследовать изменения, которые это излучение породило. Тем более что наука не стоит на месте, а постоянно претерпевает изменения, о свойствах ДНК узнают все больше.

Вся наша жизнь, наш организм начинается и заканчивается на уровне таких невообразимо сложных и совершенно невидимых нам процессов…

1. Кузин А. М, «Радиационная биохимия», 1962

2. http://nucloserv.jinr.ru/text/rb/radiacija.htm

3. www.medvuz.ru

4. Ш. Окада, «Радиационная биохимия клетки», М., 1974

5. http://www.xumuk.ru/encyklopedia

6. http://phm.bio.msu.ru/oldsite/edocs/micro

7. Пелевина И. И., «Молекулярная генетика и действие излучений на наследственность», М., 1963

8. http://www.cultinfo.ru/fulltext