Исследование геномного разнообразия популяций человека методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга

1.1) Актуальность проблемы.

Одно из современных направлений фундаментальных исследований популяционной генетики — использование полиморфизма геномной ДНК для изучения структуры и эволюции популяций человека. Полиморфизм геномной последовательности не случаен и является следствием многочисленных мутационных изменений, накопленных в ходе биологических, исторических и экологических процессов. В настоящее время изучение полиморфизма ДНК проводится на многих популяциях мира, при этом в исследования включаются как диаллельные, так и гипервариабельные локусспецифические последовательности ДНК ядерного и митохондриального генома. Популяционные различия в распределении частот аллелей установлены для многих полиморфных системоднако показано, что гипервариабельные локусы ДНК в силу своей большей гетерозиготности в популяциях, являются наиболее информативными маркерами при изучении структуры популяций. Одним из методов, использующих гипервариабельность минисателлитных локусов, является мультилокусный ДНК-фингерпринтинг, который визуализирует множественный полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, что позволяет достаточно быстро выявлять генетическую вариабельность на внутрии межпопуляционном уровнях. Метод разработан A.J. Jeffreys [Jeffreys et al, 1985] и получил свое название вследствие крайней специфичности индивидуальных паттернов гибридизации. Результаты ДНК-фингерпринтинга являются чувствительным индикатором геномного полиморфизма, так как вследствие высокой вариабельности картин гибридизации мала вероятность совпадения паттернов у случайных индивидуумов. Метод нашел широкое применение в криминалистике, генеалогических исследованиях, близнецовом анализе и исследованиях мутационных процессов. Результаты использования метода в популяционных исследованиях позволяют сделать вывод о его высокой эффективности для описания как популяционной структуры большой подразделенной популяции, принадлежащей к одному этносу, так и генетической структуры различных в этническом отношении популяций. Тем не менее, в настоящее время мультилокусный ДНК-фингерпринтинг не получил широкого применения в популяционных исследованиях из-за ряда методических проблем и проблем, связанных со статистической обработкой результатов. Значительным недостатком метода является отсутствие генетической интерпретации происхождения фрагментов гибридизации, что не позволяет использовать традиционные статистические методы популяционно-генетического анализа результатов. Другой серьезной проблемой является сопоставление результатов, полученных в различных лабораториях, даже при условии использования одного гибридизационного зонда. В настоящее время известно значительное количество последовательностей, при гибридизации которых с ДНК человека получается картина фингерпринтинга, одной из них является 15-ти нуклеотидный тандемный повтор в последовательности бактериофага М13 [Джинчарадзе и др., 1987; Vassart et al, 1987]. Первые работы по исследованию популяций человека, выполненные методом мультилокусного ДНК-фингерпринтинга на основе ДНК фага М13, показали широкие возможности метода и проблемы, связанные с анализом полученных данных. Поэтому представляет определенный интерес детальная разработка мультилокусного ДНК-фингерпринтинга,. как метода, позволяющего достаточно быстро и адекватно сопоставлять генетические структуры близких и отдаленных в этническом отношении популяций человека.

Территория Северной Евразии является зоной контакта монголоидной и европеоидной рас, поэтому исследования генофонда современного коренного населения представляют особый интерес для популяционной генетики и широко проводятся в настоящее время. Накоплен огромный материал популяционно-генетических исследований народонаселения различных регионов Северной Евразии, в том числе по популяциям из России и Белоруссии, которые были изучены в представленной работе [Микулич, 1989; Рафиков и др., 1981, 1987, 1992; Шнейдер и др., 1989, 1995; Хуснутдинова, 1999; Хуснутдинова и др., 1999а, 19 996]. Исследования, выполненные методом мультилокусного.

ДНК-фингерпринтинга, могут внести значительный вклад в изучение генетической структуры народонаселения Восточно-Европейского региона.

выводы.

1) Оптимизированы условия мультилокусного ДНК-фингерпринтинга и разработаны способы первичной обработки данных, что позволило добиться необходимой воспроизводимости результатов и провести исследование группы популяций из России и Белоруссии.

2) Предложены варианты статистической обработки данных и способы их использования для анализа результатов мультилокусного ДНК-фингерпринтинга, которые позволяют охарактеризовать исследуемую систему популяций и оценить уровень генетической дифференциации в группах, формируемых на разных уровнях организации популяционной структуры.

3) По результатам многомерного статистического анализа данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга выявлено, что исследованная система популяций разделяется на три мажорных кластера, которые формируют треугольник в условном пространстве 1 и 2 размерности. Ось первой размерности разделяет группы славянских и уральских популяций, ось второй размерности отделяет группу популяций с наибольшим содержанием монголоидного компонента.

4) Показано, что славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая характеризуется наименьшим уровнем межпопуляционного разнообразия (Сэт = 0.030 (0.033)) и наиболее существенными отличиями от остальных групп.

5) Обнаружены различия в уровнях популяционной подразделенности в пределах одного этноса: высокая гетерогенность группы башкирских популяций и значительное сходство белорусских популяций из различных регионов.

6) Показана устойчивость картины дифференциации популяций, полученной различными методами многомерного статистического анализа, что свидетельствует об адекватности результатов и эффективности использования метода мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для исследований популяций человека.

Выражаю глубокую благодарность Светлане Андреевне Лимборской за предоставление темы, терпение и руководство;

Василию Евгеньевичу Дерябину за консультации по вопросам многомерной статистики.

Также благодарю всех сотрудников Отдела молекулярных основ генетики человека за благожелательное отношение и помощь при обсуждении полученных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Исследование генофонда современного коренного населения бывшего Советского Союза широко проводится в настоящее время с использованием генетических маркеров различных типов. Признано, что для получения несмещенных оценок генетических расстояний между популяциями необходима информация по многим полиморфным локусам. В этом смысле мультилокусный ДНК-фингерпринтинг с использованием ДНК фага М13 в качестве зонда представляет значительный интерес, так как позволяет выявлять множество гипервариабельных локусов, которые равномерно распределены по всей геномной последовательности и имеют менделевский тип наследования.

Тем не менее, в настоящее время мультилокусный ДНК-фингерпринтинг не получил широкого применения в популяционных исследованиях из-за ряда методических проблем и проблем, связанных со статистической обработкой результатов.

При постановке экспериментов, был выработан ряд дополнительных рекомендаций к стандартной методике фингерпринтинга, которые позволили добиться необходимого качества и воспроизводимости результатов эксперимента:

• для ДНК-фингерпринтинга необходимо использовать только хорошо очищенные высокомолекулярные образцы ДНК.

• особое внимание необходимо уделять качеству используемых реактивов, особенно, агарозы, формамида и ТРИС.

• при использовании буфера ТАЕ для проведения электрофореза, помимо ежедневной смены буфера, для повышения буферной емкости можно увеличить его концентрацию до 1.5х.

• при проведении электрофореза при комнатной температуре, оптимальным напряжением является 50 — 55 В (1.8 — 2.0 В/см) — проблема диффузионного размывания полос полностью снимается при проведении электрофореза при низкой температуре (+4 С): полосы хорошо сфокусированы даже при более низком напряжении (35 — 40 В).

• точность идентификации позиций фрагментов гибридизации на радиоавтографах в значительной степени определяется качеством используемого маркера молекулярных масс: маркер должен иметь достаточное количество реперных фрагментов во всей исследуемой области.

• постановка гибридизации в малом объеме, использование качественного формамида и 1% SDS в гибридизационном буфере значительно улучшают гибридизационную картину.

• из разных типов фильтров, использованных в работе, наиболее подходящими оказались Hybond С extra.

В представленной работе также были разработаны принципы первичной обработки картин блот-гибридизации, которые позволяют достаточно точно идентифицировать фрагменты гибридизации на радиоавтографах и, следовательно, сопоставлять данные разных экспериментов. В рамках представленной работы была получена матрица размеров фрагментов, выявляемых при гибридизации с ДНК фага М13, в наиболее разрешаемой и информативной области фингерпринтинга (10 -1.8 тпн). Матрица размеров фрагментов может быть использована для анализа аналогичных данных по другим популяциям.

Получены распределения частот фрагментов гибридизации для изученных популяций и рассчитаны различные параметры геномной вариабельности. Предложены два варианта расчета критериев генетической дифференциации: через показатели сходства и гетерозиготность. Первый вариант, несмотря на большую сложность расчета, оказался более приемлемым для анализа подобных данных, так как позволяет работать с малыми выборками и дает более сопоставимые результаты с результатами, полученными другими методами анализа.

Результаты первичной обработки картин ДНК-фингерпринтинга, представленные в виде бинарной матрицы, были сопоставлены с аналогичными данными для популяций Волго-Уральского региона [Хидиятова, 1993; Хуснутдинова, 1997]. Выполнен совместный статистический анализ данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга для 13 популяций, который выявил следующее:

Исследованная система популяций разделяется на три мажорных кластера: 'Славянский', кластер 'Башкиры' - 'Якуты' и 'Уральскую группу'. Не наблюдается абсолютного соответствия между полученным подразделением популяций Волго-Уральского региона и общепринятой лингвистической классификацией: популяции 'Татары' и 'Чуваши', которые принадлежат к Алтайской лингвистической семье, формируют третий кластер с популяциями Уральской лингвистической семьи. Исследованная нами якутская популяция примкнула к группе башкирских популяций, которые, по разным оценкам [Хуснутдинова, 1999], характеризуются наибольшим содержанием монголоидного компонента.

Кластеры формируют треугольник в условном пространстве 1 и 2 размерности. Популяции с наибольшим содержанием монголоидного компонента (якутская и башкирские популяции) отделяются от всех остальных популяций по оси 2 размерности, при этом наиболее монголоидная якутская популяция, в большинстве случаев, показывает максимальные различия по координате. Ось 1 размерности разделяет славянские популяции и 'Уральскую группу', второй кластер занимает промежуточное положение.

Славянские популяции образуют наиболее компактную и гомогенную группу, которая характеризуется наименьшим уровнем межпопуляционного разнообразия (бэтСлав = 0.030 (0.033)) и наиболее существенными различиями от остальных групп.

Белорусские популяции не показали региональных различий в отличие от группы башкирских популяций. Популяция юго-западных башкир ('Башкиры4') значительно выделяется из группы остальных башкирских популяций и занимает промежуточное положение между кластером 'Башкиры' - 'Якуты' и смешанным кластером остальных популяций Волго-Уральского региона.

Наблюдаются значительные внутрикластерные (межпопуляционные) различия для кластеров, сформированных популяциями Волго.

Уральского региона, при этом, общие различия между башкирским этносом и 'Уральской группой' незначительны.

• Максимальный уровень межпопуляционного разнообразия выявлен для тюркской лингвистической группы (СзгТюрк=0.081(0.096)) по сравнению с межпопуляционным разнообразием для других лингвистических групп, сформированных в соответствие с лингвистической классификацией.

В работе представлен, вероятно, наиболее полный на сегодняшний день набор различных вариантов статистического анализа данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга. Сопоставление полученных результатов позволяет рекомендовать многомерное шкалирование, как оптимальный с точки зрения информативности и простоты необходимых для выполнения анализа расчетов, метод для получения представления об анализируемой системе популяций.

Анализ данных мультилокусного ДНК-фингерпринтинга различными статистическими методам, в целом, дал идентичные и адекватные результаты. Исследование гетерогенной группы популяций человека выявило сходство между территориально удаленными популяциями, принадлежащими одному этносу и значительные различия между популяциями разных этносов. Результаты работы позволяют сделать вывод о целесообразности использования метода для исследования генетической структуры, оценки генетической вариабельности и генетического родства в сложных группах различных в этническом отношении популяций. Доступность компьютерных программ, в частности, пакета статистических программ БТАТ/ЭТЮА, дают возможность применения различных методов многомерного статистического анализа, которые позволяют наглядно представлять полученные результаты, выявлять взаимосвязи и внутреннюю структуру в исследуемой группе популяций.

Расчет показателей сходства и критериев генетической дифференциации позволяет оценить вариабельность на внутрии межпопуляционных уровнях и сравнить полученные результаты сданными по другим ДНК и биохимическим маркерам.