Биохимические и коагулографичекие методы в ранней диагностике сердечно-сосудистых заболеваний

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

" КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

(ФГБОУ ВПО " КубГУ" )

Кафедра биохимии и физиологии

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ (ДИПЛОМНАЯ)

РАБОТА

БИОХИМИЧЕСКИЕ И КОАГУЛОГРАФИЧЕКИЕ МЕТОДЫ В РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Работу выполнила О. В. Высоцкая Научный руководитель, заведующий кафедрой, канд. биол. наук, доцент В. В. Хаблюк Нормоконтролёр, доцент, канд. биол. наук, доцент Н. Н. Улитина Краснодар 2014

Реферат

Работа выполнена на 66 страницах машинописного текста, включает шесть таблиц и 12 рисунков. В работе были использованы 54 литературных источника.

АКТИВИРОВАННОЕ ЧАСТИЧНОЕ ТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ, АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА, АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗА, ГЕМОСТАЗ, КРЕАТИНКИНАЗА, ОСТРЫЙ ИНФАРКТ МИОКАРДА, ТРОМБОЗ, ФИБРИНОГЕН, ФРАКЦИЯ МВ КРЕАТИНКИНАЗЫ, ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС.

Объект исследования — сыворотка больных с диагнозом «ИБС, острый коронарный синдром» разных половозрастных групп. Исследования проводились на базе ГБУЗ «Городская больница» г. Геленджика. Исследования выполнялись на автоматическом биохимическом анализаторе CHEM WELL и анализаторе гемостаза ACL ELITE PRO спектрофотометрическим, турбодиметрическим и гравиметрическим методами.

В результате проведенной работы была отслежена динамика ранних маркеров кардионекроза в остром периоде инфаркта миокарда и коагулографические факторы риска развития тромбообразования. Была установлена зависимость степени гиперферментемии от возраста и пола, что указывает на гендерные различия в основных анатомических и патофизиологических механизмах сердечнососудистых заболеваний. Изучение особенностей ишемической болезни сердца у женщин и мужчин разных возрастных групп, более ранняя диагностика и поиск оптимальной тактики лечения позволят улучшить качество жизни больных, прогноз заболевания, уменьшить риск сердечнососудистой смертности.

• Введение
• 1. Аналитический обзор
• 1.1 Острый коронарный синдром. Этиология и патогенез инфаркта миокарда
• 1.2 Метаболические и патоморфологические механизмы развития инфаркта миокарда
• 1.3 Лабораторная диагностика острого коронарного синдрома
• 1.3.1 Значение определения тропонинов для дифференциальной диагностики инфаркта миокарда
• 1.3.3 Диагностическое значение исследования активности аминотрансфераз (АСТ и АЛТ) в кардиологической практике
• 1.3.4 Исследования системы гемостаза в кардиологической практике
• 2. Материал и методы исследования
• 2.1 Материал исследования
• 2.2 Биохимические методы исследования
• 2.2.1 Определение активности креатинкиназы и её изофермента МВ
• 2.2.2 Определение активности аминотрансфераз (АСТ и АЛТ)
• 2.3 Коагулографические методы исследования
• 2.4 Статистическая обработка данных
• 3. Биохимические и коагулографические методы в ранней диагностике сердечно-сосудистых заболеваний
• 3.1 Динамика ранних маркеров кардионекроза в остром периоде инфаркта миокарда
• 3.1.1 Динамика активности креатинкиназы и её изофермента МВ
• 3.1.2 Динамика активности аминотрансфераз (АСТ и АЛТ)
• 3.2 Динамика изменения показателей гемостаза при остром инфаркте миокарда
• Заключение
• Библиографический список

Определения, обозначения и сокращения

АЧТВ — активированное частичное тромбиновое время АЛТ — аланинаминотрансфераза АСТ — аспартатаминотрансфераза ИБС — ишемическая болезнь сердца КК — креатинкиназа КК-МВ — изоформа креатинкиназы МВ МНО — Международное нормализованное отношение ОИМ — острый инфаркт миокарда ОКС — острый коронарный синдром ПТИ — протромбиновый индекс ССЗ — сердечнососудистые заболевания ССС — сердечнососудистая система

В настоящее время основной причиной смертности в цивилизованных странах являются сердечнососудистые патологии: атеросклероз, стенокардия, инсульты, ишемическая болезнь сердца и аневризмы — всего около 60 видов заболеваний. Сегодня доля этих заболеваний в структуре смертности составляет 40−60 процентов, при этом продолжается рост заболеваемости и поражение людей всё более молодого возраста [Сапрыгин, 2011].

Невзирая на очевидный успех в лечении ОИМ и нестабильной стенокардии, как основных форм острого коронарного синдрома, на их долю приходится более 50 процентов всех смертельных случаев. Из общего числа пациентов, поступающих в стационар с болевым синдромом в области груди, у 15 — 25 процентов обнаруживается ОКС. Ключевыми проблемами ведения пациентов с ОКС являются быстрый и точный диагноз, отбор больных на ранних этапах госпитализации, оценка степени риска и прогноза заболевания, назначение адекватной системы лечения. По данным различных авторов, своевременно не диагностируется от десяти до 42 процентов случаев ОИМ [Зайко, Быця, 1996].

Современные диагностические методы, основанные на изменениях биохимических показателей крови при ОИМ, оказывают эффективную помощь в своевременной постановке диагноза, контроле эффективности лечения и профилактике возможных осложнений. Биохимические маркеры гибели кардиомиоцитов наряду с клиникой и изменениями ЭКГ традиционно используются в ранней диагностике ОКС [Полякова, 2005].

Ранняя диагностика сердечнососудистых проблем невозможна без одновременного тестирования риска тромбообразования. При изучении патофизиологических механизмов широко распространенных сердечнососудистых заболеваний особого внимания заслуживает реологическая и коагуляционная дестабилизация крови с точки зрения её участия в развитии ОИМ и ишемического инсульта. Ранее выявление гемостатического баланса и применение адекватной терапии — одна из актуальных проблем современной кардиологии [Баркаган, Момот, 2001].

Несмотря на современные технологии в диагностике и интенсивной терапии, как причина смертности в Российской Федерации сердечнососудистые заболевания имеют стабильно высокий удельный вес — 52,7−56,0 процентов [Оганов, Масленникова, 2007]. Сердечнососудистые заболевания представляют большую социально значимую проблему, так как занимают ведущее место в структуре смертности, утраты нетрудоспособности и инвалидизации трудоспособного населения. Следует отметить, что эти люди являются наиболее активными членами общества и проблема злободневна как с научной, так и с социально-экономической точки зрения [Белякова, 2010].

В настоящий момент отмечается общее ухудшение демографических показателей. Динамика средней продолжительности жизни в большинстве стран современного мира характеризуется более благоприятными тенденциями у женщин по сравнению с мужчинами [Цыганков, Жаркова, 2009].

В связи с вышесказанным изучение этиологических аспектов и поиск новых патогенетических механизмов развития ОИМ у трудоспособного населения является актуальной задачей для клинической медицины [Белякова, 2010].

В связи с проблемой высокой смертности и инвалидизации трудоспособного населения, а также отрицательного демографического воздействия на него со стороны данных заболеваний, мы поставили перед собой цель — выявить половозрастные различия в динамике биохимических и коагулографических показателей в ранней диагностике ССЗ.

В связи с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Выявить динамику изменения биохимических показателей гибели кардиомиоцитов в разных половозрастных группах в остром периоде ОИМ.

инфаркт миокард диагностика маркер

2. Выявить динамику изменения коагулографических показателей в остром периоде ОИМ в разных половозрастных группах.

1. Аналитический обзор

1.1 Острый коронарный синдром. Этиология и патогенез инфаркта миокарда

Почти в 90 процентах случаев болезнь коронарных сосудов является следствием повреждения стенок артерий. Ранее этот процесс связывали с естественным старением организма, но теперь известно, что атеросклерозом могут страдать даже дети. При этом на внутренней стороне кровеносных артерий образуются атеросклеротические бляшки. Склеротические изменения приводят к уплотнению стенок и сужению просвета сосудов. Происходят они главным образом в аорте, а также в коронарных артериях и сосудах мозга. За питание сердца отвечают коронарные артерии, окружающие сердечную мышцу. Вследствие этого уменьшается приток крови к сердечной мышце. Работает она интенсивно и любой недостаток крови тут же отражается на её состоянии [Оганов, Фомина, 2006].

На начальных этапах заболевания происходит увеличение проницаемости и повреждение эндотелия. Гиперлипидемия является общепризнанным фактором риска атеросклероза. Атерогенные липопротеины повышают связывание и проникновение в стенку сосудов моноцитов, где они превращаются в макрофаги и пенистые клетки. Макрофаги стимулируют пролиферацию гладкомышечных клеток, синтезируют белки внеклеточного матрикса и тканевый фактор — основной активатор свертывания крови. Вследствие этих процессов образуется атеросклеротическая бляшка, в которой под фиброзной покрышкой находится ядро, содержащее пенистые клетки, липиды и тканевый фактор. Формирование бляшки — процесс медленный, но разрыв покрышки открывает доступ компонентов крови к тромбогенному ядру и может привести к быстрому образованию окклюзирующего тромба. Тромбоз — основная причина развития ОКС [Добровольский, 1999].

ОКС — любое сочетание клинических симптомов или признаков, позволяющих подозревать инфаркт миокарда (со стойким подъемом ST и без стойкого подъема ST, диагностированный по изменениям ферментов или биомаркеров, по поздним ЭКГ-признакам) и нестабильную стенокардию [Myocardial infarction redefined…, 2000].

Инфаркт миокарда — некроз (омертвение) отдельных участков сердечной мышцы на почве острой ишемии, возникшей в результате несоответствия коронарного кровообращения потребности миокарда в кислороде. В связи с тяжелым течением, высокой инвалидизацией и летальностью (общая летальность в острейшем, остром и подостром периодах ОИМ составляет около 30 процентов), своевременная диагностика этого заболевания является одной из актуальных проблем современной кардиологии [Шилов, 2009].

Основными причинами возникновения ИМ можно считать:

1. Атеросклероз и функциональные факторы (коронароспазм и др.);

2. Коронариты, обусловленные ревматизмом, аллергией, системными заболеваниями;

3. Эмболии и тромбозы коронарных артерий и весьма редко вен;

4. Воспалительные и дегенеративные процессы в сердечной мышце и коронарных артериях;

5. Врожденные аномалии сердца и коронарных сосудов.

Диагноз ОИМ, согласно рекомендациям ВОЗ, основывается на трех базисных постулатах:

1) клинической картине,

2) данных ЭКГ-исследований 3) выявлении гиперферментемии (повышенной концентрации миокардиальных маркеров) [Малая, Власенко, Микляев, 1991].

В подавляющем большинстве случаев (до 98 процентов) ОИМ развивается по одному из двух путей:

1 Одна из холестериновых бляшек трескается, и организм реагирует на возникшее повреждение. На место разрушенной бляшки мигрируют тромбоциты, которые образуют в коронарной артерии кровяной сгусток, значительно сужающий или полностью перекрывающий просвет сосуда. В результате острой недостаточности кровоснабжения участок миокарда, получавший питание с помощью данного коронарного сосуда, испытывает кислородное голодание — сердечные клетки, кардиомиоциты, отмирают — развивается инфаркт [Шевченко, 2011].

2 При резком повышении нагрузки на сердце (чрезмерная физическая активность, стресс, высокое артериальное давление и пр.) развивается острое несоответствие между доставкой кислорода по суженным атеросклерозом сосудам и потребностью клеток сердца в нем. В результате значительного кислородного голодания часть сердечной мышцы некротизируется [Малая, Власенко, Микляев, 1991].

В целом патогенез острого ИМ предполагает следующие этапы развития:

1) Механизмы формирования острой коронарной недостаточности;

2) Метаболические и патоморфологические механизмы развития клеточного повреждения в зоне острой ишемии и будущего ИМ;

3) Активация нейрогуморальных факторов, участвующих в формировании ответно-адаптивных реакций на уровне целостного организма. [Фадеев, 2007].

Врачами создано немало классификаций в зависимости от объема и локализации поражения, а также классификация острого ИМ по стадиям:

Продромальный период (длится до 30 суток, может отсутствовать).

Острейший период (длится до двух часов от начала ангинозного статуса).

Острый период (длится до десяти дней от начала инфаркта миокарда).

Подострый период (начинается с десятого дня и длится до двух месяцев).

Период рубцевания (в среднем длится от двух месяцев до полугода, иногда завершается лишь спустя два — три года) [Шилов, 2009].

ОИМ делится на трансмуральный, или иначе, крупноочаговый (с «зубцом Q» по данным ЭКГ), когда сердечная мышца повреждается на всю толщу, и нетрансмуральный (мелкоочаговый, без «зубца Q») [Аронов, 1998].

Таким образом, ОИМ развивается очень быстро, и от постановки диагноза в кратчайшие сроки и проведения своевременной адекватной терапии зависит дальнейший прогноз заболевания.

1.2 Метаболические и патоморфологические механизмы развития инфаркта миокарда

В происхождении ОИМ имеют значение следующие механизмы:

1. Прекращение кровотока в миокарде вследствие коронарного тромбоза на фоне атеросклероза коронарных артерий;

2. Локальный коронароспазм на фоне атеросклероза разной степени выраженности;

3. Недостаточность коронарного кровотока в условиях абсолютно или относительно повышенной потребности сердца в кислороде;

4. Локальные нарушения метаболизма миокарда (некоронарогенные некрозы миокарда) [Малая, Власенко, Микляев, 1991].

Наиболее частая причина развития ОИМ — тромботическая окклюзия атеросклеротически измененных коронарных артерий (от 90 до 95 процентов всех случаев), что документируется данными ангиографических и патологоанатомических исследований в первые шесть часов развития ишемии. Из других причин, вызывающих окклюзию коронарных артерий, наиболее важным следует считать повреждение сосудистой стенки и развитие тромбоза, способствующего возникновению вторичного спазма коронарных артерий. Первичность тромбоза коронарных артерий в генезе ОИМ до сих пор является предметом оживленной дискуссии [Фадеев, 2007].

Одновременно многочисленные клинические исследования неопровержимо доказали значимую роль спазма коронарных артерий в патогенезе ишемии и развития инфаркта миокарда. Установлено, что стенокардия Принцметала, при которой ведущим в патогенезе ишемической атаки является именно спазм коронарных артерий, в 20 процентах случаев заканчивается трансмуральным ОИМ.

Патологоанатомическим субстратом, способствующим развитию фатального спазма коронарных артерий, с последующим развитием коронаротромбоза, является атероматозный стеноз сочетании с повышенной агрегацией тромбоцитов [Шилов, 2009].

В действительности имеет место сочетание всех факторов, ведущих к окклюзии коронарных артерий. Спазм и тромбоз коронарных артерий чаще всего происходят в местах ее наибольшего атеросклеротического поражения. Разрывы интимы также чаще встречаются в местах выраженного атероматозного поражения сосудов. Следует обратить внимание, что в 70 процентах случаев коронаростеноз является динамичной ситуацией, а не стационарно ригидным состоянием. Потеря давления (энергии) при кровотоке через суженный участок — важнейшее гемодинамическое проявление стеноза. Симптомы ишемического эпизода возникают тогда, когда внутрисосудистое давление дистальнее стеноза становится ниже критического (больше 60 мм рт. ст.) для перфузии субэндомиокардиальных слоев [Шилов, 2009].

Согласно современным представлениям, в очаге нарушенного кровоснабжения сердечной мышцы происходит снижение концентрации АТФ и креатинфосфата при одновременном увеличении содержания АДФ и неорганического фосфора, что влечет за собой активацию и последующий распад митохондрий, контрактуру и некробиоз миофибрилл, прекращение деятельности АТФ-зависимых мембранных ионных насосов и последующую дезинтеграцию клеточных структур, т. е. развитие некроза сердечной мышцы. Возникающая диспропорция между ресинтезом и утилизацией АТФ, которая лежит в основе развития ОИМ, может быть следствием разнообразных патологических процессов [Малая, Власенко, Микляев, 1991].

Одним из механизмов повреждения кардиомиоцита может быть нарушение его мембранных структур вследствие перекисного окисления липидов, входящих в их состав, свободными радикалами и гидроперекисями. Повышение же уровня свободнорадикального окисления, в свою очередь, может возникнуть при нарушениях окислительного метаболизма в кардиомиоците или вследствие возникновения недостаточности антиоксидантных систем. Раньше всего нарушаются при этом функции специфических мембранных насосов, таких как Na⁺, К⁺-АТФаза, Са²⁺-АТФаза, и постепенно увеличивается проницаемость мембраны, затем происходит нарушение фосфолипидов в ней и появление дефектов. Нарушение мембраны ведет к изменению потоков ионов натрия, калия, хлора и воды, что вызывает набухание клетки, а также значительному поступлению ионов кальция, что вызывает развитие токсических эффектов этого катиона. Может увеличиваться число выявляемых б — и в-адренорецепторов и освобождение катехоламинов из нервных окончаний, что способствует углублению первоначального повреждения. В далеко зашедших случаях обменных нарушений дело может закончиться гибелью кардиомиоцитов [Зайко, Быця, 1996].

Основные цитологические признаки гибели миокардиальной клетки — исчезновение ядра в первый день развития ОИМ. При исследовании изменений клеточной структуры в различные сроки длительности ишемии выявлена характерная последовательность повреждения кардиомиоцитов, дающая важную информацию об основах нарушения насосной функции сердца, определяющей этапность развития инфаркта в клинической практике.

Изменения в ультраструктуре миокарда возникают уже через 20 минут после остановки кровоснабжения: уменьшаются размеры и количество гранул гликогена, развивается внутриклеточный отек, отмечается набухание и деформация саркопоазматического ретикулума, митохондрий, Т-тубул. Однако эти изменения субклеточных структур еще носят обратимый характер. При 60 минутной ишемии кардиомиоциты набухают, с разрушением и агрегацией ядерного хроматина, отмечается деформация митохондрий. Необратимые изменения в кардиомиоците возникают к концу двухчасовой окклюзии сосудов кровоснабжающих участок повреждения миокарда. Основными признаками необратимости повреждения миокардиальных клеток являются: исчезновение оптически плотных соединений вставочных дисков; значительное набухание саркоплазматического ретикулума в области зоны, А саркомера; значительное набухание и скопление митохондрий с незначительным количеством крист и большим количеством кристаллизованного кальция (Са²⁺); истончение, фрагментация и дезориентация миофибрилл; периферическая агрегация ядерного хроматина; увеличение саркоплазматического пространства; отслоение и повреждение сарколеммы. Набухшие митохондрии при длительной ишемии содержат кристаллы фосфатного кальция (Са²⁺), имеют аморфный плотности матрикс [Шевченко, 2011].

В настоящее время выделяют два типа ишемического повреждения миокарда: 1 — коагуляционный некроз — результат стабильной окклюзии коронарной артерии; 2 — контракционный некроз — результат смены окклюзии восстановлением кровотока (реперфузия) [Шилов, 2009].

Ранними гистологическими признаками коагуляционного некроза являются истончение и волонообразные изменения волокон миокарда. Подобные изменения возникают в результате воздействия растяжения объемами крови во время диастолического наполнения левого желудочка (истончение волокон) и систолического сжатия ишемизированных участков (волнообразность) нормально сокращающимися областями миокарда. Этот феномен гистологических изменений может быть обнаружен через несколько минут после начала клинических признаков развития ОИМ.

Механизмы контракционного некроза видимо имеют две фазы: А — ишемическое повреждение сарколеммы — клеточной мембраны кардиомиоцита, с нарушением ее разграничительной роли для экстрацеллюлярных электолитов (в частности для кальция (Са²⁺)); Б — неуправляемое избыточное вхождение кальция (Са²⁺) в саркоплазму, вслед за восстановлением кровотока, с чрезмерной активацией взаимодействия актиновых и миозиновых нитей (сокращение — контрактура) и формированием контрактурных полос, с последующей гибелью клеток (механическое внутриклеточное повреждение — «внутриклеточный разрыв») [http://medportal.ru/ enc/cardiology/infarction/].

Сразу же после развития ишемического или контрактурного некрозов возникают стереотипные этапы воспалительных и репаративных процессов, которые на первом этапе характеризуются миграцией полиморфно-ядерных лейкоцитов в зону некроза и достигают своего пика к четвертому дню развития инфаркта миокарда. Контроль за уровнем и темпом воспалительной реакции осуществляется системой компонентов воспалительных белков С. Интенсив-ность воспалительной реакции варьирует в зависимости от активности клеточной иммунной системы. При ее чрезмерной спонтанной агрессивности, аутоиммунная реакция может распространиться на здоровые миокардиальные клетки, что может лежать в основе рецедивирования инфаркта миокарда и развитии осложнений [Шилов, 2009].

При восстановлении кровотока в зоне ишемии после 40−60 минутной окклюзии, многие описанные структурные изменения саркомеров становятся более интенсивными: усиливается набухание клеток, появляется вакуолизация саркоплазмы и более значительное повреждение митохондрий, клеточная мембрана приподнимается над миофибриллами и появляются субсарколеммальные просветы.

Эти изменения внутриклеточных структур и митохондрий прежде всего являются следствием изменений в проницаемости сарколеммы — клеточной мембраны (повреждение разграничительной роли) для экстрацеллюлярной жидкости и электролитов, что ведет к нарушению водно-электролитного баланса клеток и выходу лизосомальных ферментов. Подобные изменения на уровне клеточных структур миокарда лежат в основе развития синдрома реперфузии [Шилов, 2009].

После восстановления кровотока активность ферментов, вышедших из поврежденного миокарда в кровь, повышается в первые четыре часа. Так, активности КК и КК-МВ повышаются на 12 часов раньше при реперфузии, чем у больных без реперфузии, а активность их бывает в два — четыре раза выше. Результаты повторных исследований уровня изоформ КК являются индикатором успешности реперфузии, так как она дает повторное вымывание фермента из ткани сердца в кровь [Карпищенко, 1997]

Различают несколько зон в очаге инфаркта. В центральной,

преимущественно субэндокардиальной области в клетках преобладают необратимые повреждения (перерастянутые миофибриллы, комкообразный ядерный хроматин, митохондрии с аморфными уплотнениями матрикса и дефекты плазматической мембраны). В промежуточной области находят некротизированные мышечные клетки с признаками кальциевой нагрузки (пересокращение миофибрилл, контрактуры, отложения фосфата кальция в митохондриях), аморфные уплотнения матрикса, комкообразный хроматин, липидные капли. Во внешней области инфаркта в мышечных клетках преобладает накопление липидных капель. В ней не наблюдается некротических нарушений. Соотношение между величиной различных зон имеет большое значение для прогноза заболевания и выбора тактики лечения. Погибшие клетки скоро окружаются нейтрофильными гранулоцитами, которые в дальнейшем сменяются макрофагоцитами, лимфоцитами и плазмоцитами. В дальнейшем рассасывающиеся кардиомиоциты замещаются фибробластами, образуется соединительнотканный рубец [Зайко, Быця, 1996].

Таким образом, ОИМ влечет за собой изменения, сопровождающиеся повреждением кардиомиоцитов и выходом ферментов в кровяное русло.

1.3 Лабораторная диагностика острого коронарного синдрома

Разработка методов диагностики острого коронарного синдрома и, в частности, ИМ представляет важнейшую задачу неотложной кардиологии. Тяжесть клинического течения ОИМ зависит от размера некроза сердечной мышцы. При диагностике ОИМ используются биохимические методы, практическая ценность которых заключается в наиболее полной оценке состояния больного, так как важно знать не только размеры некроза и ишемического поражения, но и динамику их развития [Карпищенко, 1997].

В результате гибели кардиомиоцитов повышается уровень биохимических маркеров цитолиза. Исторически для диагностики ОИМ использовалось определение активности одного из ферментов, вырабатываемого в нашем организме — креатинкиназы. Точнее, одна из ее составляющих — МВ-фракция креатинкиназы. Повышение активности КК-МВ наиболее специфично для ОИМ, однако, выявляется также и при нехирургических диагностических манипуляциях на сердце. Радиотерапия грудной клетки также может вызывать незначительное повышение уровня фермента. А вот аритмия, тахикардия и сердечная недостаточность практически не влияют на уровень КК-МВ [Аронов, 1998].

Неоценимым вкладом в решение всех вышеозначенных вопросов явилось введение в клиническую практику определения в сыворотке (плазме) крови миокардиальных маркеров — тропонинов I и Т — абсолютно специфичных и высокочувствительных для ситуации с ОКС. В настоящее время ведущие кардиологические сообщества Европы и США приняли рекомендации по диагностике основных форм ОКС, в которых определение концентрации тропонина Т (в сыворотке, плазме) крови рассматривается как важнейший диагностический критерий ОИМ. Повышение тропонинов отражает даже минимальный некроз миокарда, не выявляемый другими диагностическими методами, и что даже самое небольшое повышение их содержание в крови при остром коронарном синдроме всегда свидетельствует о худшем прогнозе заболевания [Сапрыгин, Романов, 2002].

При поступлении больного в стационар в ранние сроки после появления клинических признаков ОИМ желательно определить активность нескольких ферментов, в том числе и тех, активность которых, исходя из срока поступления, еще не повышена даже при наличии ОИМ. Целью такого исследования является выяснение «исходного» (фонового) уровня ферментемии сыворотки крови пациента. Наличие этой информации обеспечит в дальнейшем возможность объективной оценки индивидуальной динамики результатов ферментных тестов [Методические рекомендации…, 1992].

Как видно из таблицы 1, наиболее чувствительные и специфичные — сердечные тропонины Т или I (отражает и объем некроза), несколько менее специфична КК-МВ, КК, АСТ. Если нет возможности использовать тропонин, надо ориентироваться на КК-МВ. Диагностика реинфаркта зависит от срока развития и при еще повышенном уровне тропонина рекомендовано использование маркеров с более коротким «сроком» (КК МВ и миоглобин).

Таблица 1 — Временные интервалы диагностической значимости исследования активности ферментов сыворотки крови при ОИМ [Карпищенко, 1997]

Периодичность взятия проб крови при ОИМ:

при поступлении, через шесть — девять часов и в период до 24 часов (при отрицательных результатах предыдущих проб и вероятности ОИМ по клиническим данным).

Из изложенного выше совершенно очевидно, что диагностика цитолитического синдрома при ОИМ может быть эффективной при осуществлении динамических исследований миокардиальных маркеров. Высокая частота гиперферментемии при ОИМ имеет большое значение для подтверждения диагноза [Методические рекомендации…, 1992].

Использование программы лабораторной диагностики, выявление степени тяжести, контроль эффективности лечения, прогнозирование исходов ОИМ по данным лабораторных тестов внесет дополнительный вклад в повышение эффективности борьбы с этим заболеванием [Елисеев, 2006].

Таким образом, при развитии ОИМ, наиболее диагностически значимыми маркерами гибели кардиомиоцитов являются сердечные тропонины Т или I, а также МВ-фракция креатинкиназы.

1.3.1 Значение определения тропонинов для дифференциальной диагностики инфаркта миокарда

В конце восьмидесятых годов в крови больных ОИМ были обнаружены белки-тропонины, которые оказались специфичными для миокардиальной ткани. Тропонины (I, T и C) — это полипептиды, которые являются компонентами контрактильного аппарата мышечных клеток и в составе тропонин-тропомиозинового комплекса, связанного с актином, образуют тонкие филаменты миоцитов [Миродылов, 2003].

Тн-I существует в виде трех основных изоформ (две из них — скелетные, а одна локализируется в миокардиальных клетках). Кардиальная изоформа Тн-I отличается от мышечных весьма существенно: 40 процентов её аминокислотной последовательности специфичны для миокардиальной изоформы [Сапрыгин, Романов, 2002].

Тн-Т также имеет три основных изоформы, локализующиеся в сердечной и скелетной мышцах. Миокардиальные изоформы отличаются от мышечных по аминокислотным остаткам.

Особо следует подчеркнуть, что примерно шесть процентов Тн-I и Тн-Т не связаны с актомиозиновым комплексом, а находятся в цитозоле в свободном состоянии. Этот факт имеет особо важное значение для понимания кинетики высвобождения этих белков из поврежденных миоцитов. Мышечный и миокардиальный изоферменты Тн-С имеют идентичную первичную и вторичную структуры и, следовательно, не являются специфичными для этих тканей [Миродылов, 2003].

При развитии некроза миокарда тропонины поступают в периферический кровоток как в свободном, так и в связанном с другими компонентами тропонинового комплекса виде. Если растворенные в цитозоле белки относительно быстро вымываются из зоны некроза, деструкция сократительного аппарата кардиомиоцитов более продолжительна по времени, поэтому увеличение уровня тропонинов определяется в течение 14 дней после начала инфаркта миокарда [Кишкун, 2007].

В настоящее время концентрацию тропонинов в сыворотке можно быстро определить у постели больного при помощи полуколичественного экспресс-метода иммунохимического анализа, а также более точным количественным методом с использованием иммунологического анализатора в лабораторных условиях [Сапрыгин, Романов, 2002].

В большинстве кардиологических клиник исследование миокардиальных маркеров в основном ограничивается тремя главными показателями: концентрации КК-МВ, сывороточного миоглобина и тропонинов I или Т (рис.1).

Рисунок 1 — Динамика изменения уровней Тн-I или Тн-Т у больных ОИМ [Сапрыгин, Романов, 1998]

Критериями диагностической ценности того или иного белкового маркера являются диагностическая чувствительность и специфичность. Кроме того, имеют значение ещё два показателя: диапазон диагностической значимости, «патологический» уровень определяемого маркера, и «манифестность» проявления патологических значений показателя, т. е. степень его увеличения относительно уровня нормальных значений [Миродылов, 2003].

В большинстве исследований было показано, что возрастание сывороточных концентраций тропонинов, не наблюдается в первые часы после ангинозного приступа, а отмечается в тот же самый период, что и увеличение активности КК-МВ. Диагностическая чувствительность обоих тестов в период до шести часов колеблется от 25 до 55 процентов. После этого периода диагностическая чувствительность Тн-I и Тн-Т резко возрастает и достигает 96−100 процентов. Пик активности тропонинов приходится на 12−20 часов, достигая значительных величин — кратность возрастания равна 100−400, что намного выше показателя для КК-МВ и миоглобина. Наиболее ценное — пролонгированный диагностический период: нормализация концентрации тропонинов наступает к шести — 12 сут. от начала болезни [Карпищенко, 1997].

1.3.2 Диагностическое значение исследования активности креатинкиназы и её изофермента МВ в кардиологической практике

Креатинкиназа — молекулярная масса 81 кДа — клеточный фермент, широко представленный в тканях человека. Играет важную роль в энергетическом обмене. Его физиологическая роль заключается в создании АТФ для сократительной и транспортной систем. Повышенные уровни КК наблюдаются при заболеваниях скелетной мускулатуры и при ОИМ [Burtis, 1999; Tietz 1995, Young, 2001].

В типичных случаях ОИМ активность КК повышается к четырем — восьми часам, достигает максимума на первые — вторые сутки и снижается до исходного уровня к пятым суткам заболевания. Повторное увеличение активности КК может явиться следствием повторного ОИМ, приступа тахикардии, а также свидетельствовать о присоединении миокардита или перикардита. Величина активности КК, как правило, коррелирует с тяжестью и размерами ОИМ. По данным Д. Я. Шурыгина, у больных с крупноочаговым ОИМ активность КК нормализуется на шестые сутки, мелкоочаговым — четвертые сутки. В первые 12 часов после болевого приступа активность КК повышена в 89 процентах случаев крупноочагового и в 62 процентах случаев мелкоочагового ОИМ. По мнению М. Fisher et al., в первые трое суток наиболее рациональным в организационном и диагностическом плане является определение активности КК с интервалом в 12 ч. [цит. по: Камышников, 2009].

КК — гетерогенный энзим. молекула которого состоит из двух состоит из двух мономеров: М — мышечного (muscule) и В — мозгового (brain). КК-МВ фермент с молекулярным весом 87 кДа.

Главным образом он участвует в метаболизме в мышечной ткани сердца. Высвобождение КК-МВ в кровь при ИМ может быть обнаружено в течение трех — восьми часов после появления симптомов. Концентрация КК-МВ достигает пика от девяти до 30 часов и через 48−72 часа возвращается к исходным значениям [Lee, Goldman, 1996].

По данным Камышникова, увеличение активности КК-МВ начинается через четыре — шесть часов, максимум активности наблюдается к 12−18 часам, возвращение к исходному уровню через 40−56 часов от момента возникновения ОИМ. В то же время, у некоторых больных ОИМ повышение активности миокардиального изофермента КК выявлялось через 24−36 ч после развития заболевания, а нормализация — на пятые — седьмые сутки [Камышников, 2009].

Изменение уровня КК-МВ можно использовать для оценки размеров поражения сердечной мышцы. При осложнении ОИМ сердечной недостаточностью на фоне миокардита, перикардита или эндокардита наблюдается повышение активности изофермента МВ. Таким образом, имеется прямая зависимость между тяжестью клинического течения ИМ и степенью и длительностью гиперферментемии КК и КК-МВ [Карпищенко, 1997].

1.3.3 Диагностическое значение исследования активности аминотрансфераз (АСТ и АЛТ) в кардиологической практике

При участии аминотрансфераз в организме человека осуществляются процессы межмолекулярного переноса аминогрупп с донорской гамма-аминокислоты на акцептор — альфа-кетокислоту без промежуточного образования аммония, т. е. трансаминирование (переаминирование — обратимый перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты) — процесс, открытый российскими учеными Браунштейном и Крицман.

Трансаминирование играет ключевую роль в промежуточном обмене, т.к. обеспечивает синтез и разрушение отдельных аминокислот в организме. Три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланиновая — благодаря трансаминированию превращаются в соответствующие альфа-кетокислоты, являющиеся компонентами ЦТК. Окисляясь в нем, они служат источником энергии [Камышников, 2009].

Наиболее часто активность аминотрансфераз исследуют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда. При патологии гепатоцитов, ферменты, освобождающиеся из клеток, быстро оказываются в плазме крови. Миоциты миокарда имеют прямой контакт только с межклеточным пространством при низкой проницаемости капилляров. Освободившиеся ферменты достигают внутрисосудистого пространства преимущественно путем транспорта с лимфой.

Аспартатаминотрансфераза - белок с молекулярной массой 110 кДа. Это клеточный фермент, представленный в высокой концентрации в сердечной мышце, клетках печени, скелетной мускулатуры и в небольших количествах в других тканях.

Аланинаминотрансфераза - является второй важной аминотрансферазой, выделенной из тканей человека и хорошо изученной. Присутствует во многих органах: печени, почках, скелетных мышцах, миокарде, поджелудочной железе.

При использовании совместно с АСТ помогает в диагностике ОИМ, при этом значения АЛТ остаются в нормальных пределах, а уровни АСТ повышены [Burtis, 1999; Tietz 1995, Young, 2001].

АСТ более специфичен в диагностике ОИМ. Он повышается через три — восемь часов и достигает пика к началу вторых суток. Этот период и является более информативным. Активность АСТ увеличивается в два — пять раз и более и нормализуется на четвертые сутки [Назаренко, Кишкун, 2005].

Активность АЛТ изменяется при ОИМ незакономерно и в ряде случаев остается нормальной. Повышение активности АЛТ имеет место при тяжелых формах ОИМ с обширными некротическими изменениями в миокарде. Максимальное повышения АЛТ наблюдается на третий день заболевания.

Оценивая результаты тестов, следует отметить, что активность трансаминаз повышается и при других заболеваниях ССС (нестабильной стенокардии, пароксизмальной тахикардии, аритмиях), но при ОИМ активность АСТ повышается значительнее. Здесь можно использовать коэффициент Де-Ритиса — отношение активности АСТ/АЛТ. При ОИМ этот коэффициент больше одной целой тридцати трех сотых [Северина, 2007].

1.3.4 Исследования системы гемостаза в кардиологической практике

Система свертывания крови не существует в организме изолированно. Она биохимически и функционально связана с другими физиологическими системами, в том числе и с сердечнососудистой. Это означает, что процессы изменения и патология ССС безусловно отразятся на активности гемокоагуляции и, наоборот, патология системы свертывания обязательно скажется на функционировании лругих звеньев гомеостаза [Козлов, 2010].

Гемокоагуляционные тесты используют не только как способ ориентировочной оценки стадии и степени тяжести патологического процесса, но и как прогностические признаки развивающейся патологии с целью её предупреждения. Профилактика и лечение тромбофилий и их осложнений должны осуществляться как комплекс мероприятий, направленных на исключение или ослабление всех факторов тромбогенного риска [Дементьева, Ройтман, 1999].

Лабораторные тесты, которые следует выполнять больным с тромбозами, можно разделить на три группы:

1. Лабораторные исследования, выполняемые при выявлении причин развившегося тромбоза или предрасполагающих факторов. Например, при ряде биохимических нарушений из клеток в кровоток попадает аминокислота гомоцистеин. Следствием ее появления становится повреждение клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов. Это приводит к формированию условий для образования тромбов. Выявлена достоверная связь между повышением уровня гомоцистеина в плазме и увеличением риска развития ССЗ. Также к этой группе можно отнести определение активности антитромбина III, протеина C и S, выявление волчаночного антикоагулянта.

2. Вторая группа — маркеры активации свертывания. Это показатели скрытой от скриннинговых тестов повышенной активности плазменного гемостаза. В эту группу входят определение фрагмента один плюс два протромбина, тромбин-антитромбинового комплекса, продуктов деградации фибриногена. Острые, неотложные патологические состояния (например, ОИМ) — могут осложниться массивным отложением микротромбов в сосудистом русле по всему организму. Отражением борьбы с ними является повышение уровня Д-димера, который представляет собой мелкий «кусочек» того самого главного белка в тромбе (фибрина). Выявление этого факта позволяет проводить раннюю диагностику и терапию.

3. Третья группа — исследования, отражающие действия антикоагулянтов непрямого действия. Они выполняются в целях правильного подбора дозы. Эта группа исследований включает в себя определение функциональной активности тромбоцитов, АЧТВ, МНО [Баркаган, Момот, 2001].

При ИМ наблюдается преобладание гиперкоагуляционных процессов в первые два дня, в последующие пять — семь дней более выраженная тенденция гипокоагуляции, последняя сменяется вторичной гиперкоагуляцией. Опасным осложнением ИМ является синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания [Долгов, Щетникович, Добровольский, 2003].

Оценка состояния гемостаза при помощи определения параметров энзимного процесса, протекающего во всех фазах коагуляционного каскада и при фибринолизе сгустка, весьма перспективна для диагностики степени и коррекции нарушения гемостатического баланса при ССЗ [Дугина, 2004].

Таким образом, биохимические и коагулографические методы по праву занимают одно из ведущих мест в ранней диагностике заболеваний сердечнососудистой системы.

2. Материал и методы исследования

Работа выполнена на базе клинико-диагностической лаборатории и кардиологического отделения ГБУЗ «Городская больница» города Геленджика. Исследование проводилось с 15.11.2013 г. по 25.03.2014 г.

Исследование активности ферментов производилось на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе открытого типа CHEM WELL. Анализатор осуществляет спектрофотометрические, турбиди-метрические и потенциометрические методы исследования биохимических показателей. Исследование активности свертывающей системы гемостаза производилось на автоматическом анализаторе ACL ELITE PRO.

2.1 Материал исследования

Материалом исследования служила сыворотка и плазма крови, взятая у 40 больных с диагнозом ОИМ в возрасте от 40 до 87 лет, которые составили четыре экспериментальные группы. Контрольные группы составили 20 практически здоровых людей, проходивших плановую диспансеризацию. Всего было обследовано 60 человек.

Для получения достоверных данных, забор биоматериала проводился ежедневно с семи до восьми часов утра, натощак, до приема лекарств и процедур. Забор материала осуществлялся в специализированные вакуумные вакуеты. Сыворотка и плазма пациентов отбиралась методом центрифугирования и исследовалась не позднее двух часов с момента взятия биоматериала.

Контроль качества осуществлялся регулярно, посредством участия в Федеральной программе ФСВОК, внутрилабораторного контроля качества, использования контрольного материала, проведения процедур внутреннего контроля качества, обеспеченных программами лабораторного оборудования.

В план обследования были включены: определение активности КК, КК-МВ, АСТ, АЛТ, определение АЧТВ, фибриногена, ПТИ.

2.2 Биохимические методы исследования

2.2.1 Определение активности креатинкиназы и её изофермента МВ

Для получения экспериментальных данных использовался УФ-кинетический метод количественного определения КК [Tietz 1995, Young, 2001].

Принцип метода: КК катализирует обратимый перенос фосфатной группы от фосфокреатина к АДФ (1). Эта реакция ассоциирована с последующей: АТФ и глюкоза превращаются в АДФ и глюкозо-6-фосфат (2) под действием гексокиназы и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы окисляет глюкозо-6-фосфат и восстанавливает НАД (3):

Скорость образования NADРH, измеряемая фотометрически при 340нм, прямо пропорциональна каталитической активности (концентрации) КК, присутствующей в пробе. Референтные значения КК приведены в таблице 2.

Исследуемый материал: Сыворотка и гепаринизированная или ЭДТА-плазма.

Таблица 2 — Референтные значения активности КК

Метод: Кинетика по фактору (8095), время задержки 120 сек, время реакции 180 сек. Длина волны 340 нм, оптический путь один см, против бланка по дистиллированной воде или по воздуху, температура 25, 30 или 37 градусов

[Инструкция к биохимическим наборам SPINREACT, 2010].

Для определения активности КК-МВ использовался оптимизированный УФ тест в соответствии с рекомендациями DGKC (Германское Общество Клинической Химии) и IFCC (Международная Федерация Клинической Химии и Лабораторной Медицины) для КК с ингибированием изофермента КК-М моноклональными антителами [Lee, Goldman, 1996].

Принцип метода: КК-МВ состоит из субъединиц КК-М и КК-В. Специфические антитела против КК-М полностью подавляют активность КК-ММ (основная часть общей активности КК) и КФК-М (субъединицы КК-МВ). Измеряется только активность КК-В, которая составляет половину активности КК-МВ.

Принцип метода определения КК-МВ отображен в формулах (4 — 6).

Исследуемый материал: Сыворотка и гепаринизированная или ЭДТА-плазма.

Метод: Кинетика по фактору 8254, (8414), время задержки 120 сек, время реакции 180 сек. Длина волны 340 (334) нм, оптический путь один см, против бланка по холостой пробе, температура 37 градусов.

Референтные величины:

Риск ИМ высок при наличии трех условий:

1. КК: мужчины — более 190 Ед/л; женщины — более 167 Ед/л

2. КК-МВ: более 24 Ед/л

3. Активность КК-МВ составляет от шести до 25 процентов от общей активности КК [Myocardial infarction redefined…, 2000].

Если есть подозрения на ОИМ, а все три условия не выполняются, то это может означать недавний инфаркт. В этом случае измерения следует повторить через 4 часа со свежими образцами [Инструкция к биохимическим наборам SPINREACT, 2010].

2.2.2 Определение активности аминотрансфераз (АСТ и АЛТ)

Существуют две основные группы методов определения активности аминотрансфераз: конечной точки (колориметрические) и кинетические (спектрофотометрические). Мы использовали УФ-кинетический метод измерения в ультрафиолете по рекомендации МФКХ (IFCC) [Wong, 1996].

Принцип метода: АСТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата к a-кетоглютарату с образованием глютамата и оксалоацетата (7). Образующийся оксалоацетат редуцируется в малат малатдегидрогеназой и NADH (8).

Скорость снижения концентрации NADH, измеряемая фотометрически при 340нм, прямо пропорциональна каталитической активности (концентрации) АСТ, присутствующей в пробе.

Исследуемый материал: Сыворотка и гепаринизированная плазма.

Метод: Кинетика по фактору (-1750), время задержки 60 сек, время реакции 180 сек. Длина волны 340 нм, оптический путь один см, против бланка по дистиллированной воде или по воздуху, температура 25, 30 или 37 градусов.

Принцип метода: АЛТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аланина к a-кетоглютарату с образованием глютамата и пирувата (9). Образующийся пируват редуцируется в лактат лактатдегидрогеназой и NADH (10). Скорость снижения концентрации NADH, измеряемая фотометрически при 340нм, прямо пропорциональна каталитической активности (концентрации)

АЛТ, присутствующей в пробе.

Исследуемый материал: Сыворотка и гепаринизированная плазма.

Метод: Кинетика по фактору (-1750), время задержки 60 сек, время реакции 180 сек. Длина волны 340 нм, оптический путь один см, против бланка по дистиллированной воде или по воздуху, температура 25, 30 или 37 градусов.

Референтные значения АСТ и АЛТ приведены в таблице 3.

Таблица 3 — Референтные значения активности АСТ и АЛТ

[Инструкция к биохимическим наборам SPINREACT, 2010].

Коэффициент Де-Ритиса (АСТ/АЛТ) больше одной целой тридцати трех сотых указывает на ОИМ [Северина, 2007].

2.3 Коагулографические методы исследования

Универсальный, автоматизированный лабораторный метод должен соответствовать требованиям экспресс-анализа, т. е. выполняться за короткий промежуток времени (30−45 мин) при температуре плюс 37 °C и влажности воздуха 100 процентов. Исследование, проведенное на небольшом объеме цитратной или оксалатной крови, должно дать информацию о параметрах, на основании которых можно представить характер и степень нарушения коагуляционного потенциала и системы фибринолиза [Толстопятов, 1996]. Учитывая значимость тромбоэмболических и геморрагических осложнений при сердечнососудистых заболеваниях, диагностика гиперили гипокоагуляции должна базироваться на данных четырех — пяти параметров, определенных в цельной крови в каждой фазе коагуляционного каскада и на этапе фибринолиза

[Петрищев, Папаян, Шитикова, 1999].

В настоящее время в нашей лаборатории используется следующая программа исследования гемостаза:

1. Определение содержания фибриногена по методу Клаусса. Принцип: основан на измерении времени свертывания разведенной плазмы избытком тромбина. В этом случае время свертывания зависит только от концентрации фибриногена в

плазме. Расчет по калибровочной прямой. Референтные значения 1,8−4,0 г/л.

2. Определение активированного частичного тромбопластинового времени. Принцип: основан на измерении времени образования сгустка в разведенной плазме с помощью активатора внутреннего пути свёртывания в присутствии ионов кальция. Референтные значения: 24−34 сек.

3. Определение протромбинового времени. Принцип: основан на измерении времени образования сгустка с помощью тромбопластина с МИЧ. Вычисляют:

Время свертывания нормальной плазмы

1. ПИ = Время свертывания плазмы больного х 100% (11)

Референтные значения: 90−105%.

Время свертывания плазмы больного

2. ПО = Время свертывания нормальной плазмы, (12)

Референтные значения: 0,95−1,1

3. Международное нормализованное отношение: МНО = ПОмич. (13)

Референтные значения: 0,85−1,15 [Инструкции к наборам РЕНАМ, 2009].

2.4 Статистическая обработка данных

Математическая обработка данных проводилась с помощью методов вариационной статистики. Определялась средняя арифметическая величина (Х) показателей в каждой группе, равная сумме вариантов, деленной на число наблюдений (n); расчет стандартной ошибки (+ m) проводился программой Microsoft office Excel 2007, коэффициент значимости (р), Различия считались достоверными при (р) меньше или равном 0,05 [http://www.psychol-ok.ru/statistics/student/].