Токсикогенетический подход к санитарно-гигиенической оценке промышленных сточных вод и их химических компонентов

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Развитие промышленного производства с неизбежностью приводит к поступлению в природную среду огромного количества химических загрязнителей [177, 178]. От умения своевременно выявлять их негативное действие на живые организмы, определять спектр индуцированных ими повреждений, устанавливать степень активности и прогнозировать отдалённые, в т. ч. генетические последствия действия, зависит решение ряда санитарно-гигиенических вопросов, связанных с применением тех или иных технологических решений, обеспечивающих оздоровление природной среды и населения [108, 114, 121−123]. Вместе с тем, оценивать уровень биологической опасности загрязнителей для живых организмов, включая и человека, можно на основе экспериментальных исследований с применением точных и надежных методов. Однако в настоящее время не существует универсальной тест-системы и общепринятых критериев для оценки генотоксической активности промышленных загрязнителей, циркулирующих в водной среде [86]. Вследствие этого дальнейшего развития требует совершенствование токсикогенетических методов исследования, обладающих высокой информативностью и хорошей воспроизводимостью результатов.

Вышеизложенное послужило основанием для выбора темы диссертации, определило её цель и задачи, а также свидетельствует об её актуальности.

Цель диссертационной работы — разработать токсикогенетический подход, позволяющий оценивать санитарно-гигиеническое состояние водоемов, испытывающих постоянное воздействие промышленных сточных вод и их химических компонентов, по комплексу количественных показателей.

В соответствии с поставленной целыо были определены следующие задачи:

1. Разработать способ, позволяющий интегрально оценивать эколого-гигиеническую опасность промышленных сточных вод и химических веществ, циркулирующих в водной среде, по показателям генотоксичности, где в качестве тест-объекта используется культура Daphnia magna Strausтипичного представителя гидробионтов.

2. Определить оценочные критерии, позволяющие характеризовать степень выраженности токсичности и мутагенности ксенобиотиков, поступающих в природные водоемы.

3. Предложить алгоритм токсикогенетических исследований, на основе «Способа оценки генотоксичности водных сред».

4. Апробировать токсикогенетический метод исследования на примере промышленных сточных вод ОАО «Братский ЦКК» и их химических компонентов.

5. Обосновать возможность применения токсикогенетического метода для санитарно-гигиенической оценки качества воды природных водоемов, испытывающих постоянное воздействие антропогенных загрязнителей.

Научная новизна работы состоит в дальнейшем развитии важнейшего раздела профилактической медицины — методического подхода к оценке качества водных сред в условиях техногенного загрязнения. Экспериментально обоснован токсикогенетический метод изучения промышленных загрязнителей водной среды, который позволяет оценивать степень выраженности их генотоксичности с выделением лимитирующего фактора вредности и проводить систематизацию экологически обусловленных повреждений. Предложена критериальная оценка, определяющая уровень токсикогенетической активности промышленных загрязнителей, позволяющая устанавливать их гигиеническую значимость.

Разработан «Способ оценки генотоксичности водных сред», прототипом которого является «Способ оценки токсичности водных сред», признанный изобретешь! (A.c. СССР № 1 234 770, 1986 г.). Апробация предложенного способа показала его высокую чувствительность и пригодность для тестирования широкого круга химических веществ, попадающих в водную среду с промышленными отходами. Принципы, заложенные в нем дают возможность при минимальных затратах, получать надежную информацию о генотоксических свойствах тестируемых веществ, с целыо ограничения контакта человека с веществами, циркулирующими в водной среде, опасными для наследственных структур.

Теоретическая значимость работы связана с возможностью определения повреждающих механизмов действия ксенобиотиков на организменном уровне. Кроме того, разработанный метод может служить инструментом для изучения партеногенеза на примере Daphnia magna Straus, а также модификационной изменчивости и её роли в процессе адаптации живых организмов в неблагоприятных условиях внешней среды.

Практическая значимость работы связана с тем, что эффективность метода позволила рекомендовать его для внедрения в производственный контроль на ОАО «Братский ЦКК» для биотестирования промышленных сточных вод (Акт внедрения от «1» сентября 2005 г.). Материалы выполненных исследований используются при разработке планов природоохранных мероприятий службой экологического контроля и природопользования ОАО «Братский ЦКК» (Акт внедрения от «6 мая» 2006 г.), что имеет профилактическое значение для оздоровления природной среды. По результатам исследований разработано методическое пособие «Биотестирование загрязнителей водной среды».

Основные положения, выносимые на защиту: 1 «Способ оценки генотоксичности водной среды», позволяет выявлять среди промышленных загрязнителей, циркулирующих в водной среде, генотоксиканты на основе комплекса количественных показателей, определяя специфичность их действия.

2. Принципы, заложенные в ток’сикогенетическом методе исследования, позволяют предложить критериальную оценку токсичности и мутагенности промышленных загрязнителей, ранжировать их по степени активности и, в случае необходимости, ориентировать санитарно-гигиенические исследования на определение генетического риска их мутагенного воздействия на человека.

3. Применение токсикогенетического метода для изучения отдаленных эффектов действия очищенных сточных вод ОАО «Братский ЦКК» и их химических компонентов указывает на то, что существующая система очистки сточных вод не обеспечивает их генетической безопасности.

5. Апробация метода показала его высокую эффективность и возможность использования для определения генотоксической активности широкого круга ксенобиотиков.

Апробация диссертационной работы. Основные положения работы доложены на заседаниях Секции генетических аспектов проблемы «Человек и биосфера» МНТС ГКНТ СССРна семинарах лаборатории генетики Иркутского госуниверситетана научно-технических советах Байкальского института экотоксикологии и Сибирского НИИ целлюлозы и картона Минлесбумпромана областной конференции «Состояние здоровья населения города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды», г. Иркутск, 1991; демонстрировались на выставках ВДНХ СССР (удостоверения № 38 310 и 33 096) и удостоены бронзовой медали ВДНХ СССР (удостоверение № 46 600) — на заседаниях Отдела экологического контроля и природопользования ОАО «Братский ЦКК» в 2001;2005 гг., на 4-ом Российско-Японском международном медицинском симпозиуме, 1996 г.- на международном байкальском симпозиуме «Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs», 2003 г.- на XII Symposium of Russia-Japan Medical Exchange, 2005 r.

Публикации. По теме диссертационных исследований опубликовано 26 работ в открытой печати.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 181 странице, содержит 45 таблицы, 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результаты собственных исследований представлены в главах 3−5, заключения, выводов, библиографического списка и приложения. Библиографический указатель включает 292 отечественных и 57 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан «Способ оценки генотоксичности водных сред», позволяющий оценивать уровень эколого-гигиенической опасности антропогенных загрязнителей, циркулирующих в природных водоемах, по комплексу количественных показателей, включающих:

— определение токсичности по коэффициентам Lq (летальный эффект) и Ко (изменение плодовитости выживших после экспонирования самок),.

— определение мутагенности по коэффициенту &, оценивающему уровень генетической активности по способности индуцировать летальные (Кр-2), сублетальные (L ??2) и морфологические мутации {¡-л).

2. Разработаны критерии, позволяющие характеризовать степень выраженности токсико-генетической активности исследуемых загрязнителей водной среды.

3. Показано, что очищенные сточные воды ОАО «Братский ЦКК» снижают резистентность популяции D. magna Str., оказывая влияние на их генеративную функцию и развитие потомства, изменяют структуру популяции (L0 = 2,6−25,0- К0 = 1,4−7,0- & = 13,5), что указывает на необходимость дальнейшего повышения эффективности очистных сооружений.

4. Установлено, что при разведении очищенных сточных вод, уровень токсико-генетической активности снижается (L0 = 1,1−21,4- К0 = 0,6−7,0- & = 0,3−16,0).

Гигиенически безопасными можно считать очищенные сточные воды, разбавленные более, чем в 100 раз (Lо — 0,7−0,8- Ко — 0,6−0,7- & - 0,3−0,8).

Лимитирующим показателем вредности является мутагенность (& = 2,4−16,0- ^ = 0,0−1743,0).

5. Сточные воды с этапа отбеливания целлюлозы обладают чрезвычайной токсичностью и слабой мутагенностью (Lo = 26,7- Ко — 3,5- & = 8,6-/^= 167,0).

В процессе разбавления уровень их токсико-генетической активности снижался (¿-о = 1,3−30,0- К0 = 1,0−3,9- & = 6,8−8,6- р = 0,0−300,0).

6. Модельная смесь фенолов в диапазоне концентраций, соответствующих их возможному содержанию в сточных водах, проявляет чрезвычайную токсичность в отношении тест-объекта {Ь0 ~ 7,0−17,0- К0 = 1,0) и слабую мутагенность (& — 4,3- ^ = 0,0).

7. Вода из Братского водохранилища характеризуется как умеренно токсичная и генетически не активная (Л^ < 18,0%- К0 — 0,58−1,87- & = 0,91,0).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Изменчивость является основным движущим фактором эволюции и адаптации организмов. Она зависит от условий их жизни в окружающей среде, в которой циркулируют биологически активные агенты, способные нарушать наследственный материал. Список чужеродных агентов обладающих потенциальной генетической опасностью, поступающих в объекты природной среды с промышленными выбросами, и с которыми неизбежно контактирую живые организмы, постоянно пополняется новыми названиями. Имеются противоречивые сведения о генотоксических свойствах одних и тех же техногенов, в связи с чем делать однозначные заключения об их отрицательных последствиях действия не возможно. Кроме того о генотоксичности подавляющего большинства промышленных загрязнителей в научной литературе не имеется никаких сведений. Все это определяет необходимость решения вопросов прикладного значенияразвитие методов экспериментальных исследований, направленных на разработку рекомендаций, способных предупреждать или ограничивать распространение техногенных генотоксикантов в среде обитания живых организмов. Теоретические положения, обсуждаемые в научной литературе по эколого-гигиенической оценке качества водных объектов в условиях промышленного загрязнения, а также практические материалы, полученные при выполнении данной диссертационной работы, нашли отражение в разработанном методе, призванном обеспечить комплексный анализ токсико-генетической опасности загрязнения природных водоемов химическими агентами техногенного происхождения. Его практическое использование позволит ответить на целый ряд вопросов, без которых невозможно сегодня говорить о путях снижения нежелательных последствий действия техногенных загрязнителей на состояние природных экосистем. К их числу следует отнести:

— есть ли среди техногенов, циркулирующих в природных водоемах, генотоксические?

— насколько они опасны в диапазоне концентраций, воздействующих на организмы в течение жизни в водной среде?

В основе проведения экспериментальных исследований по определению генотоксической активности приоритетных агентов техногенного происхождения лежит традиционный подход, предусматривающий рутинную экспертную оценку по заранее составленной схеме, при строгой регламентации концентраций, времени и способа воздействия техногенов на выбранный тест-объект, а также набора тестов, позволяющих описать их токсико-генетическую характеристику.

Анализ выполненных работ на стадии планирования, позволил определить модель, проведения экспериментальных исследований по выявлению генотоксической активности промышленных загрязнителей предприятий ЦБП и установлению степени их влияния на качество воды в природных водоемах, технологически связанных между собой (рисунок 29).

Представленная программа испытаний на генотоксичность техногенных загрязнителей, с одной стороны традиционна, т. е. построена на принципах комплексности, ступенчатости и выборочности тестирования, а с другой — отражает тенденцию «адаптации» исследований в зависимости от особенностей изучаемого агента и коррекции ее в соответствии с результатами, полученными на разных этапах исследования. Заключительным этапом в токсико-генетических исследованиях является прогноз генотоксической ситуации при техногенном загрязнении водных систем. В его задачи входит решение вопросов, касающихся гигиенических аспектов опасности влияния техногенов на состояние природных водоемов. В ее основе лежит оценка генотоксической активности техногенов с целыо установления его потенциальной опасности для обитателей водных систем, а следовательно опосредованно на человека. Для этого используются результаты экспериментальных исследований в которых изучается наследственная.

Рис. 29. Схема определения токсико-генетической активности техногенных загрязнителей водной среды [219].

136 генетически обусловленная патология и это является главной методологической особенностью токсикогенетики.

Однако при выборе методов исследования необходимо учесть:

— их комплексность, обеспечивающую возможность при тестировании техногенов характеризовать их способность индуцировать различные категории генотоксических повреждений;

— их значимость в прогностическом отношении;

— возможность валидизации показателей регистрируемых ответных реакции у тест — организмов при воздействии на них техногенов.

Все выше обозначенные принципы токсико-генетических исследований промышленных загрязнителей были положены в основу разработанного нами «Способа оценки генотоксичности водных сред». Способ позволяет интегрально оценивать токсические и мутагенные свойства химических загрязнителей. Токсическое действие определяется по гибели и плодовитости у гидробионтов, подвергавшихся воздействию анализируемого фактора. Генетическая активность оценивается по способности изучаемого агента влиять на генетические структуры гидробионтов и приводить к нарушениям в ДНК, а как следствие этого — к появлению в популяции D. magna Str. сублетальных, летальных и морфологических мутантов.

При биологическом испытании 'химических техногенов наиболее важное значение имеет проблема критериев вредности при оценки выявляемых изменений [225]. Только качественные и количественные характеристики, описывающие состояние физиологической нормы, в отличие от патологии, способны реализовать основную идею профилактической токсикогенетики — концепцию критериальной оценки, позволяющую определять порог вредности для всех видов действия.

В связи с этим, для оценки выраженности генотоксической активности исследуемых токсикантов предложены критерии, разработанные на основе экспериментальных исследований. Величина определяемого показателя коррелирует со степенью их токсичности и мутагенности. Данное обстоятельство может иметь существенное значение для решения «судьбы» циркулирующих в водных объектах техногенов. Основные положения концепции критериальной оценки качества водных систем и токсико-генетической активности техногенных загрязнителей, циркулирующих в них, могут быть заключены в следующем:

1. Порог вредного действия подразумевает такие изменения, которые достоверно выходят не только за пределы параллельного контроля (фонового уровня), но и превышают пределы физиологических колебаний для данного вида. Согласно предложенным критериям к:

— умеренно токсичным следует отнести те агенты, которые индуцируют гибель D. magna Str. в пределах 5 > L0 > 2, а плодовитость изменяется в диапазонах 0,4 < К0< 0,8 и 1,5 < К0 < 4,0;

— токсичным следует отнести те агенты, которые индуцируют гибель D. magna Str. в пределах 8 > L0 > 5, а плодовитость изменяется в диапазонах К0< 0,4 и 4,0 < К0;

— высокотоксичным следует отнести те агенты, которые индуцируют гибель D. magna Str. в пределах 10 > L0 > 8;

— чрезвычайно токсичным следует отнести те агенты, которые индуцируют гибель D. magna Str. в пределах L0 > 10;

— генетически неактивным следует относить те агенты у которых уровень их мутагенности достоверно не отличается от спонтанного уровня или величины мутирования в контроле (&), более чем в 2,0 раза;

— агентам со слабой мутагенной активностью относятся те, для которых значение величины & не превышает фоновые показатели более чем в 10,0 раз;

— к агентам со средней мутагенной активностью относятся те для которых значение величины & не превышает фоновое значение более чем в 100,0 раз;

— агентами с высокой мутагенной активностью относятся те для которых значение величины & превышает фоновое значение более чем в 100,0 раз.

2. Сопоставление степени выраженности генотоксичности исследуемых агентов с уровнем активности стандартных токсикантов и мутагенов, что позволяет в доступных пределах экстраполировать результаты экспериментальных исследований на другие биологические объекты с учетом их особенностей. Это достигается за счет сопоставления уровня токсико-генетической активности изучаемых агентов с равнозначным эффектом действия стандартных токсиканта фенола и мутагенов ЭМС и N-HMM при их изоэффективных концентрациях.

Умеренно токсичные агенты — равно эффективные фенолу в концентрациях соответственно 0,01 мг/л.

Токсичные агенты соответствуют действию фенола в концентрации 0,1 мг/л.

Чрезвычайно токсичные агенты соответствуют действию фенола в концентрации 1,0 -100,0 мг/л.

Агенты со средней мутагенной активностью соответствуют действию эталонных агентов по величине &: ЭМС в концентрации от 0,1 -300,0 мг/л и N-HMM-0,1−10,0 мг/л.

Рассмотрение проблем испытания промышленных загрязнителей на генотоксичность было бы неполным без анализа практического опыта. Судить об относительной токсико-генетической активности анализируемых сточных вод предприятий ЦБП можно на основе концентраций стандартных агентов, вызывающих примерно одинаковые с ними эффекты действия. Нами установлено, что по показателям токсичности для неразбавленных очищенных сточных вод предприятий ЦБП при экспонировании на D. magna Str в течение 24 час изоэффективными являются концентрации фенола 0,01 мг/л, а при 96 час-1,0−100,0 мг/л.

Генетические нарушения в наследственном аппарате гидробионтов под действием этих техногенов возникают с частотой, которую можно регистрировать в вариантах опытов с положительными контролями: ЭМС при концентрации 0,1- 300,0 мг/л и N-HMM — 01,0 — 10,0 мг/л. Исходя из представлений о безопасном уровне воздействия загрязнителей природной среды, по показателям, принятым в токсикогенетике и оговоренным в «Способе оценки генотоксичности водных сред», очищенные сточные воды следует охарактеризовать как токсиканты со средней мутагенной активностью.

Разбавление очищенных сточных вод с целыо снижения их генотоксичности не приводит к абсолютному снижению индуцируемых эффектов. Так, при 100-кратном разбавлении, очищенные сточные воды являются умеренными токсикантами и слабыми мутагенами. Причем, они индуцируют морфологических мутантов в 76−380 раз чаще по сравнению со спонтанным уровнем.

Было продемонстрировано, что очищенные сточные воды предприятий ЦБП характеризуются высокой вариабельностью выявляемых токсикогенетических эффектов действия в пробах, отобранных в разные временные периоды. Эти наблюдаемые различия обусловлены только переменным составом химических компонентов, присутствующих в них, и никак не связано с условиями проведения экспериментов. Подтверждением справедливости данного вывода могут служить данные, обсуждаемые по этому вопросу в литературе [1,3,54,270].

Промышленный поток сточной воды в большей степени загрязняется токсикантами на стадии варки целлюлозы, а мутагенами — на этапе ее отбеливания. Впервые были изучены генотоксические свойства смеси фенольных соединений на D. magna Str. Установлено, что токсическую активность промышленных сточных вод предприятий ЦБП могут определять присутствующие в них фенольные компоненты.

140 *.

С применением способа исследованы пробы воды из природного водоема (Братское водохранилище). По уровню токсикогенетической активности образцы воды из придонного слоя, отобранные из природных водоемов в зоне сброса промышленных сточных вод предприятий ЦБП, следует отнести к умеренным токсикантам, мутагенность которых не доказана.

Итак, экспериментальные исследования, выполненные на основе «Способа оценки генотоксичности водных сред», позволили получить новые сведения о биологических особенностях действия промышленных сточных вод ОАО «Братский ЦКК» и определить степень их биологической опасности. Они еще раз демонстрируют, что проблема рационального использования и охраны природных вод является одной из важнейших общебиологических задач, а знания о применяемых и распространяемых человеком в природной среде генотоксикантов, имеют огромное практическое значение. Ее решение, с одной стороны, неразрывно связано с технологическими возможностями, определяющими наличие арсенала эффективных, экономически приемлемых мер. С другой стороны, находится в прямой зависимости от умения своевременно предсказать негативные последствия воздействия промышленных отходов производства на живые организмы.

Способ оценки генотоксичности водных сред" был предложен для использования при производственном контроле сточных вод ОАО «Братский ЦКК». Он прошел апробацию и внедрение в производственный контроль как основной метод (Акт внедрения от 1 сентября 2006 г.).