Соматическая полиплоидия в гистогенезах брюхоногих моллюсков
Белковая железа янтарки наиболее удобна для изучения динамики и механизмов полиплоидизации клеток. Выделено 5 стадий ее развития. В I стадии происходит пролиферация диплоидных клеток. Во II и III стадиях секреторные клетки растут и полиплоидизируются с полным умножением геномов в ряду 2с-4с-8с-16с-32с-64соколо 3−5% ядер имеют промежуточные уровни плоидности Зс-6с-12с-24с в результате… Читать ещё >
Соматическая полиплоидия в гистогенезах брюхоногих моллюсков (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
Содержание
- Актуальность проблемы
Соматическая полиплоидия представляет явление ненормированного умножения целых геномов в соматических клетках тех или иных тканей у организмов, развивающихся из обычной диплоидной зишты. Соматическая полиплоидия — общебиологическое явление. Уже сам факт широкого распространения у различных животных и растений свидетельствует о неслучайности этого феномена и его определенной роли в развитии тканей. В ряде работ даже делается заключение об эволюционно-стратегическом значении соматической полиплоидии (Nagl, 1976, 1978- Barlow, 1978- Бродский, Урываева, 1981- Brodsky, Uryvaeva, 1985).
Между тем в литературе нет полного понимания природы соматической полиплоидии, механизмов эндорепродукции клеток. Исследования полиплоидных эндоциклов выходят на молекулярно-генетический уровень (Nagl, 1995- Lehner, Lane, 1997- Datta et al., 1998- Graft, 1998- Macauley et al., 1998- Nakayama et al., 1998), и в то же время не решен ряд цитологических вопросов, от которых зависит правильная интерпретация новых данных. В частности, открытый Гейтлером (Geitler, 1939,1953) эндомитоз — как процесс репродукции, спирализации и разделения хромосом внутри ядра — поставлен под сомнение, наметилась тенденция к пересмотру концепции эндомитоза в пользу полиплоидизирующего митоза и скрытой политении (Бродский, Урываева, 1981). Так называемый ангиоспермный тип эндомитоза у растений на самом деле оказался вариантом эндоредупликации хромосом (Barlow, 1976, 1978- Cavallini et al., 1981). В ряде аналогичных случаев вместо «эндомитотической полиплоидии» выявлены скрытая политения, псевдоэндомитоз как состояние деполитенизации хромосом, различные варианты аберрантного, реституционного митоза и отдаленные последствия этих процессов в виде хромоцешрических ядер, напоминающих эндомитоз (Бродский, Урываева, 1970, 1981- Nagl, 1978, 1981- Урываева, 1979- Зыбина, 1983,1986- Зыбина, Зыбина, 1985- D’Amato, 1989- Vitrat et al., 1998). Даже один из классических примеров эндомитоза-в клетках семенника саранчи — оказался лишь имитацией деления хромосом: в зоне расположения ядер с морфологией эндомитоза в клетках септ отсутствовал синтез ДНК, но зато выявлена активная транскрипция на компактизованных хромосомах, которые имели «ершистый» вид (Кикнадзе, Тутурова, 1970- Бахтадзе, 1975- Кикнадзе и др., 1975- -teadze, Istomina, 1980- Therman et al., 1983). В связи с критическим состоянием проблемы эндомитоза стали появляться * im необоснованного применения понятия политении, смешения понятий учхоза и политении, в том числе и в учебной вузовской литературе. Это делается, дмер, в отношении ядер гигантских нейронов улиток, где содержится много продолжается ее синтез, но не видны обычные хромосомы. По сути концепция ¦<итоза столкнулась с недостаточностью его обычных морфологических &bdquo-риев. Само существование эндомитоза поставлено под вопрос до тех пор, а не будут даны его новые обоснования с использованием современных методов изучения клеточного цикла (Бродский, Урываева, 1981). Это требование оказалось вполне актуальным, поскольку другие предложения, например, различать два типа эндомитоза- основной и некий «стационарный эндомитоз» (Therman et al., 1983) -не решают, а лишь усложняют проблему.
Не вполне ясны также причины и практически не изучены филогенетические закономерности возникновения гистогенезов с участием полиплоидии. Для обнаружения и объяснения эволюционных тенденций нужны максимально полные сведения о проявлениях полиплоидии в независимых и достаточно протяженных филогенетических рядах. В последнее время такие сравнительные исследования начаты на печени и миокарде млекопитающих (Кудрявцев, 1991- Anatskaya et al., 1994- Кудрявцев и др., 1997). Наша работа решает эту проблему на примере эволюции класса брюхоногих моллюсков (Mollusca: Gastropoda), то есть в другом стволе исторического развития животных. Попытка объяснить гигантизм нервных клеток у гастропод сделана со стороны малакологов (Gillette, 1991), но она не раскрывает сам феномен полиплоидии нейронов и возможность коррелятивного проявления полиплоидии в других органах тех же моллюсков, а значит не решает проблемы системного возникновения полиплоидного роста как морфогенетической стратегии.
Выбор класса гастропод в нашей работе не случаен. Во-первых, полиплоидия разных уровней — от умеренных (16с-64с) до гигантских (65−260 тыс. с) -достоверно показана для клеток слюнных желез (Swift, 1953- Schreiber, Schreiber, 1964) и нейронов (Вепринцев и др., 1964- Coggeshall et al., 1970- Lasek, Dower, 1971- Boer et ai., 1977) у ряда легочных и заднежаберных моллюсков, а обзор литературы (20−26)* позволяет предположить и более широкое распространение полиплоидных гистогенезов у представителей разных подклассов. Во-вторых, класс гастропод достаточно обширный и сложный (Миничев, Старобогатов, 1979- Haszprunar, 1988- Barnes, Harrison, 1994), по разнообразию видов он занимает второе место после насекомых, что дает хорошую основу для эволюционного анализа. В-третьих, региональная специфика южного Приморья позволяла рассчитывать на доступность сравнительного (прежде всего морского) материала, как и на выбор удобного модельного объекта для углубленных цитологических исследований.
Цели и задачи работы Цель работы состояла в том, чтобы на примере брюхоногих моллюсков выявить закономерности онто- и филогенетического развития соматической полиплоидии и объяснить биологический смысл этого феномена.
Соответственно цели поставлен ряд задач: 1) на модельном объекте — улитке Succinea lauta — изучить характер и степень проявления полиплоидии в различных органах и тканях- 2) изучить онтогенез модельного объекта, динамику развития полиплоидных клеток, возрастные и функциональные стадии, удобные для выявления механизмов полиплоидизации клеток- 3) выявить кинетику синтеза ДНК в ходе полиплоидизации и дифференциации клеток- 4) установить механизмы полиплоидизации клеток модельного объекта, в частности подтвердить или Цифры в скобках обозначают работы автора, приведенные в списке литературы. отвергнуть механизм эндомитоза- 5) выявить распространение и степень проявления соматической полиплоидии в пределах класса гастропод- 6) объяснить причины и биологический смысл феномена соматической полиплоидии.
Научная новизна и теоретическое значение работы
На основе модельных и сравнительных исследований на брюхоногих моллюсках выяснены клеточные механизмы, эволюционные закономерности и биологическое значение соматической полиплоидии в развитии тканей.
Впервые: 1) проведен детальный скрининг в различных органах и тканях гастропод и показана тканеспецифичность проявления полиплоидии- 2) проведено комплексное изучение динамики цолиплоидизации клеток, показаны, связь полиплоидии с цитодифференциацией, тканеепец^фическая возрастная динамика, сохранение диплоидного резерва и возможность регенерации полиплоидных клеточных популяций- 3) установлено сходство кинетики синтеза ДНК, в том числе в позднореплицирующихся хромосомах, для клеток разной плоидности и зависимость этих показателей от хода дифференциации клеток- 4) показано преемственное сочетание нормальных митозов, аномальных (неполных) митозов и эндомитозов в развитии полиплоидных клеточных популяций и зависимость этих изменений клеточного цикла от хода дифференцировки клеток- 5) доказано, что классический эндомитоз Гейтлера — реальный механизм эндорепродукции клеток, дана его комплексная цитологическая характеристика, определены псевдоэндомитотические состояния- 6) установлена филогенетическая обусловленность полиплоидных гистогенезов в разных группах гастропод, показаны как ароморфные, так и алломорфные (идиоадаптивные) проявления соматической полиплоидии в морфогенезах- 7) полиплоидная клетка представлена как эндоклон и результат олигомеризации на клеточно-тканевом уровне, что позволило прогностически сформулировать ее свойства и определить значение полиплоидной стратегии роста.
В целом биология развития полиплоидных клеточных популяций есть элемент фундаментального знания в области цитологии, гистологии и эмбриологии. С учетом того, что гигантакл еточно сть и полиплоидия характерны для некоторых тканей и органов человека, а также раковых опухолей, эти знания представляют интерес и для решения ряда медико-биологических задач. Предложенная концепция эндоклоногенеза по сути содержит теоретическое решение проблемы соматической полиплоидии.
Практическое значение работы
Обобщения и частные
выводы, полученные в работе, характеристики и иллюстрации эндомитоза могут быть использованы при переизданиях учебников по цитогенетике, цитологии, гистологии и биологии развития, а также при чтении спецкурсов и написании, руководств по частным разделам этих дисциплин (репродукция клеток, сравнительная гистология и др.).
Тест на проявление соматической полиплоидии в разных тканях, в особенности в нейронах ЦНС, может служить дополнительным критерием в решении спорных вопросов филогении и систематики гастропод.
Разработанный способ получения давленых препаратов с использованием целлофана (8) исключает процедуру замораживания, что позволяет легко готовить препараты для цитологических исследований в полевых условиях, на учебных занятиях, в патогистологических лабораториях.
Результаты работы уже используются в лекциях и на лабораторных занятиях по курсам биологии клетки, гистологии, биологии развития, а также в большом практикуме по цитологии для студентов ДВГУ.
Апробация работы Основные результаты были представлены на Всесоюзном совещании «Клеточная репродукция: сравнительные аспекты и механизмы регуляции» (Ленинград, 1981), на VIII, X, XI и XII Всесоюзных (Российских) симпозиумах «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, 1984- Гродно, 1990- Санкт-Петербург, 1993, 1996), на 2-м рабочем совещании «Прикладная цитохимия хроматина» (Ленинград, 1985), на Всесоюзном совещании «Теория параллелизмов А. А. Заварзина и современная биология» (Ленинград, 1986), на 37-ой и 38-ой научных конференциях ДВГУ (Владивосток, 1994, 1996), на Региональной конференции по проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1988), на Всероссийском совещании по изучению моллюсков Дальнего Востока России (Владивосток, 1998), на IV (Х1П) Малакологическом совещании (С.-Петербург, 1998), на Международном симпозиуме по изучению Восточно-Азиатских маргинальных морей (Фукуока, Япония, 1999).
Объем и структура работы
Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада, обобщающего результаты исследований автора, выполненных в 1979—1998 гг. Основное содержание работы представлено в 33 публикациях, из которых 22 журнальных статьи и 11 тезисов докладов.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Явление соматической полиплоидии изучено нами на моллюсках класса Gastropoda (брюхоногие). Это наиболее многочисленный и сложный класс в типе Mollusca, насчитывающий около 100 тысяч современных видов.
В качестве модельного объекта для изучения органно-тканевой локализации, возрастной динамики и механизмов развития полиплоидных клеток использована наземная легочная улитка янтарка Succinea lauta Gould, 1859 — массовый вид малакофауны южного Приморья (Хасанский район, биостанция ДВГУ). Предварительный скрининг выявил у этого моллюска типичное для легочных присутствие полиплоидных ¿слеток в ганглиях, различных железах и других органах (1), а короткий онтогенез (4) позволял в один полевой сезон получать сопоставимый материал по динамике полиплоидизации клеток. В течение 1979−1997 гг. в различных тестах и экспериментах обследовано около 3000 улиток разного возраста.
Для выявления эволюционной динамики феномена соматической полиплоидии исследован 71 вид морских, наземных и пресноводных гастроп од, принадлежащих к 43 семействам, 20 отрадам и 7 подклассам. Фиксировано по 3−10'особей каждого вида. Материал собран в основном на литорали залива Петра Великого Японского моря и территории южного Приморья. Отдельные виды любезно предоставлены из коллекций и экспедиционных сборов сотрудниками ИБМ ДВО РАН и ТИНРО. В качестве тестовых органов выбраны слюнные железы, пищеварительная железа и ганглии ЦНС, где полиплоидия от умеренных до гигантских значений проявляется наиболее устойчиво.
2.2. МЕТОДЫ Гистоморфологические и цитохимические методы применяли для идентификации тканей и клеточных типов. Препарированные органы или целые животные фиксировались жидкостью Навашина, забуференным 10%-ным формалином и спирт-уксусной смесью (3:1). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином с эозином (морфология), галлоцианином (РНК и ДНК), прочным зеленым (белки), ШИК-альциановым синим (нейтральные и кислые мукополисахариды) — при этом использовали контрольную обработку препаратов РНКазой и амилазой.
Цитогенетический анализ хромосомных циклов проводили на давленых препаратах, приготовленных по модифицированной технологии с использованием целлофана (8). Исключение процедуры замораживания позволило значительно упростить методику и применять ее в полевых условиях. Давленые препарат использовались также для цитофотометрии и авторадиографии клеточных ядер.
Для электронной микроскопии кусочки органов фиксировали 3%-ным глутаральдегидом (2−3 ч) и 2%-ной осмиевой кислотой (1−2 ч), обезвоживали спиртом и ацетоном, одновременно контрастируя 2%-ным уранил-ацетатом, и заключали в Эпон-812 или Эпон-Аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и исследовали на электронном микроскопе 1ЕМ-100 В. Ультраструктурные исследования проводили параллельно с цитофотометрическим определением плоидности ядер и авторадиографическим контролем на ядерные синтезы.
Цитофотометрйя ДНК при окраске по Фёльгену применялась для определения уровней плоидности ядер и их положения в клеточном цикле. Эуплоидными эталонами служили ядра мужских половых клеток (1с-2с-4с) или ядра мелких соматических клеток (2с). Фотометрию производили на мазках, полученных методом щелочной диссоциации или на давленых препаратах. Использовали фотометрическую насадку ФМЭЛ-1 на базе микроскопа МБН-11 и интегрирующий микроденситомегр М-85 (Уюкеге) в спектральной области 534−555 нм.
Методом авторадиографии выявляли ядерные биосинтезы в ходе размножения, роста и дифференциации клеток. Предшественники ДНК и РНК — ЗН-тимидин (740 920 ГБк/ммоль) и ЗН-уридин (960 ГБк/ммоль) — вводили улиткам микроинъектором в область пищеварительной железы, либо кусочки органов инкубировали в растворе изотопов. Дозировка составляла 40−200−400 кБк/г (мл). Использовались одно- и многократные режимы введения, импульсные (0,5 — 1 ч) и отставленные (до 24 ч) режимы циркуляции предшественников. Радиоавтографы готовили методом погружения или петлей, как правило, на давленых препаратах, которые окрашивали по Фёльгену, Гимза или кармином. Определяли индексы (долю) меченых ядер (ИМЯ, %) и индексы (интенсивность) метки. В особых случаях авторадиография сочеталась с цитофотометрией ДНК. Меченые ядра фотометрировали на радиоавтографах, окрашенных по Фёльгену, при 555 нм (суммарное светопоглощение ДНК-фуксина и метки) и 700 нм (светопоглощение метки) и вычитанием находили отдельно условную массу ДНК и интенсивность метки.
В последних наших работах по ряду причин преимущество отдавалось давленым препаратам. Во-первых, расплющенные ядра имели оптимальную для фотометрии оптическую плотность- во-вторых, они были удобны для совмещенной фотометрии ДНК-фуксина и авторадиографической метки, поскольку исключалось самопоглощение радиоактивности крупными ядрами- в-третьих, отношение площадей ядер разных классов плоидности приобретает двукратную прогрессию (12), что позволило в ряде случаев оценивать классы плоидности визуально по размерам ядер.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ПРОЯВЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКОЙ ПОЛИПЛОИДИИ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЯНТАРКИ Скрининг на проявление полиплоидии в тканях улитки янтарки (1, 3, 6, 14) выполнен на крупных (около 24 мм) половозрелых особях. На срезах идентифицировали ткани и клеточные типы, а на мазках из соответствующих органов оценивали уровни плоидности клеточных ядер.
Изучено 54 типа клеточных популяций. Установлено, что во всех тканях клетки, как правило, одноядерные. Единичные двуядерные клетки встречены в слюнной железе, гонаде и в некоторых других органах- Далее они отдельно не учитывались, так как заметной роли в установлении гетероплоидности тканей не играют. Показано, что основные эпителиальные клетки эпидермиса, органов пищеварительной и половой систем, так же как и клетки почки, соединительной, мышечной и нейроглиальной тканей, имеют диплоидные ядра. В то же время для многих специализированных клеток характерна полиплоидия, которая выступает в ряде случаев ведущим фактором соматического роста (рис. 1,2). Полиплоидизируются прежде-всего секреторные эпителиальные клетки. Ядра слизистых и белковых субэпидермальных желез мантии, легкого и нош содержат 32с и 256с-512с ДНК соответственно. В пищеварительной системе слизистые клетки глотки и пищевода полиплоидизируются до 8с- белковые базофильные клетки кишечника и пищеварительной железы — до 32с-64с- белковые секреторные клетки глоточных желез — до 32с-64с и даже 128с- слизистые клетки слюнных желез — до 32с, а белковые — до 64с-128с. В половой системе питающие клетки гонады, секреторные клетки белковой и предстательной желез содержат 16с-32с-64с ДНК- эпителиальные
Рис. 1. Гистоморфология некоторых органов янтарки с выраженной полиплоидией, а — край мантии- б — слюнная железа- в — пищеварительная железа- г -кишка- д -белковая железа- е — предстательная железа- ж — нервный ганглий. клетки гермафродитного протока, яйцевода и семяприемника — до 8с-16с. Нейроны ЦНС — наиболее высокоплоидные клетки, в различных ганглиях их ядра содержат до 2048с-16 384с ДНК. Полиплоидные нейроны уровней 16с-64с обнаружены также в наружных оболочках различных органов и в кутисе. Характер гистограмм указывает на то, что умножение геномов происходит в основном в геометрической прогрессии, не синхронно и не тотально, так что во всех случаях выявляются растянутые ряды гетероплоидных значений. Последнее обстоятельство могло свидетельствовать о продолжающихся в постнатальном онтогенезе ростовых процессах.
С учетом данных литературы (20−26) и результатов скрининга на других видах (30, 31,33) можно заключить, что возможность полиплоидизации клеток в тканях гастропод не ограничивается каким-либо типом специализации, но степень проявления полиплоидии тканеспецифична. Полиплоидия чаще встречается в железах, причем уровни плоидности белковых клеток выше, че^^и^щ^.ц Наиболее выражена полиплоидия в нейронах ЦНС. ГОСУДАРСТВЕН БИБЛИОТЕКА i г ч s к ж № 728 256 т т Ш гм шъ sm tsm
Рис. 2. Гистограммы распределения клеточных ядер по уровням плоидности в различных органах янтарки. По оси абсцисс — уровни плоидности, с- по оси ординат — число ядер, а — сперматогенные клетки (эталон) — б — клетки края мантии- в — эпителий пищевода- г — эпителий тонкой кишки- д — пищеварительная железа- е — глоточная железа- ж — слюнная железа- з — эпителий гонады- и — белковая железа- к — эпителий яйцевода- л — предстательная железа- м — эпителий семяприемника- н — клетки ганглиев нервного кольца.
Для изучения онтогенеза полиплоидных тканей предварительно определены параметры жизненного и полового циклов янтарок. На протяжении года производили анализ размерно-весовой структуры изучаемой популяции, наблюдали за яйцекладками и появлением молоди (4). Установлено, что жизненный цикл янтарки Succinea lauta в условиях южного Приморья составляет 13−15 мес (лето -зима — лето) с периодом зимней спячки с октября до мая, половое созревание и размножение приходятся на второе лето жизни. При выборе модельных органов изучены три возрастные группы: 1 — сеголетки (конец июля, высота раковины -1012 мм, вес — 0,19−0,40 г) — 2 — растущие годовики (соответственно: июнь, 16−20 мм, 0,75−1,80 г) — 3 — взрослые годовики (конец июля, 22−25 мм, 1,95−2,75 г). В качестве потенциальных модельных систем отобраны: белковая и предстательная железы -вспомогательные органы гермафродитной половой системы, эпителий кишечника, пищеварительная и слюнные железы и ганглии ЦНС. Определяли возрастные изменения плоидности ядер и ИМЯт — индекса меченых ядер при импульсном введении ЗН-тимидина — раздельно для фракций диплоидных (2с-4с) и полиплоидных (4с и более) ядер (табл. 1).
Таблица 1. Изменения уровней плоидности ядер и ИМЯт в некоторых органах у янтарок трех возрастных групп
Орган Гру- Классы плоидности яаер, с ИМЯт ИМЯт Число ппа 2с-4с, % ' 4с+, % ядер/жив.
Белковая 1 2−4 (зачаток) 16,3+2,1 — 870/ железа 2 2−4-8−16−32 8,9+1,8 17,0+2,9 14 500/
3 2-(4−8)-16−32-(64) 3,3±0,6 0,5+0,2 10 700/
Предста- 1 2−4 (зачаток) 18,5+2,4 — 950/ тельная. 2: 2−4-8−16−32-(64) 6,4+1,4 15,2+1,5 12 800/ железа 3 2-(4−8)-16−32-(64) 0,7+0,3 0,8+0,3 11 500/
Кишечник 1 2−4-8−16−32 8,0+1,2 12,5+4,2 8500/
2 2−4-8−16−32 7,0+1,6 8,3+2,9 11 400/
— 3 2−4-8−16−32 3,2+0,9 1,2+0,6 14 700/
Пищевари- 1 2−4-8−16,32−64 14,8+3,0 22,6+1,8 3530/ тельная 2 2−4-8−16−32−64 12,8+2,2 6,5+2,0 5960/ железа 3 2−4-8−16−32−64 4,6+1,3 1,2+0,3 4750/
Слюнные 1 2−4-8−16−32−64-(128) 15,4+1,8 13,9+2,8 8850/ железы 2 2−4-8−16−32−64−128-(256) 11,4+2,3 9,7+2,5 8450/
3 2−4-8−16−32−64−128-(256) 4,1+1,0 .1,3+0,
Ганглии 1 2−4-.,-512-(1024) 47,5+2,3 .54,2+2,7 23 300/
ЦНС. 2 2−4-,. -2048-(4096) 39,5+3,2 29,6+1,6 21 500/
3 2−4-.-4096-(8192−16 384) 13,3+2,8 4,9±0,9 19 300/
Результаты показывают, что полиплоидия в тканях янтарки не является следствием старения, а представляет их неотъемлемое свойство уже в начале развития. В кишечнике, пищеварительной и слюнных железах полиплоидные клетки всех классов закладываются уже у сеголеток (1-я группа), у них же отмечаются и максимальные значения ИМЯт как для диплоидных, так и для полиплоидных фракций клеток. Репродуктивные процессы продолжаются и у годовиков, но у старых животных они резко замедляются. Поскольку нарастание классов плоидности у годовиков практически отсутствует (небольшой сдвиг имеется в слюнных железах), продолжающийся синтез ДНК свидетельствует о приросте числа клеток и, возможно, их обновлении. В ганглиях ЦНС гетероплоидный ряд нейронов вплоть до 512с-1024с тоже сформирован у сеголеток, но репродуктивные процессы и нарастание классов плоидности продолжаются и у взрослых улиток (9,32). Иная динамика, но тот же принцип сопряжения полиплоидии и тканевой дифференцировки характерны для желез полового тракта. В первое лето формируются лишь маленькие зачатки, состоящие из диплоидных клеток, а во второе лето происходит их динамичное развитие на основе полиплоидии, связанное с половым созреванием улиток. Именно эти органы — белковая и предстательная железы — были выбраны для модельных исследований. Основное их преимущество состоит в том, что весь процесс развития происходит в короткие сроки у достаточно крупных особей-годовиков, удобных для сбора и проведения опытов. Последующие работы ограничились белковой железой. Ее Эпителий демонстрирует типичный уровень полиплоидии (16с-64с), имеет один тип полиплоидных секреторных клеток вырабатывают белково-полисахаридный секрет для формирования яиц) и хорошо различимую популяцию вспомогательных диплоидных клеток, среди которых предположительно могли быть и камбиальные элементы (3). Остальные органы использовались как объекты сравнения, в основном при морфологических исследованиях эндомитоза. Особый интерес представляли нейроны, которые демонстрировали максимальную полиплоидию (до 16 384с) и непрерывный рост вместе с ростом животного.
3.2. ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ПОЛИПЛОИДИЗАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЕТОК БЕЛКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЯНТАРКИ Для правильного понимания механизмов полиплоидизации клеток необходимо было четкое видение гистогенетической динамики изучаемой ткани. Ошибки и неудачи в определении сущности «эндомитотических» ядер, имевшие место в работах на клетках растений и животных, были обусловлены как раз игнорированием или неудачным выбором стадий развития полиплоидных клеток. Описывая эндомитоз или любой другой механизм полиплоидизации клеток, нужно прежде всего быть уверенным в том, что это действительно репродуктивный процесс, а не морфологический артефакт. Необходимым контролем здесь выступает фотометрическая и. авторадиографическая регистрация синтеза ДНК. С учетом опыта предыдущих исследователей было важно также знать и учитывать динамику дифференциации полиплоидизирующихся клеток, стадийность их функционирования, включая возможные периоды покоя и реактивации. Наряду с морфологическими характеристиками растущих клеток, ценным критерием здесь выступает транскрипционная активность хромосом (синтез РНК), которая в любых гистогенезах должна соответствовать известным закономерностям клеточной репродукции и дифференциации. Установлению этих гистогенетических параметров нашего модельного объекта — белковой железы янтаркй — и посвящена настоящая глава. Кроме того, закономерности цикла полиплоидных клеток интересны сами по себе. Они изучены в основном на млехопитающих и насекомых, чего явно не достаточно для общих суждений. Поэтому мы уделили внимание и таким вопросам, как порядок и скорость синтеза ДНК в полиплоидных циклах.
3.2.1. Динамика репродукции и полиплоидизации клеток Для получения общей картины развития белковой железы в течение года исследовали ее гистологическую организацию и определяли суточную норму ДНК-синтезирующих (8-фазных) ядер — ИМЯсут при 3-кратном введении ЗН-тимидина с интервалом 10 ч и фиксацией через 4 ч после третьей инъекции (4). Установлено, что у сеголеток в августе-сентябре (в возрасте 2−3 мес) зачаток белковой железы образован мелкими диплоидньши клетками с умеренной пролиферативной активностью — ИМЯсут в августе не превышает 20% (рис. 3).
В период зимней спячки рост останавливается, включение ЗН-тимидина в конце сентября—начале мая отсутствует. В мае рост возобновляется, зачаток увеличивается в объеме, ИМЯсут сильно колеблется, достигая 25−30%, но гистологическая картина существенно не меняется. Решающие, события в развитии железы происходят в июне: образуются ацинусы, эпителий дифференцируется на секреторные и
Рис. 3. Суточное число ядер, синтезирующих ДНК, в процессе развития белковой и предстательной желез янтарки.
По горизонтали — даты взятия материала- по вертикали — индекс меченых ядер, %. а — сеголетки, б -годовики. 1 — зачаток, 2 — белковая, 3 — предстательная железы. Заштрихованная полоса — период зимней спячки. вспомогательные ресничные клетки, резко увеличивается объем секреторных клеток и их ядер, ИМЯсут достигает максимальных значений — 50−60%. В июле-августе ростовые процессы затухают. В это время имеются зрелые функционирующие железы, продолжаются копуляции и яйцекладки. В сентябре у погибающих улиток синтез ДНК отсутствует. Подчеркнем, что яйцекладки у годовиков и вылупление молоди отмечаются непрерывно на протяжении июля-августа, поэтому каждое новое поколение формируется с разницей в возрасте до 2 мес, и половое созревание перезимовавших особей, в том числе развитие белковой железы, происходит в популяции асинхронно. Теперь понятны большие вариации ИМЯсут в одно и то же время года (например, в июне — 5−60%) — они отражают различия в степени зрелости желез, обусловленные возрастной неоднородностью годовиков. Это обстоятельство не позволяло объективно характеризовать данный показатель средним значением, зато представлялась возможность в одной выборке, взятой в конце июня — начале июля, исследовать всю динамику созревания и полиплоидизации клеток, а в августе иметь однородный материал в стадии продолженного функционирования желез. При ежесуточной зависимости роста янтарок от погодных условий, прежде всего от влажности, такой подход оказался наиболее целесообразным. Он и использован во всех дальнейших опытах.
Для выявления динамики полиплоидизации клеток белковой железы в сборах 1981,1983 и 1984 гг. улиткам-годовикам разного размера однократно вводили ЗН-тимидин с фиксацией через 0,5−1 ч. На радиоавтографах определяли долю меченых и немеченых ядер разных классов плоидности, общий ИМЯ, а также митотический индекс (МИ) диплоидной фракции клеток. Всего в 3 опытах обработан материал от 52 животных, представлявших весь ряд полового созревания- для каждой белковой железы просчитывали от 1000 до 4000 ядер (4,7). Онтогенетическая динамика белковой железы представлена на рис. 4. В ней выделено 5 стадий.
1. Стадия пролиферации диплоидных клеток (сеголетки в августе-сентябре и годовики в мае-июне). Ядра содержат 2с-4с ДНК, ИМЯ при импульсном мечении ЗН-тимидином в пределах 16−35%, МИ — 0,8−3,9%. Мелкие недифференцированные клетки.
II. Стадия ранней полиплоидизации (годовики в мае-июне). Увеличивается доля 4с-ядер, появляются 8с-ядра, ИМЯ варьирует от 10 до 30%, МИ — от 1 до 2,7%. Секретообразование еще отсутствует.
70 60 50 40 30 20 10 О
2 4 8 1632 2 4 8 1632 64 2 4 8 1632 64 Рис. 4. Распределение ядер клеток белковой железы янтарки по уровням плоидности на разных стадиях развития (1-У). По оси абсцисс — уровни плоидности, с- по оси ординат — доля ядер, %. Заштрихованные столбики -меченные 3Н-тимидином ядра. Вертикальные отрезки — максимальные и минимальные значения.
III. Стадия интенсивной полиплоидизации и роста (годовики в июне-начале июля). Ядра секреторных клеток полиплоидизируются до уровней 16с-32с, типичный ИМЯ составляет 11−33%, к концу стадии снижается до 5−7%, МИ фракции диплоидных клеток около 0,4−1%. Секреторные клетки резко увеличиваются, синтезируется и накапливается секрет.
IV. Стадия дефинитивной зрелости (годовики в конце июня- июле). Ядра содержат от 2с до 64с ДНК, соотношение диплоидных вспомогательных и полиплоидных (16с-32с-64с) секреторных клеток составляет примерно 1:1, ИМЯ снижается до 25%, а среди секреторных клеток — до 0,5−3%, МИ — до 0,1−0,8%. Клетки зрелые, секрет течет, начинается первая яйцекладка.
V. Стадия продолженного функционирования желез, повторные яйцекладки (годовики в июле-августе). Уровни плоидности те же, синтез ДНК и митозы у большинства о собей практически отсутствуют, но у некоторых регистрируется ИМЯ до 5%. Клетки зрелые, секрет течет, встречаются пикнотические и дегенерирующие ядра.
В дальнейшей работе при изучения закономерностей репликации ДНК и механизмов полиплоидизации клеток в 1986 г. взята новая выборка из 30 животных, которая также потребовала определения стадий развития и ростовых потенций каждой железы (11). Проводилась цитофотометрия ДНК на ЗН-тимидиновых радиоавтографах — раздельно для меченых (Ь'-фазных) и немеченых (01- и 02фазных) ядер, что позволило выявить положение ядер в клеточном цикле, истинную кратность, полноту и возможные ошибки эндорепродукции геномов. Представленный на рис. 5 ряд из 11 животных, фиксированных в конце июня -начале июля (№ 1−8) и в августе (№ 9−11), отражает динамику развития белковой железы. Животные № 1−3, а также участок 4а от железы животного № 4, демонстрируют стадию II — ранней полиплоидизации- № 46 и 4в — постепенное продвижение в III стадию — интенсивной полиплоидизации (здесь отмечен и максимальный ИМЯ — 33,4 и 25,5% соответственно) — № 5−7 — завершение П1 стадии, формирование модальных классов плоидности- № 8 — максимальная полиплоидизация к IV стадии дефинитивной зрелости (отсутствие класса 8с и минимальный ИМЯ, составивший в популяции секреторных клеток 2,2%, свидетельствуют о завершении роста) — № 9 — типичное состояние терминальной дифференцировки в стадии V, функционирование железы в отсутствие ростовых процессов- № 10−11 — заметная активация ростовых процессов и формирование молодой генерации секреторных клеток (появление новых тетра-октаплоидных ядер, возрастание ИМЯ во фракции 2с-8с ядер до 5,5%, кластерное расположение молодых ацинусов, уменьшение доли ядер высших классов плоидности). Частота встречаемости животных с признаками регенераторного роста белковой железы
Рис. 5. Распределения ядер, меченных (черные столбики) и не меченных (светлые столбики) ЗН-тимидином, по массе ДНК-фуксина (уровням плоидности) на препаратах-радиоавтографах.
По оси абсцисс — уровни плоидности, с- по оси ординат — число ядер, %.
В результате разграничения фракций меченых и немеченых ядер (рис. 5), установлено, что в циклах эндорепродукции происходит в основном полное, т. е. двукратное, умножение геномов, так что ядра по признаку массы ДНК представляют ряд 2с-4с-8с-16с-32с-64с. В то же время выявляется до 3−5% немеченых ядер на промежуточных уровнях плоидности — около Зс-6с-12с-24с ДНК (животные № 4 В, 5, 6, 8, 9, 11), а также заметные сдвиги гистограмм в сторону гипоэуплоидных значений. Было предположено (11), а потом и показано (15), что промежуточные уровни плоидности возникают в результате асимметричных митозов с последующей эндорепродукцией Зс-ядер (см. раздел 3.3.2). Ядра с гипоэуплоидными значениями ДНК обычно имеют неправильную форму, признаки пикноза или диффузии хроматина и, по-видимому, принадлежат терминально дифференцированным стареющим клеткам. Неполная репликация ДНК представляется маловероятной.
Таким образом, в гистогенезе белковой железы янтарки рост и дифференциация секреторных клеток сопряжены с полиплоидизацией до определенного «рабочего» уровня — 16с-32с-(64с). Причем полиплоидия начинает развиваться прежде, чем появляются видимые включения секрета. В зрелых железах во второй половине лета ростовые процессы отсутствуют, но возможны периодические очаговые проявления регенерации — старение и отмирание в секреторных циклах части высокоплоидных клеток и замена их молодыми растущими клетками из диплоидного резерва с обязательной полиплоидизацией до «рабочего» уровня. Источники регенерации не установлены, но, по-видимому, камбиальные клетки присутствуют среди вспомогательных (опорных, ресничных) диплоидных клеток, которые расположены в ацинусах вперемешку с секреторными клетками. По гистогенетическим проявлениям секреторный эпителий белковой железы янтарки сходен с аналогичными полиплоидизирующимися и медленно обновляющимися клеточными популяциями млекопитающих — такими как мегакариоциты, эпителий печени или мочевого пузыря. По-видимому, здесь возможна и репаративная регенерация. Для белковой железы прудовика Ьутпаеа 1шпса1и1а показана способность к регенерации на основе гиперплазии эпителия после ее атрофии и некроза, вызванных мирацидиями фасциол (Копс1е1аис1, ВапЬс, 1980). 3.2.2. Дифференциация клеток и динамика транскрипционной активности
Морфологические проявления дифференциации клеток белковой железы изучали с помощью электронной микроскопии на зачатках 1-И стадий развития и созревающих железах III стадии (16). Соотношение репликационной и транскрипционной активности ядер секреторных и вспомогательных клеток выявляли путем параллельного «импульсного» инкубирования кусочков от одной и той же белковой железы в присутствии ЗН-тимидина и ЗН-уридина. В трех независимых опытах (1983, 1984, 1986 гг.) для 44 желез по ранее установленным критериям определяли стадии развития и оценивали частоту ядер, включивших ЗН-тимидин (ИМЯт, оценка по 1000 ядрам) и ЗН-уридин (ИМЯу, оценка по 300−900 ядрам) (7,16). Кроме того, на 62 животных с железами III-V стадий развития пул РНК-синтезирующих клеток определяли в режиме насыщения ЗН-уридияом — через 1, 4, 8 и 12 ч после инъекции предшественника. При этом ядра классифицировали по плотности метки как слабо, умеренно и интенсивно меченные. Для каждой железы учитывали по 400−1500 ядер (7).
В зачатках белковой железы (1-П стадии) ядра по данным цитофотометрии содержат 2с-4с-8с ДНК. Обнаружены участки из ди-тетраплоидных клеток с процессами ранней цитодифференциации. Недифференцированные клетки имеют небольшие 2с-ядра с темной кариоплазмой, трофические включения, узкие цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР). В будущих секреторных клетках ядра более крупные и светлые, часть из них, вероятно, уже тетраплоидные, в них четко разграничены гетеро- и эухроматиновые массы, цитоплазма разрежена, цистерны ШЭР расправлены, хотя общий объем цитоплазмы еще невелик. В зачаточных ацинусах имеются и октаплоидные клетки с такими же признаками дифференцировки. В более зрелых железах (III стадия) растущие секреторные клетки классов 8с-16с имеют нормально развитый ШЭР, диктиосомы с гомогенным электронноплотным содержимым и уже вполне зрелые, хотя и малочисленные, секреторные гранулы. В терминально дифференцированных клетках (IV-V стадии) полиплоидные 16с-32с-ядра имеют хромоцентрическую структуру (см. ниже-рис. 9), эухроматические компоненты и перихроматиновые гранулы. В цитоплазме в равной мере представлены участки ШЭР и диктиосомы, число секреторных гранул варьирует — в связи с секреторных циклом. Вспомогательные ресничные клетки узкие, имеют мелкие диплоидные ядра.
4. ВЫВОДЫ.
1. Соматическая полиплоидия широко распространена в гистогенезах гастропод. Возможность полиплоидизации клеток не ограничивается каким-либо функциональным типом, но степень проявления полиплоидии тканеспецифична. У легочных и заднежаберных полиплоидия выявлена в железах покровов, пищеварительного и полового трактов (обычно до 32с-128с), причем уровни плоидности белковых клеток выше, чем слизистых. Полиплоидными бывают поровые и кальциевые клетки соединительной ткани, питающие клетки гонады, минерализующие клетки радулы (до 1бс-64с). Наиболее выражена полиплоидия в нейронах ЦНС — до 16 384с у легочных и 262 144с у заднежаберных гастропод.
2. Соматическая полиплоидия сопряжена с дифференциацией тканей и не является следствием старения. У легочной улитки янтарки Succinea lauta (модельный объект) процессы эндорепродукции начинаются у ювенильнЫх особей (сеголеток) и продолжаются у взрослых (годовиков). Клетки пищеварительного тракта полиплоидизируются уже в первое лето жизни, белковой и предстательнойжелезво второе летонейроны ЦНС растут и синтезируют ДНК на протяжении всей жизни.
3. Белковая железа янтарки наиболее удобна для изучения динамики и механизмов полиплоидизации клеток. Выделено 5 стадий ее развития. В I стадии происходит пролиферация диплоидных клеток. Во II и III стадиях секреторные клетки растут и полиплоидизируются с полным умножением геномов в ряду 2с-4с-8с-16с-32с-64соколо 3−5% ядер имеют промежуточные уровни плоидности Зс-6с-12с-24с в результате эндорепродукции клеток после асимметричных митозов. Полиплоидный рост сочетается с высоким уровнем синтеза РНК и продукцией секретов. В стадии IV — дефинитивной зрелости и покоя — различаются вспомогательные (2с) и секреторные (16с-64с) клеткисинтезы ДНК и РНК отсутствуют. В V стадии ростовые процессы и синтез ДНК в зрелых клетках также отсутствуют, но возобновляются синтез РНК и производство секрета. В это же время возможны очаговые проявления регенерации из диплоидного резерва с полиплоидизацией клеток до рабочего уровня 16с-32с. Динамика развития тканей должна учитываться при идентификации эндомитозов. •.
4. Кинетика синтеза ДНК в ядрах разной плоидности одинакова: в клетках белковой железы включение ЗН-тимидйнамаксимально в первой половине Б-периода и плавно снижается во второйконец 8-периода обозначен избирательным включением предшественника в гетеропикнотические хромосомы (суперхромоцентры). Интегральное включение ЗН-тимидина в полиплоидные ядра в каждом последующем эндоцикле удваивается, т. е. в расчете на один геном скорость синтеза ДНК остается постоянной. В то же время скорость репликации закономерно снижается на двух критических этапах развития железы — в ди-тетраплоидных ядрах в связи с началом цитодифференцировки и в высокоплоидных ядрах при завершении роста клеток.
5. Полиплоидные ядра в тканях янтарки имеют хромоцентрическую структуру, так как интерфазные хромосомы сохраняют высший (хроматидный) уровень.компактизации. Постоянство размеров (0,5−1 мкм) и увеличение числа хромоцентров, близкое к расчетному ряду 44(2п)-88(4п)-176(8п)., свидетельствуют о том, что хромосомы не подвержены эндоредупликации, т. е. не являются политенными, а умножение геномов происходит в форме истинной полиплоидиис увеличением числа хромосомных наборов.
6. Полиплоидные клетки в тканях янтарки образуются в результате полиплоидизирующего митоза (4с, реже 6с, 8с) и эндомитоза (от 8с и выше). Аномальные митозы появляются при переходе клеток от камбиальной стадии, с высокой скоростью синтеза ДНК и низким уровнем транскрипции, к стадии секреторной дифференцировки, в которой замедляется репликация и активизируется транскрипция. Появление эндомитозов совпадает с дальнейшим снижением скорости синтеза ДНК. Таким образом, начало и углубление специализации клеток коррелирует и, по всей вероятности, причинно связано с переходом к аномальным митозам и далее к эндомитозам. Два механизма не исключают друг друга, а преемственно сочетаются в процессе эндорепродукции клеток.
7. Эндомитоз проходит на разных уровнях плоидности однообразно и характеризуется сочетанием митотических по сути превращений хромосом с блокированием цитоплазматических структур, обеспечивающих в обычном митозе поляризацию хромосомных наборов и цитокинез. Ультраструктурные данные согласуются с классической схемой эндомитоза Гейтлера. Эндомитоз выявляется как реальная стадия клеточного цикла — синтез ДНК заканчивается в интерфазе за 8−12 ч до деления хромосом (в2-период), синтез РНК временно прекращается или сохраняется на уровне 3−4% относительно интерфазного максимума. Протяженный 02-период и остаточная транскрипционная активность хромосом представляют специфику эндомитотического цикла, обусловленную его совмещением с дифференцировкой клеток и напряженными гетеросинтезамн.
8. Хромоцентрические ядра дифференцированных полиплоидных клеток способны имитировать эндомитоз, особенно в отсутствие или при ослаблении транскрипции — во время функциональной инертности, паузы секреторного цикла или дегенерации клеток. Псевдоэндомитотические состояния можно отличить от эндомитоза при контроле на синтезы ДНК и РНК. Многие известные описания эндомитотической полиплоидии с парадоксальными характеристиками структуры и метаболизма хромосом, на. самом деле базировались’на наблюдениях постэндомитотических ядер с хорошо выраженной хромоцешрической структурой, но и в этих случаях эндомитоз вполне реален на более ранних ¿-гадиях развития.
9. У филогенетически первичных стрептоневральных (переднежаберных) гастропод тканевая полиплоидия или отсутствует, или появляется в малой степени как частная, факультативная модификация гистогенезов, коррелирующая с экологическими, в том числе трофическими, адаптациями видов. У более поздних эвтиневральных групп (заднежаберных, легочных и др.), по-видимому, в связи с анатомической реорганизацией нервной системы, полиплоидия высоких уровней становится общей, стратегической закономерностью развития многих типов клеток и, прежде всего, нейронов. Таким образом, частота и степень развития полиплоидии в разных группах определяются, с одной стороны, ароморфными перестройками онтогенеза в крупных таксонах, а с другой — экологически обусловленными идиоадаптациями на уровне малых групп или отдельных видов. Стабильный признак соматической полиплоидии в тех или иных анатомических системах может являться дополнительным критерием при решении спорных вопросов филогении и систематики гастропод.
10. Полиплоидная клетка по ее гистогенетической сущности представляет эндоклон, а процесс эволюционного преобразования исходно полимерных диплоидно-клеточных клонов в полиплоидные эндоклоны — олигомеризацию на клеточно-тканевом уровне. Слитная форма организации олигомерной системы предполагает её централизацию и структурно-функциональную интеграцию. Вытекающие отсюда свойства олигомерных систем — такие как интенсификация функции, экономичность, упрощение внутрисистемной и надсистемной регуляций, повышение надежности, повышение темпов и сокращение сроков развитиясоставляют в обобщенном виде особенности и значение полиплоидной стратегии роста. С этими свойствами соматическая полиплоидия выступает в морфогенетических процессах как механизм интегративных онтогенетических корреляций, а через отбор в филогенезе приобретает значение соответствующих координаций. В целом полиплоидия представляет адаптивный (аллоили ароморфный) морфогенетический фактор, конкретное значение которого различно и проявляется в соответствии с характером дифференциации той или иной ткани!
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
1. Анисимов А. П. Скрининг на соматическую полиплоидию в тканях легочного моллюска Succineaputris //Цитология. 1981. Т., 23, № 10. С. 1194.
2. Анисимов А. П. Редупликация и транскрипция хромосом в циклах полиплоидизации соматических клеток улитки-янтарки // VIII Всесоюзн. симп. «Структура и функции клеточного ядра» (15−18 мая 1984 г., Пущино). Пущино: Научн. центр биол. исслед. АН СССР, 1984. С. 244−245. 3. Анисимов А. П. Соматическая полиплоидия в тканях полового тракта улитки янтарки//Цитология. 1985. Т. 27,№ 3. С. 309−315. .
4. Анисимов А. П. Динамика полиплоидизации клеток в гистогенезе белковой и предстательной желез улитки янтарки // Цитология. 1986. Т. 28, № 3. С. 318−330.
5. Анисимов А. П. Соматическая полиплоидия в индивидуальном и историческом развитии организмов// Цитология. 1986. Т. 28, № 10. С. 1125.
6. Повещенко О. С., Анисимов А. П. Морфофункциональная характеристика клеток слюнной железы улитки Succinea putris как объекта изучения соматической полиплоидии // Вестн. ЛГУ. 1986. Сер. 3, вып. 3. С. 3−10.
7. Анисимов А. П. Динамика транскрипционной активности в развитии полиплоидных клеточных популяций белковой и предстательной желез, улитки янтарки// Цитология. 1988. Т. 30, № 4. С. 423−432.
8. Анисимов А. П. Простой способ получения постоянных давленых препаратов с использованием целлофана// Цитология. 1992. Т. 34, № 11/12. С. 110−112.
9. Анисимов А. П., Букина И. А. Возрастная динамика и механизм полиплоидизации ядер гигантских нейронов улитки янтарки // Цитология. 1993. Т. 35, № 10, С. 54−55.
10. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. I. Хромоцентрическая морфология полиплоидных ядер // Цитология. 1994. Т, 36, № 1. С. 75−82.
11. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. П. Возрастная динамика полиплоидизации клеток // Цитология. 1994. Т. 36, № 5. С. 416−426.
12. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. III. Позднореплицирующиеся гетеропикнотические хромосомы // Цитология. 1995. Т. 37, № 4. С. 331−338.. ¦ ,.
13. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. IV. Скорость синтеза ДНК при полиплоидизации и дифференциации клеток // Цитология. 1995. Т. 37, № 5/6. С. 500−512.
14. Анисимов А. П, Токмакова Н. П., Повещенко О. С. Соматическая полиплоидия в различных тканях улитки янтарки // Цитология. 1995. Т. 37, № 4. С. 311−330.
15. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. V. Полиплоидизирующий митоз и эндомитоз // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 218−228.
16. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VI. Ультраструкгурная характеристика эндомитотического цикла // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 229 236.
17. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VII. Транскрипционная активность ядер в эндомитотическом цикле // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 237 243.
18. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VIII. Псевдоэндомитоз терминально дифференцированных клеток // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 244 252.
19. Анисимов А. П. Эндомитоз — реальный механизм полиплоидизации соматических клеток//Цитология. 1997. Т. 39, № 1. С. 36−37.
20. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая’полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. I.
Введение
Ткани внутренней среды // Цитология. 1998. Т. 40, № 4. С. 323−331.
21. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая псшиплоиидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. II. Покровы // Цитология. 1998. Т. 40, № 4. С. 332−339.
22. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. III. Пищеварительная система // Цитология. 1998. Т. 40, № 5. С. 372−382.
23. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. IV. Половая система // Цитология. 1998. Т.
40, № 5. С. 383−393.
24. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. V. Нервная система // Цитология. 1999. Т.
41, № 1. с. 14−22.
25. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. VI. Общие закономерности пролиферации и эндорепродукции клеток // Цитология. 1999. Т. 41, № 1. G. 23−31.
26. Анисимов А. П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. VII. Соматическая полиплоидия как морфогенетический фактор // Цитология. 1999. Т. 41, № 1. С. 32−39.
27. Зюмченко Н. Е., Анисимов А. П. Гистологическая организация слюнных желез заднежаберных и легочных брюхоногих моллюсков в связи с развитием в них соматической полиплоидии // Регион, конф. по актуальным проблемам морской биологии и экологии (2−3 октября 1998 г., Владивосток). Владивосток: изд. ДВГУ, 1998. С. 50−52.
28. Зюмченко Н. Е., Анисимов А. П. Соматическая полиплоидия в слюнных железах гастропод // Моллюски. Проблемы систематики и филогении. Автореф. докладов IV (XIII) малакологического совещания (27−29 октября 1998 г. С.
Петербург). С.-Петербург: ЗИН РАН, 1999. С. 00−00.
29. Кирсанова И. А., Анисимов А.11. Полиплоидия нейронов и филогения гастропод // Там же.
30. Расщепкина А. В., Анисимов А. П. Проявление соматической полиплоидии в тканях Odostomia culta — брюхоногош моллюска из п/кл. Sinistrobranchia // Там же.
31. Анисимов А. П., Зюмченко Н. Е., Кирсанова И. А., Токмакова Н. П. Соматическая полиплоидия и филогения гастропод // Бюллетень Дальневосточного малакологического общества. 1999. Т. 4. С. 00−00.
32. Кирсанова И. А., Анисимов А. П. Динамика синтеза ДНК и механизмы постнатального роста нейронов Succinea lauta (Gastropoda, Pulmonata) // Там же.
33. Anisimov А.Р., Zumchenko N.E., Kirsanova Ir.A., Tokmakova N.P. Somatic polyploidy and gastropods phylogeny // Program and abstracts. Int. simp. on circulation research of the East Asian marginal seas — CREAMS'99 (january 26−28,1999; Fukuoka, Japan). Fukuoka: CREAMS, 1999. P. 38.
СПИСОК РАБОТ, ПРОЦИТИРОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ.
Алов И.А. 1972. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина. Бахтадзе Г. И. 1975. Изв. АН ГССР. Сер. биол. Т. 1, № 3. С. 225−231: Бродский В. Я., Урываева И. В. 1970. Онтогенез. Т. 1, № 3. С. 229−247. Бродский В. Я., Урываева И. В. 1981. Клеточная полиплоидия.
Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука. Вепринцев Б. Н. и др. 1964. Биофизика. Т. 9, № 3. С. 327−336. Голиков А. Н., Старобогатов Я. И. 1988. В сб.: Систематика и фауна брюхоногих, двустворчатых и головоногих моллюсков. Л.: Наука, С. 4−77.
Грачева Н.Д. 1982. Цитология. Т. 24, № 10. С. 1185−1198. Гундерина Л. И. 1992. Цитология. Т. 34, № 8. С. 46−53. Гундерина Л. И. и др. 1984. Цитология. Т. 26, № 8. С. 927−935. Гундерина Л. И., Серая Е. И. 1992. Цитология. Т. 34, № 8. С. 54−64. Догель В. А. 1947. Изв. АН СССР. Сер. биол. № 4. С. 471−486. Догель В. А. 1954. Олигомеризация гомологичных органов как один из главных путей эволюции животных. Л.: Изд-во ЛГУ Жинкин Л. Н., Нилова В. К. 1968. Усп. совр. биол. Т. 65, № 2. С. 233−244. Заварзин А. А. 1967. Синтез ДНК и кинетика клеточных популяций в онтогенезе млекопитающих. Л.: Наука. Зацепина О. В. и др. 1983. Цитология. Т. 25, № 2. С. 123−129. Зыбина Е. В. 1983. Цитология. Т. 25, № 10. С. 1103−1119. Зыбина Е. В. 1986. Цитология трофобласта. Л.: Наука. Зыбина Е. В., Зыбина Т. Г. 1985. Цитология. Т.27, № 4. С. 402−410. Зыбина Е. В. и др. 1994. Цитология. Т. 36, № 8. С. 869−873. Кикнадзе И. И. и др. 1975. Цитология. Т. 17, № 5. С. 509−517. Кикнадзе И. И., Истомина А. Г. 1972. Цитология. Т.14, № 12. С. 1519,1528. Кикнадзе И. И., Тутурова К. Ф. 1970. Цитология. Т. 12, № 7. С. 844−853.
Кудрявцев Б.Н. 1991. Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих: Докт. дис. СПб.
Кудрявцев Б.Н. и др. 1997. Цитология. Т. 39, № 10. С. 946−964.
Миничев Ю.С., Старобогатов Я. И. 1975. В сб.: Моллюски, их система, эволюция и роль в природе. JL: Наука. С. 8−11.
Миничев Ю.С., Старобогатов ЯМ. 1979. Зоол. ж. Т. 58, № 3. С. 293−305.
Прокофьева-Бельговская A.A. 1960. В кн.: Вопросы цитологии и общей физиологии. М.- Л.: Изд-во АН СССР. С. 215−253.
Румянцев П.П. 1982. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука.
Соколов И.И. 1967. Цитология. Т. 9, № 2. С. 152−161.
Урываева И.В. 1979. Цитология. Т.21, № 12. С. 1427−1437.
Ченцов Ю.С. 1995. Общая цитология (введение в биологию клетки). М.: Изд-во МГУ.
Шеперд Г. 1987. Нейробиология. М.: Мир. Т. 1, 2.
Шмальгаузен И.И. 1982 (1938). Организм как целое в индивидуальном и историческом развитии. М.: Наука.
Anatskaya O.V. et al. 1994. J. Theor. Biol. Vol. 168. P. 191−199:
Baatout S. et al. 1998. Anticancer Res. Vol. 18. P. 1553−1561.
Barlow P.W. 1976. Protoplasma. Vol. 90. P. 381−392.
Barlow P.W. 1978. Acta biotheoretica. Vol, 27. P. 1−18.
Barnes R.D., Harrison F.W. 1994. In: Microscopic anatomy of invertebrates. New York: Wiley-Liss. Vol. 5. P. 1−12.
Boer H.H. et al. 1977. Neth. J. Zool. Vol. 27. P. 245−252.
Brodsky V.Y., Uryvaeva I.V. 1985. Genome multiplication in growth and development. Biology of polyploid and polytene cells. London: Cambridge Univ. Press.
Bullock Т.Н., Horridge G.A. 1965. Structure and function in the nervous system of invertebrates. San Francisco: Freeman Press. Vol. 2.
Cavallini etal. 1981. Protoplasma. Vol. 109. P. 403−414.
Cell cycle control (Eds: C. Hutchison, D.M. Glover). 1995. New York: Oxford Univ. Press.
Coggeshal R.E. et al. 1970. Chromosoma. Vol. 32. P. 205−212.
D’Amato F. 1989. Cariologia. Vol. 42. P. 183−211.
Datta N.S. et al. 1998. Cell Growth Differ. Vol. 9. P. 639−650.
Geitler L. 1937. Z. Zellforsch. Bd 26. S. 641−672.
Geitler L. 1939. Chromosoma. Vol. 1. P. 1−22.
Geitler L. 1953. Protoplasmatologia. Bd 6/C. S. 1−89.
Gillette R. 1991. Biol. Bull. Vol. 180. P. 234−240.
Grafi G. 1998. Exp. Cell Res. Vol. 244. P. 372−378.
Haszprunar G. 1988, J. Moll. Stud. Vol. 54. P. 367−441.
Heitz E. 1944. Rev. suisse de Zool (Geneva). Bd 51. S. 402−409.
Heitz E. 1953. Arch. Julius Klaus-Stiftung. Bd 28. S. 260−271.
Hyman L, H. 1967. The invertebrates. Mollusca I. Aplacophora,.
Polyplacophora, Monoplacophora, Gastropoda. The coelomate Biiateria. New York: McGraw-Hill. Vol. VI. Kiknadze I.I., Istomina A.G. 1980. Eur. J. Cell Biol. Vol. 21. P. 122−133. Lasek R.J., Dower WJ. 1971. Science. Vol. 172. P. 278−280. Lehner C. E, Lane M.E. 1997. J. Cell Sei. Vol. 110. P. 523−528. Macauley A. et al. 1998. Mol. Biol. Cell. Vol. 9. P. 795−807. Moffett S.B. 1995. Progr. Neurobiol. Vol. 46. P. 289−330. Nagl W. 1976. Nature. Vol. 261. P. 614−615.
Nagl W. 1978. Endopolyploidy and polyteny in differentiation. Amsterdam:
North-Holland. Nagl W. 1981. Int. Rev. Cytol. Vol. 73. P. 21−53. Nagl W. 1995. Protoplasma. Vol. 188. P. 143−150. Nakayama H. et al. 1998. Dev. Biol. Vol. 199. P. 150−163. Nur U. 1968. Chromosoma. Vol. 24. P. 202−209. Rattner J.B., Lin C.C. 1985. Cell. Vol. 42. P. 291−296. Rondelaud D., Barthe D. 1980. Bull. Soc. zool. France. T. 105. P. 481−490. Schreiber M., Schreiber G. 1964. Revista de Biologia. Vol. 57. P. 285−300. Swift H. 1953. Int. Rev. Cytol. Vol. 2. P. 1 -76. Therman E. et al. 1983. Hum. Genet. Vol. 63. P. 13−18. Vitrat N. et alT998. Blood. Vol. 91. P. 3711−3723.
3.5. СОМАТИЧЕСКАЯ ПОЛИПЛОИДИЯ КАК МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР (ЗАКЛЮЧЕНИЕ).
Анализ литературы и собственных данных (20−25) показывает, что для тканей гастропод характерен камбиальный принцип организации. Наиболее очевидно он проявляется в процессах физиологической и репаративной регенерации тканей внутренней среды, кишечного и кожного эпителиев, популяций половых и соматических клеток гонады. Стволовые клетки выявлены также в сердечной мышце. Недифференцированные клетки и возможность регенерации показаны даже для нервной ткани (Moffett, 1995). Пролиферация и дифференциация клеток у моллюсков контролируются ростовыми факторами и гормонами, иммунологически близкими или идентичными соответствующим факторам позвоночных животных.
В то же время эндорепродукция клеток, сочетаемая с пролиферативными процессами, включается в программу многих гистогенезов и становится в определенных группах важным дополнительным фактором постнатального роста органов. Для большинства случаев характерно 3−5 эндоциклов (16с-64с ДНК), для некоторых — 6−7 циклов (128с-256с), а для слюнных желез одостомии — 13 циклов (16 384с). Наиболее закономерна полиплоидия в нейронах эвтиневральных гастропод.
— до 13 циклов (16 384с) у легочных и до 17 циклов (262 144с) у заднежаберных. Сочетая свойства растущих и обновляющихся клеточных популяций, гетероплоидные клетки гастропод в своем развитии проявляют параллелизмы с аналогичными по кинетике роста клеточными популяциями млекопитающихтакими как гепатоциты, кардиомиоциты, мегакариоциты, клетки трофобласта.
Механизмы образования полиплоидных клеток у гастропод в общем те же, что и у других животных. Показана закономерная смена полного пролиферативного митоза сначала неполным полиплоидизирующим митозом (4с, иногда 6с-8с),.а далее эндомитозом (от 8с и выше). Эндомитоз получил подтверждение и дополнительную характеристику с использованием световой и электронной микроскопии, цитофотометрии ДНК, авторадиографии синтезов ДНК и РНК. Ацитокинетический митоз случается редко, двуядерные клетки единичны. Эндоредупликация хромосом и, соответственно, политения у изученных гастропод отсутствуют.
При анализе причин развития полиплоидии непосредственным фактором выступает редукция митотического цикла по тем или иным фазам митоза. Такие изменения, в свою очередь, становятся возможными в результате разобщения ядерного (хромосомного) и цитоплазматического циклов клеточного деления. Это означает отсутствие жестких связей между последовательными событиями митотического цикла: синтезом ДНК, конденсацией хромосом, разрушением ядерной оболочки, сегрегацией хромосом, цитокинезом. В качестве первопричин перестроек митотического цикла могут рассматриваться конкуренция биосинтезов (Бродский, Урываева, 1970, 1981), стабилизация и перестройки цитоскелета (Румянцев, 1982; Кудрявцев и др., 1997; Baatout et al., 1998), репрессия генов митотического цикла (Cell cycle control, 1995; Nagl, 1995; Graft, 1998) (см. также: 25). Возможно, что разные механизмы и уровни умножения геномов, факультативные и облигатные формы проявления полиплоидии имеют в основе и разные причины редукции цикла.
Значение соматической полиплоидии обычно определяют исходя изреальных или потенциальных свойств полиплоидных клеток. В одних случаях подчеркивается пропорциональное числу геномов увеличение синтетических возможностей клеток, в других — экономия пластических и энергетических ресурсов и более высокие темпы развития тканей, в третьих — защита клеток от генотоксичееких воздействий и т. п.
Действительно, и у животных, и у растений полиплоидия развивается в клетках разного функционального назначения (Geitler, 1953; Nagl, 1978; Бродский, Урываева, 1981; D' Amato, 1989), что показано и нами в отношении гастропод, поэтому частный тканеспецифический смысл полиплоидии будет различным. Для тканей гастропод просматриваются, по крайней мере, два таких аспекта. В железистых, поровых, питающих, кальциевых клетках полиплоидия должна служить поддержанию напряженных биосинтезов. В нервной системе сам по себе гигантизм нейронов и увеличение диаметров аксонов, вытекающие отсюда особые электрофизиологические, метаболические и топологические свойства, особенно важные для командных интернейронов, оказываются функциональным смыслом соматической полиплоидии.
Заметим, однако, что даже при явных корреляциях полиплоидии и какой-нибудь частной функции, например, секреторной, ее роль не всегда очевидна, поскольку не ясно, какие преимущества имеет полиплоидная клетка перед эквивалентным числом диплоидных клеток той же специализации. Кроме того, соматическая полиплоидия, хоть она и возникает в более молодых, продвинутых или специализированных группах, не является непременно «прогрессивным» свойством данной ткани. Так, полиплойдизация и гигантизм нейронов у легочных и заднежаберных гастропод расцениваются в целом как адаптация для согласования роста тела и ЦНС, возникающая у крупных гастропод с несложным типом поведения (Gillette, 1991). В противоположность этому, у высших переднежаберных, особенно у хищных, большое число мелких нейронов обеспечило увеличение комплексности мозга, развитие особо чувствительных органов с высоко разрешающим анализом окружения и в итоге формирование сложного поведения.
Как видно, полиплоидия обеспечивает лишь морфо-функциональные адаптации и часто бывает «выходом из положения», даже в ущерб гистогенетической пластичности, которую могут обеспечить диплоидные клеточные популяции. Подобные неопределенности, отсутствие тканевой специфичности полиплоидии и, наоборот, ее закономерное развитие в определённых филогенетических группах требовали более широкого взгляда на проблему, что и привело нас к формулировке ряда общих положений о биологическом смысле соматической полиплоидии (5,26).
С целью дать универсальное толкование явлению соматической полиплоидии, желая подчеркнуть эндорепродуктйвный механизм объединения геномов, моноклональное происхождение полиплоидной клетки и ее функциональную эквивалентность отдельному клеточному клону (или его части), мы сочли резонным определить полиплоидную клетку по ее гистогенетической сущности как эндоклон, а процесс эволюционного преобразования диплоидно-клеточных клонов в полиплоидные эндоклоны как олигомеризацию на клеточно-тканевом уровне. Таким образом, полиплоидная клетка представляется структурно-функциональным и гистогенетичесйим комплексом, свойства которого поддаются прогностической оценке как свойства олигомеризованной системы — в соответствии со стандартными понятиями из теории полимеризации и олигомеризации Догеля (1947,1954), теории надежности й общей теории систем. Некоторые из этих свойств находят эмпирические основания, другие остаются гипотетическими, но вполне ожидаемыми.
Базовое свойство эндоклона вытекает из его слитной формы организации, которая предполагает централизацию и интеграцию структуры и функции олигомерной системы. В альтернативном варианте для клонов диплоидных клеток имеем блочную (модульную) организацию с тенденцией к децентрализации й дезинтеграции структуры и функции полимерной системы, которая преодолевается усложнением механизмов межклеточной регуляции. Тогда важнейшие производные свойства олигомерных систем — такие как интенсификация функции, экономичность, упрощение внутрисистемной и надсистемной регуляций, повышение надежности, повышение темпов и сокращение сроков развития — могут составить в обобщенном виде особенности и значение полиплоидной стратегии роста.
Ключевым является понятие интенсификации функции — при условии, что оно выражает не просто усиление функции, а противопоставляется альтернативному понятию экстенсификации. Интенсивный способ функционирования полиплоидных эндоклонов по сравнению с экстенсивно функционирующими клонами диплоидных клеток означает не столько увеличение специфической продукции, эквивалентное дозе генов, сколько снижение затрат на ее производство, то есть экономичность. Интенсификация функции предполагает также упрощение внутрисистемной регуляции гомологичных геномов, объединенных в одной клетке под общим рецепторным полем плазмалеммы.
Возможность упрощения надсистемных регуляций исходит из гигантизма и топологических свойств олигомерных систем. В гигантских командных интернейронах гастропод (аналогично — у кальмаров, раков, рыб) при выполнении «комплекса фиксированных действий» (Шеперд, 1987) очевидно упрощение регуляции обширной периферии за счет исключения промежуточных операций и объединения многих иннервируемых структур под единое управление. Та же логика справедлива и для других гигантоклеточных органов улиток, в частности для слюнных желез, полиплоидные клетки которых обладают электровозбудимостью и связаны щелевыми контактами. Потенциалы действия от нейронов быстро распространяются по железе, синхронизируя активность всех клеток. В случае гигантских интернейронов одновременно синхронизируются и другие органы питания. Преимущество такого олигомерного комплекса состоит в том, что он требует менее разветвленной системы иннервации и меньшего числа контактов, что и упрощает надсистемную регуляцию. В этих отношениях виден смысл коррелятивного проявления полиплоидии в нейронах и других органах, столь характерного для эвтиневральных гастропод.
Повышение надежности слитной структуры для полиплоидных клеток должно означать более высокую устойчивость к повреждающим факторам. В частности, избыточность геномных копий должна компенсировать отдельные мутации, поддерживая жизнеспособность клеток в генотоксичной среде. Это свойство полиплоидии активно обсуждается в отношении гепатоцитов млекопитающих (Урываева, 1979; Anat.sk.ayа с1 а1&bdquo- 1994).
Повышение темпов и сокращение сроков развития отдельных клеточных популяций, тканей, органов в результате редукции митоза могло бы иметь определенное морфогенетическое значение как в онтогенезе организмов, так и в эволюции групп. В частности, механизм клеточной олигомеризации был бы полезен при согласовании роста и функциональных напряжений эволюционно молодых анатомических структур и уже имеющихся у прёдковой группы органов и тканей, сложившихся на предыдущих этапах эволюции. Особое значение такой механизм мог иметь при резких изменениях онтогенеза в прогрессирующих группах с. высоким темпом эволюции, при специализациях^ ценогенетических перестройках раннего онтогенеза (эмбриональные и личиночные новообразования, гетерохронии, гетеротопии). При этом для новых органов полиплоидия могла выступать и как фактор согласования темпов развития, и как фактор интенсификации функции. По масштабности преобразований полиплоидия в разных органах могла иметь алломорфное (идиоадаптивное) или ароморфное значение. Имеющиеся данные о свойствах и распространении полиплоидных клеток у гастропод, а также и в других группах, согласуются с такой трактовкой явления соматической полиплоидии.
Используя идею и термины Шмальгаузена (1938) о морфо-функционадьных корреляциях и координациях в онтои филогенезах, можно сказать, что соматическая полиплоидия выступает в морфогенетических процессах как механизм интегративных онтогенетических корреляций, а через отбор в филогенезе приобретает значение соответствующих координации.
Таким образом, в самом общем виде соматическую полиплоидию можно рассматривать по гистогенетической сущности как эндоклоногенез, или олигомеризацию исходно диплоидных клеточных клонов, а по результату как адаптивный (аллоили ароморфный) морфогенетический фактор, конкретное значение которого различно и проявляется в соответствии с характером дифференциации той или иной ткани.