Актуальность проблемы. Класс никотиновых холинорецепторов (нХР) впервые описан в составе постсинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов скелетныхмышц (Katz, Miledi, 1973). Хорошо известна избирательная активация мышечных нХРtникотином наряду с ацетилхолином (АХ), а также конкурентная блокада d-тубокурарином и а-бунгаротоксином (Cohen, Changeux 1975). Способность кураре и а-бунгаротоксина (а-BgTx) связываться не только с пост-, но и пресинаптической мембраной моторного синапса (Tsuneki et al., 1995) означала возможное присутствие пресинаптических нХР на моторных терминалях. Их поиски дали противоречивые результаты — свидетельства в пользу участия нХР как в облегчении, так и торможении секреции АХ по принципу обратной связи (Гиниатуллин 1986; Kimura et al., 1991; Никольский 1990; Wilson, Thomsen, 1991; Dornet et al., 1995; Prior et al., 1995). Эти противоречия, как оказалось, во многом были отражением неоднородности пула пресинаптических нХР в моторных синапсах (Tian et al., 1994, 1997; Prior, Sigh, 2000, Faria et"al., 2003). В 90-ые годы в ЦНС было обнаружено суперсемейство нХР, получивших название нХР нейронального типа (Sargent, 1993).
Нейрональный тип нХР — так же, как и мышечный — ионотропные ХР, активируемые АХ и никотином, отличающиеся от мышечных нХР составом субъединиц, входящих в пентамер (например, a4/?2), спектром избирательных агонистов и антагонистов, функциональными свойствами (Role, Berg, 1996; Wonnacott, 1997). Особый интерес представляет пул а7-нХР. Белок нХР а7-типа — гомеопентамер, состоящий из пяти а7-субъединиц. Его избирательными агонистами являются холин, никотин в наномолярной концентрации и АХ, а антагонистами — метилликаконитин и a-BgTx в наномолярных концентрациях (не блокирующих мышечный тип нХР). Ионный канал а7-нХР имеет высокую относительную проницаемость к ионам кальция (Alkondon et al., 1996).а7-нХР локализованы в ЦНС преимущественно на пресинаптической или претерминальной областях синапсов разного химизма (глутаматГАМК-, дофаминэергических и других) и участвуют в облегчении секреции медиаторов. Установлено, что при поступлении в ЦНС никотина или экзогенного АХ, активация претерминальных а7-нХР в разных типах синапсов сопровождается входом в терминали Са2+, активацией рианодиновых рецепторов (РиР) и выбросом депонированного кальция, который усиливает секрецию различных медиаторов ЦНС (Wonnacott, 1997). Возможность существования подобного механизма, направленного на регуляцию секреции медиатора на периферии, в холинергических моторных синапсах, с участием а7-нХР, до сих пор не исследована. Между тем, здесь обнаружены пресинаптические РиР (Narita et al., 2000;Балезина и др., 2000), эффекты избирательных агонистов и антагонистов нейрональных нХР (Бала е1 а1., 2003). Недавно показана также возможность экспрессии мотонейронами разных субъединиц нейрональных нХР, в том числе и а7-типа (БеЬсогсН е1 а1., 2004, 2005). Это делает весьма актуальным поиск а7-нХР в составе синапсов моторных терминалей и изучение их возможного вклада в эффекты экзогенных и эндогенных агонистов — никотина, АХ и холина.
Дели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование механизмов регуляции секреции АХ с участием пресинаптических а7-нХР, выявление режимов работы моторного синапса, при которых происходит активация а7-нХР эндогенными агонистами — АХ и/или холином.
В связи с поставленной целью в работе решались следующие конкретные задачи:1) На нервно-мышечных синапсах мыши выявить и сопоставить пресинаптические эффекты избирательных агонистов (никотина, холина) и антагонистов а7-нХР — метилликаконитина (20 нМ) и кобратоксина (2 нМ) в отношении спонтанной секреции АХ, путем регистрации миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП), и в отношении вызванной секреции АХ, путем регистрации одиночных вызванных потенциалов концевой пластинки (ПКП), коротких и продолжительных ритмических залпов ПКП.
2) Исследовать пресинаптические эффекты агонистов а7-нХР на фоне блокады пресинаптических РиР.
3) Исследовать роль Са2+ -зависимых К+ -каналов в реализации тормозных, эффектов избирательных агонистов а7-нХР.
3) Выявить режимы активности моторных синапсов мыши, при которых происходит активация а7-нХР эндогенными агонистами (холином и/или АХ).
Новизна полученных результатов. В работе впервые показано возможное присутствие на нервных терминалях моторных синапсов мыши пресинаптических нХР а7-типа, при активации которых избирательными агонистами (холином или никотином) развивается однонаправленный эффект — торможение вызванной секреции, которое может быть предотвращено действием избирательных блокаторов а7-нХР — кобратоксином (2 нМ) и метилликаконитином (20 нМ).
Впервые исследованы возможные механизмы тормозного действия избирательных холинергических агонистов а7-нХР на вызванную секрецию АХ в нервно-мышечном синапсе. Установлен ранее неизвестный факт Са2±зависимости тормозного действия никотина на квантовый состав ПКП по ходу коротких залпов ПКП. Выявлена ранее неизвестная функциональная связь между активацией а7-нХР, последующей Са2+ -зависимой активацией РиР и выбросом депонированного кальция. Впервые показано, что эта цепь событий может завершаться активацией низкопроводящих апамин-чувствительных Са2±зависимых К±каналов терминали.
В работе исследованы ранее не описанные эффекты блокаторов а7-нХР при разных режимах активности синапсов. Впервые показано, что а7-нХР вовлекаются в активность лишь при продолжительной (от 2000 сигналов) залповой активности синапсов. Избирательная блокада а7-нХР в этом случае может почти полностью предотвратить более чем двукратное снижение уровня выброса медиатора к концу залпа. Аналогичный протекторный эффект дает предварительная блокада апамином Са2+ -зависимых Кканалов терминали.
Положения, выносимые на защиту1. В нервно-мышечных синапсах диафрагмы мыши при тоническом действии избирательных эндогенных и экзогенных никотиновых агонистов — холина (100 цМ) и никотина (2 нМ) — возможна активация а7-нХР. Это приводит к подавлению вызванной секреции АХ, которое можно предотвратить блокадой а7-нХР метилликаконитином и а-кобратоксином.
2. В реализацию тормозного действия агонистов а7-нХР на вызванный выброс АХ вовлечены РиР, выброс депонированного Са2+ с последующей активацией Са2±зависимых К±каналов терминалей.
3. При продолжительных высокочастотных залпах ПКП (от 2000 сигналов) снижение квантового состава ПКП к концу залпа, в среднем, на 55%, обусловлено действием отрицательной обратной связи с участием эндогенных холина и/или АХ, действующих на пресинаптические а7-нХР, что приводит к активации апамин-чувствительных Са2±зависимых К±каналов и торможению секреции.
Научно-практическая ценность работы.
Полученные в работе новые данные представляют интерес как с общенаучной, так и прикладной точки зрения. Для фундаментальной синаптологии ценным является ранее не известное описание того, при каких условиях, с помощью каких пресинаптических нХР и какого механизма осуществляется ауторегуляция работы холинергического нервно-мышечного синапса по принципу отрицательной обратной связи. Возможность такой регуляции давно обсуждалась в литературе (Никольский, Гиниатуллин, 1979; Никольский61 990, Гиниатуллин 1992; Van der Kloot 1993; Dornet at al., 1995), но оставляла открытыми важнейшие вопросы — о типе нХР и внутриклеточных механизмах такой регуляции в синапсах, а главное — о режимах работы синапса, при котором аутоингибирование секреции АХ осуществляется эндогенными агонистами — АХ и холином. В данной работе удалось существенно прояснить эти вопросы, показав участие а7-нХР в аутоингибировании секреции с помощью эндогенных АХ/холина при длительной высокочастотной работе синапсов.
Обнаруженный в работе необычный факт участия пресинаптических а7-нХР в торможении секреции АХ представляет самостоятельный научный интерес, поскольку в центральных синапсах (в том числе — и холинергических) этот же тип претерминальных рецепторов, сопряженный с активацией РиР и выбросом депонированного Са2+, служит противоположной задаче — усилению секреции медиатора. По-видимому, это связано с разной ролью и характером действия АХ в ЦНС и на периферии.
Использование в работе тонического действия никотина в низких наномолярных дозах, аналогичных имеющимся в крови курильщика, впервые позволило описать весь спектр неоднозначных эффектов никотина на уровне периферической нервно-мышечной передачи. Стойкое снижение уровня выброса АХ на 12−15%, в коротких залпах (на фазе «плато» залпа) при тоническом действии никотина, по-видимому, несущественно для здорового синапса, но может оказаться критичным при уже имеющихся нарушениях нервно-мышечной передачи. Для поиска средств коррекции депрессии передачи в условиях продолжительной интенсивной работы синапсов, представляет интерес обнаруженная способность апамина (5 цМ) и а-кобратоксина (2 нМ) предотвращать депрессию и падение амплитуды ПКП в длинных залпах.
выводы.
1. В нервно-мышечных синапсах мыши тоническое действие никотина (10 нМ) способно приводить к устойчивому-снижению квантового состава ПКП на 15−20% при ритмической стимуляции синапса (4−50 Гц).
2. Действие никотина зависит от внеклеточной концентрации ионов кальция и предотвращается селективным блокатором а7-нХР, а-кобратоксином (5 нМ), что указывает на вовлечение пресинаптических а7-нХР в эффекты никотина.
3. Подавление выброса медиатора под действием никотина при залповой активности синапса предотвращается рианодином (2 цМ), блокатором выхода кальция из внутриклеточных Садепо терминал ей, а также апамином (1 цМ), антагонистом низкопроводящих Са2±зависимых К±каналов БК-типа.
4. Холин (100 цМ), избирательный агонист а7-нХР, воспроизводит тормозные эффекты никотина в залпах, подавляя уровень ПКП в залпе на 15−20%- его действие предотвращается а-кобратоксином.
5. Избирательные блокаторы а7-нХР сами по себе не оказывают влияния на амплитуду МПКП, квантовый состав ПКП и падение амплитуды и квантового состава ПКП по ходу коротких высокочастотных залпов (4−50 Гц).
6. Падение амплитуды и квантового состава ПКП, развивающееся при долговременной активации синапса (2000;3000 стимулов, 50 Гц), удается предотвратить на 80−90% предварительным введением избирательных блокаторов а7-нХР — а-кобратоксина, метилликаконитина (20 нМ), а также блокатора БК-каналов.
7. В нервно-мышечном синапсе мыши обнаружена регуляция секреции медиатора по принципу отрицательной обратной связи с участием пресинаптических а7-нХР. Аутоингибирование развивается лишь на фоне продолжительной высокочастотной активности синапса и накоплении эндогенных агонистов (АХ/холина) активирующих пресинаптические а7-нХР. Их срабатывание приводит к активации БК-каналов, что сопровождается снижением выброса медиатора.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В нашей работе была предпринята попытка выявления и анализа возможного влияния нейрональных пресинаптических нХР на работу нервно-мышечного синапса и механизмов, опосредующих это влияние. Интерес к такому роду исследований объясняется скудостью данных о наличии нХР нейронального типа на моторных нервных терминалях, и в особенности это касается а7-типа нХР.
В настоящее время более или менее известна способность никотина и других холинергических агонистов влиять на нХР мышечного типа, находящихся на постсинаптической мышечной мембране и вызывать, в зависимости от концентрации и времени воздействия, активацию или десенситизацию мышечных нХР (Katz, Thesleff 1957; Quick, Lester, 2002; Gotti, Clementi- 2004). Прекрасно изучена и регуляторная роль пресинаптических нХР в ЦНС, в составе самых разнообразных структур мозга (см., к примеру, Vizi, Lendvai, 1999; Daajas-Bailador, Wonnacott, 2004).
Вместе с тем, наличие нХР нейронального типа, широко представленных и изученных в ЦНС, и особенности их функционирования пока мало изучены на уровне периферических моторных синапсов. Несмотря на то, что ряд работ однозначно показал наличие на мотонейронах нХР нейронального типа, (Khan et al., 2003; Dehkordi et al., 2005), исследования их роли носили до настоящего момента спорадический характер, а результаты зачастую были противоречивыми. Неизученным оставался и вопрос о том, может ли, и каким образом, длительное (в течение 1−1,5 часов) тоническое действие низких доз никотина и других агонистов (не приводящих к активации нХР мышечного типа) оказывать значимое воздействие на периферический синапс. Этот вопрос интересен как с точки зрения прикладной фармакологии — для оценки воздействий никотина на периферическую моторную систему курильщиков, так и с общенаучной точки зрениядля понимания последствий возможного тонического действия низких доз АХ и иных агонистов на н-холинорецепторы помимо их предсказуемой десенситизации в моторном синапсе.
В настоящее время способность никотина, АХ или других агонистов (цитизина, карбахолина) вызывать торможение секреции АХ в моторных синапсах показана в серии работ на диафрагме крысы шотландскими синаптологами (Tian et al., 1994; Tian et al.,.
1997; Singh, Prior, 1997; Prior, Singh, 2000), а также исследователями из Казанского.
Медицинского Университета — Е. Е. Никольским, Э. А. Бухараевой и др. (Бухараева и коллеги, 1986; Nikolsky et al., 1991; Giniatullin et al., 2002; Nikolsky et al., 2004). Однако в этих работах проводили аппликацию холиномиметиков кратковременно, в течение 1−2 минут, и в более высокой, микромолярной концентрации. Авторы склоняются к выводу о.
94 том, что тормозный эффект обусловлен активацией пресинаптических нХР нейронального типа. Вопрос о том, какой именно тип нейрональных нХР при этом задействован, и могут ли быть вовлечены в тормозный пресинаптический эффект нХР а7-типа, остается открытым. Мало известно и о возможном механизме тормозного пресинаптического действия микромолярных доз никотина и карбахола на секрецию АХ.
По мнению Prior и сотрудников, тормозное действие холинергических агонистов зависит от наружной концентрации кальция и может быть предотвращено блокадой внутриклеточного кальмодулина (Singh, Prior, 1998; Prior, Singh, 2000). В работе Никольского и сотрудников выдвигается другая гипотеза — что тормозное действие никотина, карбахола и других агонистов уменьшает синхронизацию многоквантового выброса АХ и, тем самым, снижает квантовый состав и уровень вызванного выброса медиатора (Nikolsky et al., 2004). Использование высоких — микромолярных и выше — доз агонистов для тестирования их возможных пресинаптических эффектов в моторных синапсах авторы обычно обосновывают тем, что концентрация самого АХ в синаптическои щели может достигать 10″ 4 М (Зефиров и коллеги, 2003). Вместе с тем, известно, что некоторые из разновидностей нХР активируются уже наномолярными концентрациями АХ и никотина, в частности, нХР а7-типа (Quick, Lester, 2002; Gotti, Clementi, 2004).
Наша работа имела ряд существенных методических отличий от предшественников, позволяющих нам говорить о получении принципиально новых результатов. Мы оценивали действие агонистов, эндогенных и экзогенных, в течение длительного времени, исчислявшегося десятками минут и часами, в то время как большинство исследователей ограничивались в лучшем случае несколькими десятками ПКП. Кроме того, специально подобранные нами концентрации агонистов и антагонистов позволили нам исключить или минимизировать их воздействие на нХР мышечного типа, преи постсинаптические. Наконец, после первоначального обнаружения экзогенно индуцированного пресинаптического эффекта, нами была предпринята попытка поиска условий, необходимых для его эндогенной реализации, агонистов и эффекторов, приводящих к срабатыванию обнаруженной нами регуляторной системы.
Для первоначального выявления этих эффектов нами был использован известный агонист нХР, алкалоид табака никотин. Отдельной причиной применения этого агониста стала также возможность выявления эффектов тонического введения низких доз экзогенного никотина, воспроизводящих эффект системного действия этого алкалоида при курении табака. Известный сегодня спектр эффектов никотина при его тоническом долговременном воздействии на ЦНС весьма широк — это облегчение обучения и памяти, повреждающие воздействия на структуры мозга. Эти эффекты реализуются и через десенситизацию нейрональных нХР, и усиление фосфорилирования отдельных субъединиц нХР (например, а4) (Hsu et al., 1997), и увеличение активности нХР за счет их синтеза de novo (Quick, Lester, 2002). В недавней работе Girod и Role показано, что продолжительная — 24−72 часа — экспозиция срезов гиппокампа in vitro с никотином (1−100 нМ) может приводить в одних нейронах к повышению их реактивности к АХ и индуцируемому ацетилхолином облегчению глутаматэригческой передачи, в других — к потере чувствительности к никотину, а в-третьих — к неоднозначному эффекту, сохранению тормозного действия АХ и блокаде облегчения, вызываемого АХ (Girod, Role, 2001). О неоднозначности продолжительного — от часа до десятка часов — действия никотина, с точки зрения изменений в пуле нХР свидетельствуют и данные других авторов. В работе Chiodini и соавторов (1999) при аппликации никотина на срезы гиппокампа в высоких (1−10 цМ) и в низких (менее 1 цМ) концентрациях обнаружены различные по характеру и знаку изменения синаптической передачи. Так, изменения, наблюдаемые при действии высоких доз никотина, воспроизводились и при аппликации блокаторов нХР, то есть были связаны с инактивацией, выключением из работы эндогенных нХР, вследствие их десенситизации высокими дозами никотина. В то же время эффекты низких доз никотина — 500 нМ — были качественно другими и не воспроизводились действием антагонистов нейрональных нХР. Таким образом, тоническое продолжительное действие никотина может приводить к неоднозначным изменениям в состоянии нХР, во многом зависящем от концентрации реагента вблизи мембраны.
В наших экспериментах никотин в низкой концентрации 10 нМ оказался способен эффективно подавлять залповую активность нервно-мышечного синапса. Тот факт, что это подавление предотвращалось а-СТх и Mia, указал нам, во-первых, на то, что действие никотина реализуется через активацию, а не десенситизацию пресинаптических нХР, и, во-вторых, указал нам на а7-нХР как на наиболее вероятную мишень его действия. В пользу вовлечения в опосредованное никотином торможение а7-нХР говорит и положительная зависимость выраженности тормозных эффектов от внеклеточной концентрации кальция.
Способность тонически присутствующего в среде н-агониста активировать, но не десенситизировать нХР нейронального типа, показанная нами, была постулирована ранее в работах Е. Е. Никольского и сотрудников (2000), а также экспериментально продемонстрирована и другими авторами (Papke et al., 2000; Sokolova et al., 2005) и отражена в кинетической модели десенситизации для а7-нХР, предложенной Palma и.
96 коллегами (1996). Кроме того, падение квантового состава ПКП на фазе плато на фоне тонического действия никотина показывает возможность малых доз никотина, сопоставимых с получаемыми при курении, не действующих на нХР мышечного типа, оказывать, тем не менее, влияние на нервно-мышечное проведение — возможность, ранее не рассматриваемую исследователями.
Применение апамина позволило выявить участие в реализации пресинаптического подавления выброса медиатора апамин-чувствительных К±каналов. В настоящее время на моторных нервных терминалях описано несколько семейств Кса-каналов, в том числе — пул апаминчувствительных, низкопроводящих kca-каналов, также известных как SK-каналы (Зефиров, Сидтикова 2002). Вопрос об их физиологической роли и механизмах активации остается мало изученным. До сих пор лишь в работе Балезиной и соавторов был описан тип каналов, поступление кальция по которым в аксоплазму терминали активирует апамин-чувствительные Кса-каналы моторных нервных терминалей — это потенциалзависимые Са2±каналы L-типа и рианодиновые рецепторы (Балезина и др., 2004). Наша работа говорит о том, что, возможно, существует и еще один вход кальция — по каналам а7-типа нХР, который также может быть направлен на активацию низкопроводящих апамин-чувствительных Кса-каналов терминали.
Кроме того, применение рианодина показало нам также и связь рианодин-чувствительных кальциевых депо с работой а7-нХР: входящий по каналам ХР кальциевый ток способен активировать РиР и выброс депонированного кальция необходимый для активации SK-каналов. Связь рианодиновых депо и выбрасываемого из них депонированного кальция с активацией SK-каналов была ранее показана на других объектах (Akita, Kuba, 2000) — таюке хорошо известна способность а7-нХР и входящего по ним кальция служить триггером для выброса кальция из рианодиновых депо центральных синапсов (Sharma, Vijayaraghavan, 2003; Sharma et al., 2008). На периферическом нервно-мышечном синапсе, однако, мы впервые показали наличие подобных взаимосвязей в составе работающей регуляторной системы. Таким образом, описан еще один кальциевый вход на моторных нервных терминалях, способный активировать и сопрягать работу РиР, выброс депонированного кальция и активность SK-каналов.
Длительной синаптической активности нервно-мышечных синапсов уделяется непропорционально мало внимания исследователей, несмотря на то, что для ряда мышц, включая и т. diaphragma, постоянная активация синапсов является нормой. Снижение амплитуды ПКП при длительной стимуляции — известный эффект. Так, например, Моуег и van Lunteren (1999) специально исследовали различные паттерны стимуляции моторных синапсов диафрагмы и пришли к выводу о том, что, снижение амплитуды ПКП при длительной высокочастотной ритмической активности синапсов не связано с развитием постсинаптической десенситизации, а является регуляторным эффектом. В то же время, до настоящего момента не было предпринято попыток выявления конкретных механизмов, стоящих за этой регуляцией. Нами впервые показано, что при длительной работе синапса накопление в синаптической щели и ее окружении эндогенного агониста приводит к активации пула околосинаптических а7-нХР и, соответственно, петли отрицательной обратной связи. Данные работы Моуег и van Lunteren позволяют нам с большой степенью уверенности утверждать, что при продолжительной стимуляции синапсов короткими сериями стимулов с сопоставимыми по длительности перерывами между ними (режиме работы, наиболее характерном для многих мотонейронов, включая дыхательные), накопление эндогенных агонистов (АХ и/или холина) и активация ими пресинаптических а7-нХР будет проходить практически с такой же эффективностью, как и при непрерывной стимуляции, использованной в наших опытах.
Наконец, нами впервые была показана возможность активации пресинаптических а7-нХР эндогенным и экзогенным холином. Несмотря на то, что в 70-е и 80-е годы в ряде работ (Полетаев и коллеги, 1978; Glavinovic, 1988), посвященных исследованию влияния холина на нервно-мышечный синапс, была продемонстрирована способность холина угнетать нервно-мышечную передачу, принципиально сходная с полученными нами результатами, отсутствие современных представлений об особенностях различных подтипов нХР и их селективных антагонистов не позволило исследователям найти адекватный режим активности синапсов и сделать вывод о наличии эндогенной пресинаптической регуляции посредством нейрональных нХР. Других исследований, основанных на современных данных о нейрональных нХР, посвященных данной проблеме, проведено до настоящего момента не было.
В ЦНС исследователями достаточно давно отмечено, что колебания базового уровня концентрации АХ и холина во внеклеточной среде мозга могут регулировать активность внесинаптических нХР, локализованных на соме, аксонах и дендритах нейронов, а также на сомах глиальных клеток (Descarries, 1998). Для периферических мотонейронов подобная регуляция на настоящий момент описана еще не была. Полученные нами результаты указывают на возможность регуляции выброса медиатора в нервно-мышечном синапсе околосинаптически локализованными нХР, по принципу отрицательной обратной связи снижающих выброс медиатора при долговременной интенсивной синаптической активности. На наш взгляд, околосинаптическая концентрация холина может служить маркером утомления моторного синапса. Если принимать во внимание высокий уровень надежности проведения в нервно-мышечном синапсе — избыточность секреции медиатора в моторных синапсах млекопитающих оценивается исследователями в 180−500% (Gertler, Robbins, 1978; Wood, Slater, 1997), в норме снижение в два раза амплитуды и квантового состава ПКП не должно приводить к нарушению проведения сигнала, и в. то же время может обеспечить экономию значительных количеств медиатора. Однако эта регуляторная система может играть свою роль и в патологии, в случаях, когда фактор надежности синаптического проведения оказывается снижен, например, при миастенических синдромах.
