Состав и функциональные особенности прилипающей фракции пуповинной крови человека

Актуальность работы.

В трансплантологии все большее место занимает пересадка мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [28,125,172], основным источником которых до последнего времени являлся костный мозг [10,14]. Направления этой терапии связаны со свойствами МСК поддерживать кроветворение при котрансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК) [67,76,188]- подавлять иммунные конфликты при аллогенной, особенно неродственной трансплантации [132]- замещать и восстановливать функции поврежденных негемопоэтических тканей (кости, хряща, скелетных мышц, сердечной мышцы, нервной ткани, печени и др.) [24,191,252]. Преимущества МСК в клеточной терапии определяются их иммуномодулирующими способностями, иммунотолерантностью при аллогенной трансплантации и возможностью наработки больших количеств в относительно несложных условиях культвирования [12]. Альтернативными источниками МСК, кроме костного мозга, являются жировая ткань [235], пуповинная кровь, пупочный канатик [199], плацента [30,100] и амниотическая жидкость [101]. Пуповинная кровь (ПК) представляет особый интерес ввиду ее доступности, относительной легкости получения и безопасности для потенциального донора [78]. Как показали многочисленные исследования [32,63,.82,135], МСК могут содержаться в прилипающей клеточной фракции пуповинной крови, требующей культивирования для наработки необходимых для трансплантации количеств МСК. Однако в тоже время имеется ряд публикаций, опровергающий данный факт [150,242], до сих пор остаются неразработанными условия препаративной подготовки и культивирования прилипающей фракции пуповинной крови. Отсутствует четкое представление о клеточном составе, функции первичной культуры прилипающей фракции и ее связи с клеточным составом пуповинной крови. Отдельного внимания заслуживают и эндотелиальные предшественники, недавно обнаруженные в пуповинной крови [116,182,185], обладающие уникальной способностью к постнатальному неоангиогенезу.

Именно поэтому настоящее исследование, посвященное изучению состава и функции первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, представляется высоко актуальным.

Целью настоящей работы явилась стандартизация условий препаративной подготовки, культивирования и оценка клеточного составапервичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать метод культивирования монослойной культуры пуповинной крови (МКПК) доношенных новорожденных.

2. Разработать критерии стандартной оценки первичной культуры" прилипающей фракции пуповинной крови.

3- Оценить влияние на г состав МКПК временных параметров заготовки и хранения образца ПК.

4. Выявить наличие и характер связи между фенотипическим составом мононуклеарной фракции пуповинной крови (МФПК) и ее монослойной культуры.

5- Охарактеризовать дифференцировочные потенции МСК-подобных клеток МКПК.

6. Создать культуральную модель для характеристики гемостимулирующей функции МКПК и оценить колониестимулирующую активность последней.

Научная новизна.

Впервые разработан метод структурного анализа первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, основанный на определении соотношения основных клеточных популяций по характерному фенотипу. Отработана оригинальная культуральная модель для характеристики гемостимулирующей функции МКПК и оценки ее колониестимулирующей активности. Впервые было показано, что прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия близкое к таковому стандартного фидера. При этом существенное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами МСК (С090+С03г). Научной новизной характеризуются результаты сравнения клеточного состава МКПК и МФПК, показавшие, что культивирование прилипающей фракции пуповинной крови увеличивает долю ранних кроветворных предшественников (С034+НЬАБК~) за счет уменьшения доли более зрелых (С034+С045+), при этом отмечается также и увеличение доли эндотелиальных предшественников (С034+СБ45″ и С045~СБ31+).

Научное значение имеют полученные в работе данные о структуре первичной культуры прилипающей фракции пуповинной крови, изменении ее при различных сроках культивирования и в первом пассаже. Было выявлено, что на фоне длительного культивирования большая часть гемопоэтических клеток элиминируется из культуры и не способна к повторной адгезии. В то же время среди негемопоэтической популяции наблюдается обратное — МСК и эндотелиальные предшественники способны к экспансии в исследованных культуральных условиях, а последовательное пассирование способствует увеличению их концентрации в культуре. Получены важные научные данные о способности МСК монослойной культуры дифференцироваться в адипоциты и остеобласты, подтверждающие функциональную полноценность этих клеток.

Научно-практическое значение заключается в разработке оптимального метода культивирования прилипающей фракции пуповинной крови и референтных показателей клеточного состава популяции, характеризующих первичную культуру этих клеток. Особое практическое значение имеет изучение влияния на состав и функцию первичной культуры сроков и способов препаративной подготовки. Показано, что на фоне увеличения временных параметров забора и хранения образцов ПК снижается концентрация в монослойной культуре МСК-подобных клеток и гемопоэтических клеток, что в свою очередь снижает гемостимулирующую способность МКПК. С целью оптимизации изоляции и последующей экспансии негемопоэтической фракции МКПК показано предварительное выделение мононуклеарной фракции ПК на градиенте плотности.

Работа выполнена в лаборатории регуляции кроветворения (заведующая — д.б.н. Осипова Е.Ю.) отдела молекулярной гематологии (руководитель — к.м.н. Румянцев С.А.) Федерального научно-клинического центра гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор — член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.).

выводы.

1. Монослойная культура пуповинной крови (МКПК) представляет собой гетерогенную популяцию. Медиана относительного количества зрелых клеток гемопоэтического ряда составляет (СБ45+) 60,17%- стволовых гемопоэтических клеток (С034+СБ45+) — 0,59%, фенотипически сходных с эндотелиальными предшественниками (СБ34+СВ45~) — 0,31%, и мезенхимальными стволовыми клетками (СБ90+СВЗГ) — 0,50%.

2. Увеличение времени культивирования мононуклеарной фракции пуповинной крови (МФПК) (более 23 дней) приводит к постепенной элиминации из культуры гемопоэтических клеток и возрастанию доли МСК и ЭКП.

3. При пассаже фенотип культуры меняется. При пассировании количество гемопоэтических клеток существенно снижается, на фоне чего увеличивается концентрация негемопоэтической составляющей монослойной культуры ПК.

4. При увеличении времени, предшествующему забору ПК, отмечается снижение относительного количества МСК-подобных клеток и увеличение концентрации эндотелиальных предшественников в МКПК.

5. Основное различие в структуре популяций МФПК и МКПК заключается в том, что при культивировании значительно изменяется соотношение ГСК и ЭКП среди СБ34-положительной популяции в пользу ЭКП.

6. МСК-подобные клетки МКПК способны к дифференцировке в адипогенном и остеогенном направлениях, что подтверждает их функциональную состоятельность.

7. Прилипающая фракция первичной монослойной культуры оказывает стимулирующее влияние на колониеобразование гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, по характеру и силе воздействия близкое к таковому стандартного фидера. Существенное влияние на их пролиферативную активность оказывают клеточные элементы с маркерами МСК (СБ90+СБ31″).

8. Удлинение временных параметров забора и хранения образцов ПК приводят к снижению их гемостимулирующей активности.

Практические рекомендации.

1. Оценку состава монослойной культуры пуповинной крови рекомендуется проводить при следующих условиях культивирования: мононуклеарные клетки, выделенные на градиенте плотности Фиколла 1,077 г/л.

7 2 эксплантируются в концентрации 1"10 на 1 см в культультуральные пластиковые флаконы с полной питательной средой, содержащей 20−25% эмбриональной телячьей сыворотки, предварительно протестированной на способность к поддержке роста MGK костного мозга, и среду DMEM с содержанием глюкозы 1 г/л.

2. Для количественной оценки состава монослойной культуры пуповинной крови рекомендуется использовать следующие индексы," позволяющие провести структурный анализ основных популяций образующих монослой культуры ПК: индекс гемопоэтических клеток — CD45+/CD45″ =1,511- индекс созревания миелоидных клеток — CD14+/CD45+=0,28- индекс ГСК — CD34+CD45+/CD45+= 0,008- индекс ЭКП — CD34+CD45″ /CD45″ =0,013 и индекс, характеризующий долю МСК среди негемопоэтической популяции МКПК — CD90+GD317GD45″ =0,013.

3. Заготовку образца ПК следует производить в первые пять минут после рождения ребенка.

4. Выделение мононуклеарной фракции ПК с последующей инициацией культуры должно проводиться в первые 15−19 часов после заготовки образца ПК.