Актуальность исследования.
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) — это первое ретровирусное заболевание, которое быстро распространилось по всему миру, приобретя характер пандемии. Впервые СПИД описан у гомосексуалистов в США в 1981 году [144, 186, 236]. Два года спустя в лабораториях L. Montagnier [12] и R. Gallo [90] был идентифицирован возбудитель СПИДа — ретровирус человека, первоначально названный, соответственно, LAV (Lymphoadenopathy-associated virus) и HTLV-III. Сейчас он известен как вирус иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1). Несмотря на то, что более 20 лет научные ресурсы всего мира направлены на борьбу с этим заболеванием и, начиная с 1996 года, благодаря применению высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), заболеваемость СПИДом значительно сократилась, число ВИЧ-инфицированных продолжает расти. В 2004 году общее число людей, являющихся носителями ВИЧ, возросло и достигло самого высокого уровня в истории: по оценкам экспертов 39,4 миллиона (35,944, 3 миллиона) человек живут с этим вирусом. Эта цифра включает 4,9 (4,3−6,4) миллиона человек, инфицированных ВИЧ в 2004 году. За прошедший год глобальная эпидемия СПИДа унесла жизни 3,5 миллиона человек [299].
Надежда врачей на то, что с помощью ВААРТ удастся излечить ВИЧ-инфицированных больных, столкнулась с уникальными патогенетическими особенностями ВИЧ-инфекции, не позволяющими ни иммунной системе, ни применяемым в настоящее время анти-ВИЧ препаратам обеспечить полную элиминацию вируса из организма.
ВИЧ поражает самую сердцевину иммунной системы — CD4+ Т-лимфоциты, постепенно на протяжении многих лет уничтожая иммунокомпетентные клетки.
ВИЧ характеризуется высокой генетической и антигенной изменчивостью. Изоляты ВИЧ, полученные от одного и того же больного, но из разных отделов организма, а также выделенные на разных стадиях заболевания, отличаются по нуклеотидным последовательностям и антигенным свойствам. Кроме того, различные субтипы ВИЧ превалируют в различных географических областях. Все это осложняет создание вакцин против СПИДа и иммунотерапию.
Неспособность обратной транскриптазы ВИЧ контролировать стабильность генома, высокая скорость репликации вируса в условиях применения специфической противовирусной терапии приводит к отбору и неизбежному накоплению мутантных штаммов со сниженной чувствительностью к анти-ВИЧ препаратам.
Хотя все стадии жизненного цикла ВИЧ-1 являются потенциальными мишенями для антиретровирусной терапии, сейчас в клинической практике используют только три класса соединений: ингибиторы проникновения, ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. Причем, ко всем применяемым в настоящее время препаратам обнаружены резистентные мутанты ВИЧ-1. Поэтому очень важно, чтобы новые препараты были активны не только против 'диких' штаммов, но и против резистентных штаммов ВИЧ-1. Этого можно добиться путем создания препаратов, действующих на 'новые' мишени вирусного цикла, либо, если препарат направлен на 'старые' мишени, необходимым этапом должно быть тестирование его активности против резистентных мутантов ВИЧ-1.
Поскольку одной из задач нашей лаборатории является поиск новых перспективных антиретровирусных препаратов, мы были заинтересованы, в частности, в получении мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, изучении их фенотипических и генотипических свойств и исследовании перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.
Важной особенностью ВИЧ-инфекции является наличие штаммов ВИЧ-1, использующих различные ко-рецепторы — CXCR4 и CCR5 — для проникновения в клетки (штаммы Х4 и R5, соответственно) и поражающих различные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов [17, 219]. Поэтому необходим поиск лекарств, которые будут эффективны против штаммов ВИЧ-1 различной тропности.
Ключевые патофизиологические процессы ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани [74, 118, 225], что требует разработки специальных подходов для тестирования препаратов на лимфоидной ткани ex vivo. В настоящее время для тестирования анти-ВИЧ препаратов используются либо лимфобластоидные и моноцитарные перевиваемые культуры клеток человека, либо первичные культуры стимулированных мопонуклеарных (МКПК), лимфоцитарных или моноцитарных клеток периферической крови здоровых доноров, пермиссивных для репликации ВИЧ-1. Но у данных систем есть недостатки, которые ограничивают их применение. В частности, метаболизм природных пуклеотидов, как в перевиваемых культурах Т-лимфоцитов человека, так и в стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови усилен [85, 97, 200]. По-видимому, это связано с тем, что в данных системах нарушены природные взаимодействия, которые существуют между иммуннокомпетентными клетками и их окружением in vivo. Например, стимуляция МКПК фитогемагглютинином значительно меняет экспрессию CCR5 и CXCR4 ко-рецепторов на поверхности лимфоцитов [17, 325]. Основой вышеперечисленных in vitro моделей являются изолированные клетки периферической крови человека. Между тем, хорошо известно, что на долю периферической крови приходится менее 2% всех лимфоцитов организма [315], и изменения в периферической крови при ВИЧ-инфекции являются лишь отражением ключевых патофизиологических процессов, происходящих в лимфоидной ткани, которая содержит подавляющее большинство — 98% лимфоцитов организма человека и является основной мишенью для ВИЧ. Поэтому использование культуры лимфоидной ткани человека, в которой сохранена архитектоника ткани, стромальное окружение иммунокомпетентных клеток, обеспечивющее взаимодействие между антигенами, хемокинами, факторами роста, лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками, позволило бы проводить более адекватное тестирование новых препаратов с целью оценки их перспективности.
Наиболее труднопреодолимым препятствием в борьбе с ВИЧ-инфекцией является наличие многолетнего латентного резервуара инфекции в лимфоидной ткани. По последним оценкам ВИЧ интегрируется в геном и существует в виде стабильной латентной формы провируса в покоящихся CD4+ Т-лимфоцитах памяти в течение периода сравнимого с человеческой жизнью [277]. В такой форме вирус не чувствителен к ВААРТ и может быть активирован при активации Т-клеток памяти в ответ на специфический патоген [13, 39, 119].
Таким образом, сложные особенности патогенеза ВИЧ-инфекции требуют создания новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов.
Цель и задачи исследования
.
Целью нашего исследования была разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов in vitro, в том числе на лимфоидной ткани в соответствии с современными представлениями о патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Получить коллекцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к пуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.
2. Изучить фенотипические и генотипические свойства, полученных мутантов.
3. Исследовать перекрестную устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4.
4. Оценить подавление AZT-устойчивых мутантов ВИЧ-1 и штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.
5. Исследовать активность НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов против штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам в культуре лимфоидной ткани человека.
6. Разработать экспериментальную систему для оценки анти-ВИЧ активности постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.'.
Научная новизна работы.
Впервые получен мутант ВИЧ-1, устойчивый к фосфонату d4T.
Впервые проведено сравнительное исследование развития устойчивости к нуклеозидным аналогам и их фосфонатным производным.
Впервые показано, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и достигает более высокого уровня, чем к их фосфонатным производным.
Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.
Впервые проведено исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений — анионной поликарбоксилатной матрицы и ее производных, модифицированных адамантаном и норборненом.
Впервые показано эффективное ингибирование комплексными адамантани нонборненсодержащими мембранотропными соединениями репродукции Х4 штаммов LAI.04 и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов в культуре клеток человека МТ-4.
Впервые показана возможность использования культуры лимфоидной ткани миндалин человека для оценки анти-ВИЧ активности противоретровирусных препаратов.
Впервые проведено тестирование новых препаратов — микробицида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы UC781 и неконкурентного ингибитора обратной транскриптазы ниглизина в первичной культуре лимфоидной ткани миндалин человека. Показано, что эти препараты эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1, при этом R5 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 вирус.
Впервые разработана экспериментальная система для исследования препаратов, действующих на постинтеграционные стадии вирусной репликации в лимфоидной ткани человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным.
2. Фосфонатное производное d4T с высокой эффективностью подавляет репродукцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.
3. Комплексные адамантани нонборненсодержащие мембранотроппые соединения эффективно ингибируют репродукцию штаммов LAI.04 (CXCR-4-тропный вариант) и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов ВИЧ в культуре клеток человека МТ-4.
4. Культура лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной системой для оценки анти-ВИЧ активности перспективных противоретровирусных препаратов.
5. Препараты UC781 и ниглизин эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1 в культуре лимфоидной ткани миндалин человека.
6. Разработана экспериментальная система, перспективная для оценки препаратов, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.
Практическая значимость работы.
Созданная коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT, Н-phAZT, ddl, d4T, phd4T) может быть использована для оценки эффективности новых препаратов против резистентных мутантов.
Использование в качестве экспериментальной модели культуры лимфоидной ткани миндалин человека позволит тестировать перспективные соединения в условиях, приближенных к in vivo.
Разработанная экспериментальная система позволит оценивать препараты, направленные на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации. Апробация работы.
Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Вектор, Кольцово, 2001) — 8 и 9 международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001) — IX International conference «New informational technology in medicine and ecology» (Гурзуф, Украина, 2001) — XII International congress of virology (Paris, France, 2002), XV International round table «Nucleosides, nucleotides and nucleic acids» (Leuvev, Belgium, 2002), I Международном Симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» и Сателлитном Симпозиуме «Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия». (Кара-Даг, Украина, 2002) — 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, (Paris, France, 2003), симпозиуме «Интегративная медицина» (Кара-Даг, Украина, 2003) — международной конференции «Microbicides 2004» (Лондон, Великобритания, 2004) — международном симпозиуме «Keystone symposia on HIV Pathogenesis» (Банф, Канада, 2005).
Публикации.
По материалам диссертации имеется 17 печатных работ, в том числе 6 статей в отечественных и зарубежных журналах, 11 тезизов на международных конференциях.
Личный вклад соискателя заключается в проведении основной части экспериментов — по селекции и изучению фенотипических свойств AZT-, H-phAZT-, ddl-резистентных мутантов, в исследовании анти-ВИЧ активности мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови, в изучении анти-ВИЧ активности НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека, и в разработке экспериментальной системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.
Результаты по селекции AZT-, H-phAZT-, ddl-, d4Tи phd4Tрезистентных мутантов, получены в соавторстве и при непосредственной помощи О. А. Плясуновой. Результаты по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol получены сотрудником нашей лаборатории Н. М Гашниковой.
Автор благодарит О. А. Плясунову, П. М. Кузину и С. А. Сафонову за обучение методам безопасной работы с инфекционным материалом, освоение вирусологических и культуральных методов и неоценимую помощь при проведении экспериментов. Н. М Гашникову за сотрудничество по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol. А. Г. Покровского за научное консультирование.
Автор благодарит сотрудников Лаборатории Клеточной и Молекулярной Биофизики (NICHD, USA) — J.-Ch. Grivel, Y. Ito за приобретенные навыки работы с первичной культурой миндалин человека, а также помощь в освоении методов флуоцитометрии и ПЦР в реальном времени.
Автор благодарит Н. Г. Перминову, И. В. Тимофеева и А. В. Сербина за любезно предоставленную возможность исследования новых мембранотропных соединений и за научное консультирование.
Автор благодарит Dr. R. Shattock за любезно предоставленный препарат UC781.
Автор благодарит Dr. B. Berkhout и A.T.Das за любезно предоставленную возможность работы с досксициклин-зависимой вирусной конструкцией HIV-rtRT и за научное консультирование.
За научное руководство работой автор выражает особую благодарность О. А. Плясуновой и Л. Б. Марголису.
выводы.
1. Создана коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы — AZT, d4T, ddl, H-phAZT, phd4T. Показано, что все отобранные мутанты эффективно реплицируются в чувствительных клетках и проявляют цитопатические свойства. В гене pol наряду с классическими резистентными мутациями впервые выявлены и описаны новые мутации.
2. Впервые установлено, что резистентность ВИЧ-1 к нуклеозидным аналогам развивается значительно быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным (KPazt=160,8 и КРн-рилгт = 7,8- KPd4T=70 и KPphd4t-14,8). Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T, a H-phAZT — резистентных к d4T и ddl.
3. Установлено, что AZT-резистентпые мутанты обладают высокой перекрестной устойчивостью к H-phAZT и умеренной — к d4Tр1^4Т-резистентный мутантумеренной устойчивостью к d4T и незначительной — к AZT. Для d4Tи ddl-устойчивых мутантов кросс-резистентность не выявлена. Впервые показано, что II-pliAZTустойчивый мутант обладает низкой перекрестной устойчивостью к AZT.
4. Сравнительное исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 выявило высокую эффективность иигибирования репликации штаммов Х4, а также AZT-устойчивых мутантов комплексными мембранотроппыми соединениями, модифицированными адамантаном и норборненом, по сравнению с исходной анионной поликарбоксилатной матрицей. Показано, что бициклическое производное норборнеиа As504 избирательно эффективно против штамма X4lai 04 в первичной культуре МКПК.
5. Впервые показано, что препараты AZT, H-phAZT, ddl высоко активны против Х4 и R5 вирусов в культуре лимфоидной ткани ex vivo. В этой системе эффективность ddl в против Х4 вируса в 40 раз выше, чем против R5 вируса.
6. Впервые ex vivo в культуре лимфоидной ткани показано, что ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы UC781 эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1. R5 ВИЧ-1 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 ВИЧ-1. Краткой преинкубации ткани с UC781 достаточно для предотвращения репликации ВИЧ-1 в течение, по крайней мере, 12 дней.
7. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать препараты, ингибирующие постинтеграционные стадии вирусной репликации. В данной экспериментальной системе было показано, что продуктивная инфекция CD4+ Т-лимфоцитов приводит к их массовой гибели, в то время как латентно зараженные и незараженные CD4+ Т-лимфоциты не погибают.
Список используемых сокращений ВААРТ — высокоактивная антиретровирусная терапия ГК — глицирризииовая кислота.
ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный калониестимулирующий фактор
ДМСО — диметилсульфоксид.
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
КР — кратность резистентности.
ИП — ингибиторы протеазы.
МКПК — мононуклеарпые клетки периферической крови.
НзИОТ — нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.
НтИОТ — нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы.
ННИОТ — ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.
ОТ — обратная транскриптаза.
ПЦР — полимеразная цепная реакция.
РНК — рибонуклеиновая кислота.
ТАМ — тимидин-ассоциированные мутации.
ФГА — фитогемагглютинин.
ЦНС — центральная нервная система.
AZT — 3'-azido-2', 3'- dideoxythymidin.
AZT-MP — 3'-azido-2', 3'- dideoxythymidine-5' - monophosphate AZT-TP — 3'-azido-2', 3'- dideoxythymidine-5' - triphosphate CD — cluster of differentiation.
CC50 — цитотоксическая концентрация, на 50% снижающая жизнеспособность клеток dATP — 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate ddA-TP — 2', 3'-dideoxyadenosine 5' - triphosphate ddl — 2', 3'-dideoxyinosine dNTP — deoxyribonucleotide triphosphate ddN — дидезоксинуклеозиды ddNTP — дидезоксинуклеозидтрифосфат d4T — 2', 3'-didehydro-2', 3'-dideoxythymidine- 5'-diphosphate d4T-DP — 2', 3 '-didehydro-2', 3 '-dideoxythymidine d4T-TP — 2,3'-didehydro-2', 3'-dideoxythymidine — 5' - triphosphate.
IC50 — 50% ингибирующая концентрация.
IC90 — 90% ингибирующая концентрация.
FDA — Food and Drug Administration.
MlP-la — macrophage inflammatory protein la.
MIP-1J3 — macrophage inflammatory protein 1P.
MNR — множественная резистентность к нуклеозидным аналогам.
NSI — non-syncytium-inducing.
R5 — штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CCR5.
RANTES — regulated on activation, normal T cell expressed and secreted.
SI — syncytium-inducing.
X4 -штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CXCR4.
