Повышение жизнеспособности Yersinia pestis EV в биомассе вакцины

Актуальность проблемы. Живые вакцины представляют собой имму-нопрофилактические препараты, состоящие из наследственно измененных форм возбудителей инфекционных болезней. Применение вакцинации как средства специфической профилактики особо опасных инфекций в течение длительного времени свидетельствует о сохранении ее весомой роли в системе противоэпидемических мероприятий (Исупов И.В., Бугоркова С. А., Ку-тырев В.В., 2004). В нашей стране для профилактики чумной инфекции используют живую вакцину из штамма Yersinia pestis EV.

Стабилизация качества препарата, а именно необходимость сохранения всех свойств микробных клеток в течение длительного времени, является наиболее значимым вопросом в производстве живых вакцин. Последнее время в орбите научных интересов, касающихся совершенствования биотехнологии производства вакцины чумной живой, оказались методические приемы, направленные на дальнейшую стандартизацию коммерческого препарата по показателю жизнеспособности клеток К pestis EV (Ракитина E. JL, 1988; Будыка Д. А., 2002; Ефременко A.A., 2005). Современная тактика совершенствования вакцины чумной направлена на разработку и внедрение в производство дополнительных условий стабилизации числа живых микробных клеток в прививочной дозе коммерческой вакцины.

В результате ранее проведенных исследований была разработана производственная биотехнология вакцины чумной живой с содержанием от 20 до 50 доз в ампуле (Ефременко A.A., 2005). Полученный с нашим участием по новой биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и включен в действующий промышленный регламент № 1 897 080−09−09 на производство вакцины чумной живой.

Имеющиеся литературные данные (Алутин И.М., 1974) дают основание предполагать, что снижение температуры культивирования чумного микроба до 20−25 °С может значительно улучшить качество вакцины за счет возрастания в биомассе процента живых клеток, так как здесь температурный фактор определяет соответствующий уровень физиологической и метаболической активности микробных клеток. Вышеизложенное послужило основанием для апробации режимов культивирования вакцинного штамма при температуре (21±1) °С вместо регламентированных в ПР на вакцину чумную (27±1) °С, что способствовало большей устойчивости к лиофилизации на одноименном этапе производства препарата вакцины (коррекция биологических параметров) (Тинкер А.И., Будыка Д. А., Гайдина В. В. и др., 1993; Тинкер А. И., Гончарова М. Н., Будыка Д. А. и др., 1994; Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Тинкер А. И. и др., 1997; Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Гюлушанян К. С., Руднев С. М. 1998; Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Тинкер А. И. и др., 1998).

Полученные результаты определяют целесообразность и перспективность доработки и внедрения пониженной температуры культивирования биомассы (21±1) °С в процесс производства вакцины чумной живой. Кроме того, приведенные сведения являются достаточным экспериментально-теоретическим обоснованием для отработки и внедрения в биотехнологию вакцины чумной живой сочетанного воздействия обоих указанных выше факторов: физико-биологического и количественно-объемного.

Отработка и внедрение в биотехнологию выращивания биомассы препарата вакцины чумной живой пониженной температуры культивирования, а также сочетание с оптимизацией ее параметров на этапах сведения и розлива, позволивших повысить исходную жизнеспособность и стабилизировать число живых микробных клеток в прививочной дозе, определяют актуальность данной работы.

Цель исследования: Повысить показатель жизнеспособности микробных клеток и стабилизировать их число в прививочной дозе вакцины чумной.

Задачи исследования:

1. Экспериментально обосновать целесообразность корректировки температурных условий культивирования вакцинной суспензии в биотехнологии вакцины чумной живой.

2. Изучить в эксперименте сравнительные показатели жизнеспособности и повреждаемости микробных клеток в различных сочетаниях температурных и количественных характеристик биомассы.

3. Изучить основные показатели качества препарата вакцины чумной живой, полученной в условиях оптимальной сочетанной корректировки количественных и температурных параметров вакцинной суспензии.

4. Стабилизировать число живых микробных клеток в препарате вакцины в процессе хранения за счет оптимизации температурных и количественных показателей микробной биомассы.

5. Изучить иммуногенность и напряженность иммунитета, индуцируемого вакциной чумной, полученной из микробных клеток при предлагаемых условиях приготовления суспензии. Определить бактерицидную активность полиморфноядерных лейкоцитов в периферической крови белых мышей при инфекционных и вакцинных процессах в качестве косвенных показателей их иммунологической перестройки.

Научная новизна работы. Впервые разработаны и внедрены температурные режимы культивирования вакцинной биомассы в градиенте (21±1) °С, вместо регламентированных (27±1) °С, что позволяет получить более высокий исходный показатель живых микробных клеток как в биомассе, так и в вакцине, полученной из нее.

Впервые предложен и реализован научно-методический подход к повышению жизнеспособности микробных клеток У. резйь ЕУ в вакцинной суспензии за счет сочетанного применения оптимальных температурного (21±1) °С и количественно-объемного ((1−4)х1010 микробных клеток в объеме 1 мл в ампуле) параметров в биотехнологии производства вакцины чумной живой. Показано, что в условиях регламентированного режима лиофилиза-ции повышается эффективность стабилизации свойств микробных клеток у препарата с меньшей концентрацией вакцинной суспензии и снижением ее объема в ампуле, особенно у образцов со сниженной температурой культивирования (21 ± 1) °С. Впервые показано, что устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией полиморфноядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), обеспечиваемой главным образом кислородзависимой мие-лопероксидазой (МПО) при вспомогательном участии кислороднезависимых неферментных катионных белков (КБ). Изменение уровня активности МПО и КБ ПМЯЛ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Отработан диапазон пониженной температуры культивирования микробной биомассы вакцины чумной живой (21±1) °С вместо регламентированного (27±1) °С, позволяющий увеличить число живых микробных клеток в готовом препарате на 12−20% и стабилизировать его в процессе хранения.

Вакцина чумная живая, полученная по предложенной схеме, прошла контроль в лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича Роспотребнадзора, из которого получено положительное заключение.

Доказано, что сочетанное изменение температурного и количественно-объемного параметров при получении вакцины обеспечивает наилучшие показатели качества готового препарата, в частности его жизнеспособности.

Практическая ценность работы подтверждена следующими документами:

1. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 1 897 080−01−04 предусматривают выпуск вакцины со сниженным количеством доз в производственной упаковке.

2. Методические рекомендации «Определение иммуногенности вакци-' ны чумной живой в модели феномена „переживания“ на белых мышах», утверждены директором ФГУЗ Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора (протокол заседания Ученого Совета института от 16 апреля 2009 г. № 4).

3. Изменения № 1 к Промышленному регламенту № 1 897 080−09−09, предусматривающие выпуск вакцины как при температуре культивирования.

27±1) °С, так и при (21 ±1) °С, утверждены в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасе-вича Роспотребнадзора 22.12.2009 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Пониженная температура культивирования биомассы У. рсбИб ЕУ стимулирует биологическую активность микробных клеток, что позволяет увеличить количество живых микробных клеток в вакцине.

2. Полученный при пониженной температуре культивирования препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой, и предназначен как для планового практического применения, так и для массовых иммунизации.

3. Сочетанное изменение температурных и количественно-объемных параметров вакцинной суспензии позволяет достичь наиболее высоких показателей качества в готовом препарате вакцины чумной живой, особенно жизнеспособности и стабилизации свойств при хранении, что сопряжено с более низким показателем повреждаемости микробных клеток.

4. Иммуногенные свойства полученных образцов вакцины, изученные как двухэтапным методом, так и в модели феномена «переживания», соответствуют регламентированным нормам.

5. Цитоэнзимохимические показатели полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови у белых мышей отражают степень ответной реакции организма экспериментальных животных на введение инфекционного и вакцинного агентов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы бы ли. представлены на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы», посвященном 80-летию Санкт-Петербургского института им. Пастера (Санкт-Петербург, 3−5 сентября, 2003) — межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (Оболенск, 3−5 октября, 2006) — научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 21−22 марта, 2007) — научно-практической конференции «Основные итоги научно-практической деятельности молодых ученых и специалистов СтавНИПЧИ» (Ставрополь, 9 июня, 2008) — научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21−22 апреля, 2009) — научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 1415 мая, 2009).

Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках двух государственных тем НИР «Стабилизация показателя живых микробных клеток в чумной вакцине за счет оптимизации некоторых количественных параметров на этапах приготовления коммерческого препарата» (№ Госрегистрации 1 200 109 089) — «Разработка научно-методических подходов к повышению жизнеспособности микробных клеток штамма ЕВ чумного микроба в вакцинной суспензии в биотехнологии приготовления вакцины чумной живой сухой» (№ Госрегистрации 1 200 700 918), отражено в 12 опубликованных научных работах, в том числе две работы — в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текстасостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературыиллюстрирована 26 таблицами и 7.

выводы.

1. Культивирование микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба У. резйз ЕУ при температуре (21±1) °С как в бульоне, так и на агаре, обеспечило накопление гораздо более жизнеспособной их популяции, чем при (27±1) °С.

2. Культуры штамма У. реэНз ЕУ чумного микроба, выращенные в АКМ-Ш при температуре (21±1) °С, целесообразно использовать для приготовления вакцинного препарата в связи с высоким показателем количества живых микробных клеток и устойчивостью их к лиофильному высушиванию и последующему хранению.

3. Разработан и включен в промышленный регламент препарат вакцины со сниженным количеством доз в ампуле (от 20 до 50), являющийся более экономичной и удобной формой для практики прививочных мероприятий в небольших коллективах.

4. Экспериментальные образцы вакцины чумной живой, полученной при оптимальном сочетании температурных и количественных параметров вакцинной суспензии, характеризуются наилучшими качественными показателями готового препарата, такими как жизнеспособность и стабильность свойств при хранении, что сопряжено с наименьшими показателями повреждаемости.

5. Иммуногенные свойства различных серий вакцины чумной, изученные в системе, воспроизводящей феномен «переживания» на белых мышах, соответствуют предъявляемым к вакцинам требованиям. Обоснована возможность для внедрения указанного иммунологического приема наряду с классическим методом оценки иммуногенности вакцины чумной живой на модели белых мышей.

6. Устойчивость к чуме у белых мышей коррелирует с защитной функцией ПМЯЛ, обеспечиваемой главным образом МПО при вспомогательном участии КБ. Изменение уровня активности МПО и КБ может служить косвенным показателем степени устойчивости белых мышей к чумной инфекции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Живые вакцины не потеряли своей актуальности как средство профилактики инфекционных заболеваний. На территории России и сопряженных стран расположены активные природные очаги чумной инфекции, а значит вакцина против чумы сохраняет свою роль в системе противоэпидемических мероприятий (Кокушкин A.M., Наумов A.B., Кологоров А. И., Марысев В. Б., 1994; Дальвадянц С. М., Сероглазое В. В., Белобородов P.A. и др., 1997; Они-щенко Г. Г., 1998).

В настоящее время в Ставропольском противочумном институте выпускается препарат вакцины чумной живой в виде лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. Препарат представляет собой лиофилизированную из объема 1 или 2 мл живую культуру Y. pestis EV линии НИИЭГ. Главной характеристикой качества препарата чумной вакцины является ее жизнеспособность, а так же стабильность этого показателя в процессе длительного хранения. Согласно ФСП 42−8654−07 количество живых микробных клеток в готовом препарате должно быть не менее 25%. Вторым наиважнейшим свойством живой чумной вакцины является ее иммуногенность. ED50 не должна превышать для морских свинок 1×104, для белых мышей — 4×104 живых микробных клеток. Однако, несмотря на четкую регламентированность всех этапов производства вакцины чумной, в различных сериях готового препарата отмечается достаточно широкая вариабельность этих показателей. Так, жизнеспособность коммерческих серий может колебаться от 25 до 50% при оптической концентрации микробных клеток от 50 до 100 млрд./мл. (Ракитина E. JL, 1988).

Согласно литературным данным, повышение и стабилизация жизнеспособности препарата вакцины чумной живой зависит от множества факторов: условий культивирования микробных клеток и фаз их роста, концентрации бактериальной суспензии, используемого стабилизатора, параметров лиофилизации, условий хранения (Данилова М.В., Надирова И. М., Кудрявцев В. И., 1967; Долинов К. Е., 1969; Аркадьева З. А., 1983; Файбич М. М., 1983; Будыка Д. А., Тинкер А. И., Бондаренко А. И., 2000; Ефременко A.A., 2005).

Что касается температуры культивирования микробных клеток вакцинного штамма, то согласно ПР на производство вакцины чумной она должна быть (27±1) °С. В таких условиях культивирования чумной микроб интенсивно размножается и обладает высокой жизнеспособностью, в то время как при 37 °C эти показатели значительно ниже на всех фазах роста (Алутин И.М., 1974). Однако этот же автор приводит данные о том, что снижение температуры культивирования чумного микроба до 20−25 °С повышает биологическую активность микробных клеток. Применительно к вакцинному штамму это означает, что качество вакцины может улучшиться за счет возрастания в биомассе процента живых микробов (Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Гюлушанян К. С., Руднев С. М., 1998; Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Абзаева Н. В., 2007; Абзаева Н. В., Будыка Д. А., Иванова Г. Ф. и др., 2009).

Экспериментально доказано, что вакцина с измененными количественно-объемными характеристиками (снижение концентрации и объема суспензии в ампуле) по своим характеристикам превосходит стандартные коммерческие образцы (Свиридова JI.C., 1963; Тинкер А. И., Будыка Д. А., Верховце-ва Г. Н., Печников Н. Е., 1991; Будыка Д. А., 2002; Ефременко A.A., 2005; 2007). Более сбалансированное соотношение микробных клеток со стабилизатором (среда высушивания) позволило достичь состояния глубокого анабиоза в процессе лиофилизации. Вакцина с уменьшенным количеством доз в ампуле (от 20 до 50), имеющая объем 1 мл, включена в ПР на вакцину чумную живую и может быть использована для планового практического применения, дополняя арсенал профилактических препаратов для массового применения против чумы.

Наши исследования были направлены на совершенствование вакцинного сырья в условиях измененного температурного режима культивирования микробов — снижения его до (21±1) °С (экспериментальная линия) вместо (27±1) °С (контроль). Для этого проводили выращивание штамма У. pestis EV в бульоне при различных температурах. В обоих рядах проводили сравнительную характеристику микробной популяции, для чего определяли количество ж.м.к. в различные сроки исследования (накопление биомассы) и число клеточных делений в каждый из исследуемых сроков, что позволило рассчитать время одной генерации. Эксперимент выявил, что хотя микробы биомассы, культивируемой при (21±1) °С, имеют более длительную фазу приспособления, чем (27±1) °С варианты (9 ч и 6 ч соответственно), однако в логарифмической фазе количество жизнеспособных особей в эксперименте достигает 950 млн. против 100 млн. у контрольной линии. Через 48 ч (срок наблюдения) число живых микробов в контроле опускается до 90 млн., а в эксперименте — до 155 млн. Следовательно, абсолютные показатели живых клеток в сравниваемых образцах выше в биомассе с температурой культивирования (21 ±1) °С.

Что касается более детальной характеристики фаз роста, то во все сроки исследования число клеточных делений в обоих образцах мало отличается, как и время одной генерации в минутах, хотя некоторые отличия, подтверждающие общую картину жизнеспособности микробов обоих популяций, все же выявлены.

Таким образом, в условиях культивирования микробных клеток вакцинного штамма Y. pestis EV при температуре (21±1) °С в бульоне получена гораздо более жизнеспособная популяция, чем при (27±1) °С выращивании, исключая период адаптации, который составил 6−9 ч. Полученные результаты определили дальнейший круг исследований, который коснулся как получения большего числа живых особей при выращивании на плотной питательной среде, так и оценки устойчивости микробных клеток к процессу замораживания-высушивания и последующему хранению. Для этого исследовали биомассы, выращенные при различных условиях культивирования, и вакцину, полученную из них — опытные образцы ((21±1) °С) и контроль ((27±1) °С).

Через 48 ч выращивания при обеих температурах накапливалось примерно одинаковое количество биомассы вакцинного штамма, при этом «урожайность» его обеспечивала выход с 1 мл питательной среды не менее 4 млрд. м.к. Однако биологическая концентрация оказалась статистически выше у образцов, выращиваемых при (21±1) °С. Так, процент живых микробов через 48 ч выращивания составил 86,3±3,5 у экспериментальных линий, и 57,3±3,9 у контроля (1=5,5), а количество живых микробов в суспензии было 140,6±20,0 млрд./мл в опытных и 92,0±10,2 млрд./мл в контрольных образцах (1=2,2).

Далее из обеих суспензий были приготовлены экспериментально-производственые серии вакцины чумной живой. После лиофилизации вновь проверили показатели жизнеспособности. Выявлено, что опытные образцы, полученные при температуре выращивания (21±1) °С, проявили большую устойчивость к процессу замораживания-высушивания (процент жизнеспособных клеток составил 56,8±7,2, а их количество — 31,6±2,6 млрд./мл), чем контроль (жизнеспособных м.к. 36,6±1,6% и 23,7±2,2 млрд./мл). Расчет подкожных доз в показал, что в опытном препарате их содержится 105, а в контрольном — 80. Приготовленные экспериментально-производственные серии прошли контроль по всем показателям качества в НТО! чумных вакцин и ЛБТК, а также в ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича, где полученные серии признаны соответствующими всем требованиям НД.

Таким образом, как суспензия, так и вакцина, полученная при (21±1) °С культивирования, имеет преимущество по показателю жизнеспособности перед (27±1) °С контролем, при этом следует очевидно говорить о более выраженном периоде физиологической стабильности популяции (21±1) °С микробов.

Следующий этап исследований был направлен на изучение препарата вакцины чумной, полученного при сочетанном изменении физико-биологического (температура выращивания) и количественного (концентрация и объем в ампуле) параметров.

Для этого проводили выращивание вакцинного штамма на матрацах при температуре (21±1) °С — экспериментальные серии, и (27±1) °С — контрольные серии. Из полученной биомассы были приготовлены серии вакцины чумной живой, отличающиеся по концентрации вакцинной суспензии (90 и 20 млрд./мл) и объему вакцины в ампуле (2 и 1 мл соответственно). В полученных сериях определяли жизнеспособность, термостабильность, повреждаемость, потерю в массе при высушивании, реактогенность.

Анализ полученных данных вновь показал, что температура выращивания оказывает существенное влияние на показатели жизнеспособности препарата как до, так и после этапа лиофильного высушивания. Так, у контрольных образцов, разлитых в ампулу по 1 мл процент жизнеспособности до лиофилизации составил 39,8±3,3, а после — 28,8±2,0- у серий из этой же биомассы, но разлитой по 2 мл — 43,8±2,6 и 29,4±1,3% соответственно. Что касается образцов, полученных из биомассы, выращенной при (21±1) °С, то жизнеспособность вакцины, разлитой по 1 мл составила 53,2±3,0% до лиофилизации и 41,7±2,2% - послеразлитой по 2 мл — 52,9±9,8 и 44,8±8,7% соответственно. Показатель жизнеспособности полученных экспериментальных и контрольных серий был изучен при хранении в течение двух лет в условиях «холодовой цепи» — (4±2) °С, а также в условиях экстремального воздействия повышенной температуры (37±1) °С на препарат в течение 30 сут.

При сравнительной характеристике жизнеспособности вакцинных образцов выявлено, что во все сроки хранения при температуре (4±2) °С данный показатель был выше у экспериментальных серий вакцины, при этом даже через два года он превышал 35%, в отличие от контроля, где регистрировалась жизнеспособность ниже 25%. Следует заметить, что у исследованных образцов экспериментальной (21±1) °С вакцины, приготовленной с уменьшением количественно-объемных показателей, во все сроки наблюдения разница в жизнеспособности была существенно выше, чем у (27±1) °С аналогов.

Воздействие стрессового температурного фактора на исследуемые образцы показало, что серии, полученные при температуре культивирования (21±1) °С, в целом обнаруживали большую резистентность к экстремальному воздействию, причем наиболее устойчивыми оказались образцы с меньшей концентрацией и объемом суспензии в ампуле, имеющие также меньшие показатели потери в массе при высушивании (1,7% против 2,4% у контрольных). Процент жизнеспособности через 30 сут хранения при повышенной температуре составил у таких серий 7,8±3,3 (у контрольных образцов — 3,6±0,8%).

Была определена термостабильность опытных и контрольных серий вакцины чумной живой. В среднем, термостабильность экспериментальных серий составила 11,8±1,0 сут против 10,8±0,1 сут у контроля. Здесь особенно заметна тенденция к увеличению срока термостабильности у вакцины со сниженными количественно-объемными параметрами (до 14,3 сут), хотя в целом показатели всех серий соответствуют регламентированной норме (не менее 4 сут).

С помощью электронной микроскопии определили степень повреждаемости микробных клеток исследуемых образцов. Наименьший показатель повреждаемости оказался у серий, полученных при сочетанном изменении температурных и количественно-объемных характеристик биомассы -4,0±0,2, что на 47% меньше, чем аналогичный показатель в сериях, полученных в регламентированных условиях (7,5±0,6). Между тем, как в сериях вакцины, полученных при изменении только одного параметра (температура культивирования или объем и концентрация в ампуле), отличие от серий, приготовленных согласно ПР, составляет 16% (6,3±0,3) и 28% (5,4±0,7) соответственно. При этом микробные клетки вакцинного препарата, выращенного при (21±1) °С, имели меньший размер в сравнении с микробными клетками контрольных образцов (0,670±0,0275 и 0,815±0,015 мкм соответственно). В целом, экспериментальная вакцина с меньшим процентом повреждаемости показала существенно более высокую жизнеспособность (47,1±6,3%) по сравнению с контрольными образцами (30,7±0,1%).

Таким образом, вакцина, полученная из культивируемой при (21±1) °С биомассы, по своим свойствам превосходит коммерческие образцы, при этом сочетание физико-биологического (температура культивирования) и количественно-объемного (концентрация и объем в ампуле) параметров дает наилучшие результаты по основным показателям качества, таким как жизнеспособность, стабилизация свойств при хранении и термостабильность.

В полученных сериях вакцины чумной живой определяли реактоген-ность по совокупным данным пирогенности и специфической безопасности.

Результаты определения безвредности показали, что морские свинки, которым вводили как экспериментальные, так и контрольные образцы, не теряли в весе, у животных не было отмечено изменений, характерных для специфического инфекционного процесса (обширные кровоизлияния, очаги воспаления, узелки, абсцессы), и роста чумного микроба в посевах из крови и легких.

Пирогенные свойства изучали по методике, описанной в XII Государственной Фармакопее (2008). Как следует из результатов исследований, вакцина чумная живая обоих образцов обладала определенными пирогенными свойствами, что согласовалось с данными литературы (Тинкер А.И., Печни-коваИ.В., 1978). В сравнении с контрольными сериями, пирогенные свойства вакцины чумной живой, приготовленной с изменением температурного режима культивирования, обладали более низкими показателями, а тиомочеви-новая среда высушивания и 0,9% раствор натрия хлорида не вызывали выраженной пирогенной реакции.

Помимо жизнеспособности, основной критерий живой вакцины — ее иммуногенность, то есть способность создавать длительный (до 1 года) и достаточный по напряженности иммунитет. Поскольку экспериментальные и контрольные образцы были получены при сочетанном изменении температурного и количественно-объемного параметров, то нас интересовал их сопряженный иммунологический отклик.

Первоначально иммуногенные свойства экспериментальных и контрольных серий были изучены регламентированным двухэтапным методом на морских свинках и белых мышах. Полученные данные выявили, что как опытные, так и контрольные образцы имеют достаточно высокие защитные свойства, так как показатель ED5o во всех случаях имел допустимое значение. На морских свинках просматривается тенденция к увеличению иммуноген-ных свойств (21±1) °С вакцины в сравнении с (27±1) °С за счет уменьшения эффективной иммунизирующей дозы (3468 ж.м.к. против 6016 ж.м.к.).

Согласно литературным данным, иммуногенность препарата вакцины чумной живой можно изучать также на модели феномена «переживания» (Голубева В. К, Анисимова Т. И., 1965; Будыка Д. А., Тинкер А. И., Иванова Г. Ф., Ракитина E. JL, 1987; Будыка Д. А., 2002). Для более развернутой характеристики иммуногенных свойств экспериментальных и контрольных образцов такие исследования были проведены как на белых мышах, так и на морских свинках. Анализ полученных данных при воспроизведении феномена «переживания» на белых мышах показал, что препараты на основе штамма Y. pestis EV имеют высокий уровень защиты, при этом экспериментальные образцы обладают почти двукратным преимуществом по сравнению с контролем (LD50 27 540 ж.м.к. против 10 950 ж.м.к.).

Что касается морских свинок, то полученные в эксперименте данные подтвердили литературные сведения о том, что проявление феномена «переживания» на данной биомодели зависит от индивидуальной иммунобиологической реактивности животных, и реализация его происходит не всегда (Гинсбург H.H., 1969; Анисимова Т. И., Свинцова Е. М., 1976).

Для дополнительной оценки инфекционного воздействия вирулентного штамма чумного микроба, а также эффективности бактерицидной защиты при иммунизации чумной вакциной и последующем заражении проведены исследования по цитоэнзимохимической активности ПМЯЛ крови белых мышей. Исследовались содержание КБ и активность МПО в инфекционном и вакцинном процессе. Полученные данные сравнивали с контролем (искомые показатели у интактных животных), который составил для КБ — 1,60±0,03 и для МПО — 1,09±0,07.

Вначале исследуемые показатели определяли у животных, инфицированных различными дозами вирулентного штамма У. рея/и 461. Опыт показал, что содержание КБ в ПМЯЛ периферической крови достоверно снижается во всех группах и остается ниже уровня контроля во все сроки наблюдения, все же постепенно повышаясь по мере затухания инфекционного процесса у выживших животных I и II групп, зараженных 2−3 и 10 микробными клетками вирулентного штамма (0,95±0,03 и 1,04±0,12 соответственно). Аналогичная динамика наблюдается и у МПО, однако снижение активности фермента к 7 сут после заражения сменяется у выживших животных повышением его на 10 сут до уровня контроля (1,11±0,08 в I группе, зараженной 2−3 м.к. и 1,04±0,02 во II группе, зараженной 10 м.к.).

Далее показатели бактерицидной активности ПМЯЛ у подопытных животных исследовали соответственно методике определения иммуногенности коммерческого препарата вакцины чумной живой, изложенной в действующей ФСП на вакцину чумную. Анализ полученных данных выявил, что иммунизация вызывает снижение показателей бактерицидных систем ПМЯЛ у белых мышей в процессе формирования поствакцинального иммунитета к чуме.

После заражения иммунных животных вирулентной культурой при всех дозах заражения происходило снижение содержания КБ во всех группах по сравнению с их значением к моменту заражения, особенно на 3−7 сут, что, по-видимому, связано с разгаром инфекционного процесса. В динамике активности МПО у данных животных также отмечается наименьшее ее значение в период развития чумной инфекции. На 14 и 21 сут четко прослеживается разделение подопытных животных на три группы. В первой группе, где животные проиммунизированы наименьшей дозой (субиммунизирующей.

800 м.к.), происходит снижение уровня МПО до 0,98±0,05. Во второй, промежуточной, группе, где животные были проиммунизированы дозой 4×103 м.к., показатели МПО достигли 1,02±0,02. В третью группу объединены животные, получившие эффективные иммунизирующие дозы (2×104 и 105 м. к:), показатель МПО у которых превысил контрольный и составил 1,13±0,03.

Таким образом, после заражения иммунных к чуме белых мышей выявлена защитная функция бактерицидных факторов ПМЯЛ периферической крови, обеспечиваемая обеими системами: МПО и КБ. При этом роль МПО, по нашим данным, предпочтительнейхотя система КБ проявляла склонность, к более серьезному истощению и не восстанавливалась к 21 сут — продуктивной фазе поствакцинального иммунитета против чумы. Такая динамика несомненно свидетельствует в пользу задействования в бактерицидной защите ПМЯЛ и системы КБ.

Смоделированный далее инфекционный процесс в модели феномена «переживания» также показал довольно четкое и стереотипное реагирование обоих изучаемых факторов бактерицидности ПМЯЛ крови белых мышей в данной экспериментальной системе. Существенное снижение уровня КБ в динамике развития инфекционного процесса на 1, 3, 7 сут сменялось постепенным нарастанием его активности на 14 и особенно на 21 сут наблюдения, причем цифровые значения, возможно, свидетельствуют об интегрирующем воздействии вирулентного, либо вакцинного штаммов в разных фазах эксперимента. Сопряженно реагирует и МПО, закономерно повторяя динамику снижения активности на 1, 3 и, в особенности, на 7 сут наблюдения. Однако данная система снова довольно быстро восстанавливается — уже на 14 сут ее активность достигает величины на старте инфекционного воздействия, а на 21 сут поднимается до контрольных (интактных) показателей.

Таким образом, изменение показателей КБ и МПО может служить основанием для определения иммунной активности организма в различных стадиях инфекционного процесса, а также позволяет оценить степень реакции на введение вакцинного штамма, которая говорит о формировании иммунитета, что подтверждают и литературные источники (Сафронова В.М., Дятлов А. И., Лазарева И. Г. и др., 1985; Руднев С. М., Локтев H.A., 1992; Руднев С. М., Локтев H.A., Дальвадянц В. Г., 1993). То есть полученные данные показали возможность оценки эффективности иммунизирующего действия чумных вакцин у экспериментальных животных с помощью цитоэнзимохимических показателей ПМЯЛ при оценке невосприимчивости к чуме.

Следовательно, проведенные исследования убедительно подтверждают преимущество вакцины с измененной температурой культивирования, особенно в совокупности с уменьшенными количественно-объемными параметрами, за счет оптимизации, с одной стороны, температуры выращивания, с другой стороны — более оптимального соотношения количества микробных клеток на единицу стабилизирующих компонентов среды высушивания.