Состав лейкоцитарного пула и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях [3,44,45,83].

Оптимальным аллогенным донором для трансплантации ГСК является брат или сестра больного, совпадающий по HLA системе. Если среди членов семьи нет HLA-идентичного донора, то можно выполнить трансплантацию ГСК с использованием костного мозга неродственного донора, совместимого по HLA.

Поиск подходящего донора костного мозга — дорогой и длительный путь, и иногда пациент не доживает до трансплантации [1,38,43]. Вероятность того, что для пациентов, принадлежащих к этническим меньшинствам, найдется HLA-идентичный неродственный донор, может быть еще меньше, поскольку встречаемость определенных HLA-типов в различных этнических группах значительно варьирует.

Таким образом, становится понятно, насколько актуален поиск альтернативных источников ГСК для трансплантации. Одним из источников ГСК для трансплантации является пуповинная кровь (ПК).

Сбор ПК не причиняет донору никакого вреда, и эту кровь легко собирать. Криообработанная пуповинная кровь может быть быстро использована для трансплантации. Вероятность заражения вирусными инфекциями низка и может быть заранее исключена. Использование криообработанной пуповинной крови может иметь с иммунологической точки зрения некоторые преимущества перед i трансплантацией костного мозга, так как возможно выполнение иммунологических перекрестных проб с реципиентом.

Традиционно маркером ГСК считается CD34, однако, в последние несколько лет описан маркер CD133, который многие авторы считают более ранним маркером стволовых клеток, а С0133+клетки — обладающими большим гемопоэтическим потенциалом.

Первая в мире трансплантация кроветворных клеток пуповинной крови была осуществлена в 1988 г [30,45], после чего этот источник гемопоэтической ткани стал применяться во многих странах. В дальнейшем в Европе, Америке, Японии стали создаваться банки ПК [49,55,57,98] и к концу 2004 г в Европе было произведено более 3000 пересадок гемопоэтических клеток пуповинной крови у детей и взрослых [43].

Успешность трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК. Важным вопросом при применении пуповинной крови в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества ГСК, содержащихся в образце ПК и дозы клеток, необходимой для успешной трансплантации [24,46,91].

Определение количества гемопоэтических стволовых клеток и их пролиферативной активности, а так же учет факторов оказывающих влияние на состав и биологические свойства клеток ПК является актуальной задачей при проведении сбора, заготовки клеток ПК.

Цель и задачи исследования

Цель работы: определить состав лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови доношенных новорожденных, влияния на него различных состояний антеи интранатального периода и технологических этапов сбора и заготовки пуповинной крови для криоконсервирования.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Определить морфологический состав и иммунологическую характеристику лейкоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных.

2. Определить количество и субпопуляции CD34+ и CD133+ клеток пуповинной крови доношенных новорожденных.

3. Изучить влияние антропометрических данных, пола новорожденного, срока гестации и особенностей течения беременности и родов на состав лимфоцитов и стволовых гемопоэтических клеток пуповинной крови.

4. Оценить колониеобразующую активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

5. Определить степень и характер влияния процедуры лейкоконцентрации на состав лейкоцитов и предшественников гемопоэза пуповинной крови.

В работе получены данные, содержащие научную новизну. Показано, что количество СОЭ4+клеток в ПК составило 0,83±0,023% от общего числа ядросодержащих клеток. Количество наиболее ранних клеток-предшественников — CD34 CD133 клеток составило 0,46±0,05%. Количество мезенхимальных стволовых клеток — CD133+CD106+ составило 0,48±0,07%, а эндотелиальных клеток-предшественников — CD133+CD31+ - 0,88±0,11% от общего числа ядросодержащих клеток.

При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше, чем у девочек, как в процентном соотношении, так и в абсолютном количестве. Также у мальчиков выше и эффективность клонирования ПК.

Количество CD34+ клеток имеет тенденцшо к повышению при увеличении массы новорожденного, зависит от массы плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповинной крови во время 4-х родов по сравнению 1 — 3-ми родами. Показано, что количество CD34+ клеток в ПК статистически значимо выше при острой гипоксии плода во время родов и статистически значимо ниже при хронической гипоксии плода в период беременности.

Колониеобразующая активность ПК зависит от количества CD34+ клеток. Эффективность клонирования пуповинной крови доношенных новорожденных наибольшая при гестационном возрасте 39 недель, за счет большего количества смешанных колоний — наиболее ранних клеток-предшественников гемопоэза (KOE-mix).

Научно-практическая значимость.

При проведении процедуры концентрации пуповинной крови, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается за счет снижения доли моноцитов, эозинофилов и базофилов.

Процедура лейкоконцентрации не влияет на количество С1)3+клеток, в том числе CD3+CD4+icieTOK и CD3+CD8+icieTOK и активированных лимфоцитовС025+клеток. В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля СЭ19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD 16+С056+клеток.

Количество миелоидных предшественников (КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М), также как и количество CD34+ клеток зависит от количества нормобластов в ПК. У новорожденных с большим количеством нормобластов в ПК количество CD34+ клеток и миелоидных клеток-предшественников статистически значимо выше.

Практическое значение работы заключается в получении значений, характеризующих состав лейкоцитов пуповинной крови, которые рекомендуется использовать в качестве факторов определяющих показания и противопоказания к сбору пуповинной крови для безвозмездного донорства ГСК. Кроме того, полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.

Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы».

Результаты работы доложены на X Съезде педиатров России (февраль 2006).

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава и ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы».

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ — член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев), на базе лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток (зав. — к.м.н. С.А.Румянцев) ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» (директордоктор медицинских наук, профессор О.А.Майорова). А.

выводы.

1. Средние показатели абсолютного количества лейкоцитов и лейкоцитарных субпопуляций пуповинной крови доношенных новорожденных получены следующие: лейкоциты: 17,24±5,24×109/л, нейтрофилы: 8,41±3,02×109/л, лимфоциты: 5,54±1,99×109/л, моноциты: 2,42±1,01×109/л, эозинофилы: 0,64±0,34×109/л, базофилы: 0,23±0,18×109/л.

2. Показано, что количество С034+клеток в пуповинной крови составило 0,83±0,023% от общего числа ядросодержащих клеток. Количество наиболее ранних клеток-предшественников — GD34+CD133+KneTOK составило 0,46 ± 0,05%. Количество мезенхимальных стволовых клеток — CD133+CD106+ составило 0,48 ± 0,07%, а эндотелиальных клеток-предшественниковCD 133+CD3 Г — 0,88 ± 0,11% от общего числа ядросодержащих клеток.

3: При сравнении полученных результатов выявлено, что у мальчиков CD34+ клеток больше, чем у девочек как в процентном соотношении (0,88±0,03 мальчики- 0,77±0,03 — девочкир=0,01), так и в абсолютном количестве (0Д06±-0,005 — мальчики- 0,095±0,005 — девочкир=0,002). Количество CD34+mieTOK имеет тенденцию к увеличению при повышении массы тела новорожденного, зависит от веса плаценты, статистически значимо меньше при сборе пуповиннои крови во время 4 родов-по сравнению 1 — 3 родами. Статистически значимо выше при острой гипоксии плода и ниже при хронической гипоксии плода.

4. Увеличение абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов статистически значимо повышало эффективность клонирования пуповинной крови, за счет клеток предшественников всех ростков гемопоэза.

5. Получена сильная статистически значимая положительная корреляционная взаимосвязь между количеством нормобластов в пуповинной крови и количеством КОЕ-ГМ (г=0.6778- р=0,0004), КОЕ-Г (г=0,7833- р=0,1) и КОЕМ (г=0,7811- р=0,1), а также суммарным количеством КОЕ (i=0,6367- р=0,0011). В группе новорожденных с большим количеством нормобластов, количество С034+клеток в пуповинной крови статистически значимо выше. Имеется достоверная положительная средняя корреляционная взаимосвязь абсолютного количества CD34+ клеток в пуповинной крови и KOE-mix в мл образца (г=0,3888- /?=0,001), КОЕ-ГМ (г=0,4285- р=0,001), КОЕ-Г (г=0,2887- р=0,0018), КОЕ-М (г=0,3197- р=0,0005) и общим количеством КОЕ в мл образца (г=0,4187- р=0,001).

6. Выявлено, что у мальчиков достоверно больше количество КОЕ-ГМ на 1 мл образца (745,71±65,11 — девочки- 1216,7±185,45 — мальчикир=0,022), и имеется тенденция к увеличению (недостоверно) количества КОЕ-М (691,64±78,6 -девочки- 1052,1±252,09 — мальчикир=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 — девочки- 6070,8±691 — мальчикир=0,16) на 1 мл образца пуповинной крови. При подсчете на 105 MNC у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 — девочки- 22,42±1,6 — мальчикир=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция к увеличению количества KOE-mix (р—0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,13) и КОЕ-Эр (р=0,14).

7. Эффективность клонирования пуповинной крови доношенных новорожденных наибольшая при гестационном возрасте 39 недель, за счет большего количества смешанных колоний — KOE-mix.

8. Показано, что при проведении процедуры концентрации пуповинной крови, основанной на процессе седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов достоверно повышается за счет того, что доля моноцитов, эозинофилов и базофилов достоверно снижается. Процедура лейкоконцентрации не влияла на количество СБЗ+клеток, в том числе CD3+CD4+KneroK и CD3+CD8+i0ieT0K и активированных лимфоцитов — СБ25+клеток. В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля СБ19+клеток и натуральных киллеров (NK) CD 16+СБ56+клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Полученное значение количества CD34+ рекомендуется использовать в качестве референтных значений при сборе и заготовке клеток пуповинной крови для трансплантации.

2. Полученные данные о влиянии особенностей течения беременности и родов на количество CD34+ клеток пуповинной крови рекомендуется использовать при определении показаний и противопоказаний к сбору клеток пуповинной крови для безвозмездного донорства.

3. Количество нормобластов статистически значимо взаимосвязанное с количеством CD34+ клеток и колониеобразующей активностью рекомендуется учитывать, как дополнительный, благоприятный признак при проведении отбраковки пуповинной крови на этапе первичного тестирования.