Инверсная иммунорегуляция, моделирование и коррекция патологического поведения

Содержание

• 4. Исследовать возможность коррекции судорожной активности крыс иммунизацией конъюгатом сиднофена, используя модель коразолового киндлинга и однократное введение коразола

5. Изучить возможность индукции депрессивного состояния у крыс иммунизацией разными вариантами ковалентных конъюгатов ингибиторов МАО — паргилина и депренила, а также эндогенного ингибитора МАО — изатина- провести биохимические исследования активности МАО в органах и тканях иммунизированных крыс, а также уровня биогенных аминов в стриатуме. 6. Выявить возможность иммунизации крыс к конъюгированному фрагменту холецистокинина (ХЦК-4) и получения анксиолитического эффекта- провести сравнение эффектов иммунизации с действием самого ХЦК-4.

Научная новизна. Показано, что активная иммунизация крыс к основному ферменту метаболизма, этанола — гетерологичной алкогольдегидрогеназе печени лошади в разработанном режиме оказывает длительное подавляющее влияние на формирование экспериментального алкоголизма и не оказывает негативных влияний на поведение. Биохимическими следствиями иммунизации являются снижение активности АДГ в печени и надпочечниках. Показана возможность использования для активной иммунизации и повышения ее эффективности нового иммуностимулятора полиоксидония.

Обоснован иммунный механизм феномена подавления алкогольной мотивации иммунизацией к АДГ посредством выявления цепи реакций: быстрого связывания экзогенной АДГ лейкоцитами, индукции синтеза антител к АДГ после переноса этих лейкоцитов другому животному, и, наконец, подавления влечения к алкоголю у реципиентов лейкоцитов.

Разработан новый подход к углубленному изучению роли АДГ, а именно, эпитопов АДГ, ответственных за антиалкогольный эффект- установлено, что АДГ 265−276 является эпитопом, ответственным за подавление алкогольной мотивации, вызываемой целой молекулой АДГ.

Обосновано представление о том, что роль АДГ в формировании алкогольной мотивации не может быть связана с ее участием в образовании ацетальдегида. Наиболее вероятна связь через метаболизм некоторых нейромедиаторов и гормонов, в которых участвует АДГ.

Впервые показана возможность и эффективность использования для активной иммунизации лекарственных препаратов (сиднофен, паргилин, депренил), не являющихся эндогенными регуляторами, путем ковалентного связывания их с антигенами-носителями.

На модели коразоловых судорог и коразолового киндлинга показано, что иммунизация крыс к аналогу фенамина сиднофену оказывает противосудорожный эффект.

Выявлена эффективность модуляции активности МАО методом инверсной иммунорегуляции, которая вызывает длительные изменения как на биохимическом уровне, так и в поведении экспериментальных животных.

Индукция длительного состояния депрессии при таких воздействиях рассматривается как новая долговременная модель для фундаментальных исследований механизмов и патогенеза патологических состояний, связанных с нарушениями в системе МАО.

Исследования по активной иммунизации с использованием эндогенного регуляторного пептида ХЦК-4 позволили не только уточнить роль ХЦК-4 в регуляции поведения тревожности и страха, но и получить новые данные об анксиолитическом эффекте иммунизации и возможности направленной и длительной иммунокоррекции патологических форм проявления тревожности и страха, а также депрессии.

Положения, выносимые на защиту. Иммунизация белых крыс к ферменту метаболизма этанола гетерологичной лошадиной АДГ вызывает длительное подавление процесса формирования алкогольной мотивации и не оказывает негативного влияния на ряд функций ЦНС, динамику веса и выживаемость.

Активная иммунизация к гетерологичной АДГ вызывает длительную продукцию антител, которые связывают и собственную эндогенную АДГ, изменяя ее активность в печени и надпочечниках.

Фрагментом АДГ, ответственным за антиалкогольный эффект иммунизации, является эпитоп АДГ 265−276, не связанный непосредственно с энзиматической активностью АДГ.

Роль АДГ в механизмах формирования влечения к этанолу не сопряжена (по крайней мере непосредственно) с метаболизмом этанола и образованием ацетальдегида. Более вероятно участие АДГ в метаболизме нейромедиаторов и гормонов, что подкрепляется биохимическими данными об изменении уровня ряда биоаминов в плазме крови и мозгу белых крыс.

Иммунизация ковалснтным конъюгатом психостимулятора и антидепрессанта сиднофена вызывает в отличие от активирующего действия самого препарата выраженные седативные эффекты. Последние коррелируют с противосудорожным эффектом иммунизации к сиднофену.

Следствием иммунизации крыс к ингибиторам МАО является повышение активности МАО в органах и тканях иммунизированных крыс и изменение уровня биогенных аминов. На поведенческом уровне это выражается в индукции долговременной депрессии.

Активная иммунизация к индуктору панических и тревожных состояний ХЦК-4 вызывает анксиолитические эффекты, противоположные действию самого пептида, а также оказывает антидепрессивное действие.

Полученные методом инверсной иммунорегуляции данные могут быть использованы для долговременной экспериментальной иммунологической коррекции и моделирования таких форм патологических состояний, как алкоголизм, депрессия, повышенная судорожная готовность, тревожность и страх.

Практическое значение. Иммунологические подходы в настоящее время находят широкое применение в клинике. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что инверсная иммунорегуляция — иммунизация ковалентными конъюгатами эндогенных регуляторов с антигенами-носителями или гетерологичными ферментами, определяющими метаболизм эндогенных регуляторов, — представляется наиболее перспективным путем долговременной коррекции ряда патологических состояний. Основное преимущество его состоит в долговременности вызываемых эффектов при небольшом числе воздействий. Такой подход в терапии ряда хронических болезней, таких как алкоголизм и психические нарушения, позволяет избежать многократного систематического введения лекарственных препаратов, обладающих кратковременным действием.

Длительное подавление алкогольной мотивации и отсутствие негативных побочных эффектов в поведении иммунизированных АДГ крыс указывает на относительную «мягкость» применяемых воздействий и дает основание рассматривать его как принципиально новый подход к снижению алкогольной мотивации, который может быть рекомендован для исследований в клинической практике, особенно для лечения тяжелых форм алкоголизма. Результаты иммунизации с использованием нового иммуномодулятора — полиоксидония позволяют избежать" применения не разрешенного для использования в клинике адъюванта Фрейнда.

Индукция длительного депрессивного состояния при иммунизации к сиднофену и ингибиторам МАО может быть рекомендована для исследований, имеющих целью терапию маниакальных и агрессивных состояний, а также, имея в виду результаты с иммунизацией к сиднофену, для купирования повышенной судорожной готовности. Помимо этого, сама модель депрессии может служить инструментом для более глубокого изучения патогенеза и выявления наиболее перспективных антидепрессантов.

Перспективы долговременных воздействий связаны также с иммунизацией к регуляторным пептидам. Полученные нами данные об анксиолитическом эффекте иммунизации конъюгатом

ХЦК-4 крыс с исходно высоким уровнем тревожности могут быть рассмотрены в плане возможной в будущем практической реализации — коррекции патологических состояний тревожности и страха у людей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 31 Международном конгрессе по физиологическим наукам (Хельсинки, 1989) — 28 Совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Ленинград, 1989) — Международном симпозиуме «Сигнальные молекулы и поведение животных» (Пущино, 1989) — Международном симпозиуме по проблемам иммунофармакологии (Тбилиси, 1990) — Конгрессе международного общества патофизиологов (Москва, 1991) — Международной конференции по психонейроэндокринным механизмам адаптации (Италия, 1991) — Конференции Балканских стран по алкоголизму и наркотической зависимости (Белград, 1995) — Международной конференции по нейрохимии и фармакологии наркотической зависимости и алкоголизма (Санкт-Петербург, 1996) — 1 Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996) — 2 съезде Биохимического общества (Москва, 1997) — Международном симпозиуме по алкоголизму (Гродно, 1998) — Международной конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999) — Всероссийской конференции по нейроиммунопатологии (Москва, 1999) — Международной конференции «Медицина в следующем веке» (Польша, 2000) — 30 Всероссийском совещании по проблемам высшей нервной деятельности (Санкт-Петербург, 2000) — 18 съезде физиологического общества (Казань, 2001) — Междун. конфер. по эксперт, биол. Америк, общ-ва фармак., экспер. терапии (США, 2000) — на заседаниях кафедр высшей нервной деятельности и физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на белых беспородных крысах — самцах, а также крысах линии Wistar, Maudsley reactive (MR) и Maudsley nonreactive (MNRA).

Использованы следующие препараты: АДГ из печени лошади фирмы Sigma (США), фармакологические препараты -сиднофен (З-ф-фенилизопропил)-сиднонимина гидрохлорид), паргилин (N-benzyl-N-methyl-2-propynylamine, «Sigma»), депренил (М-диметил-N [2-пропил] бензенэтанамин гидрохлорид) (ICN Biomedical Inc, США), изатин (2,3 диоксииндол), синтезированный в Ин-те биологической медицины, а также пептид ХЦК-4 (ICN Biomedical Inc, США).

Синтез ковалентных конъюгатов

1. Синтез конъюгата паргилина с БСА (как и синтез ряда других конъюгатов) был осуществлен М. Ф. Обуховой, многолетнее сотрудничество с которой явилось непременным условием реализации основных этапов программы настоящего исследования. Он проводился как с использованием глутарового альдегида, так и с использованием в качестве’связующего агента карбодиимида-1 (N-3thji-N З-диметиламинопропил карбодиимид солянокислый (КДИ)) в различных молярных соотношениях (1:50, 1:100 и 1:500). Предварительно с помощью меченого паргилина была оценена степень связывания препарата с белком, оптимальная продолжительность реакции и устойчивость конъюгата при хранении.

Меченый [G-3H] паргилин с общей активностью 0.3 mCi, специфической активностью 0.5 Ci/mmol был синтезирован в Ин-те молекулярной генетики РАН (ВЛ.Шевченко) — чистота меченого паргилина составляла >95%. Показано, что изменение молярного соотношения БСА и паргилина от 1:50 до 1:100 вызывает увеличение связывания препарата и составляет 14−19 молекул на 1 молекулу БСА.

Дальнейшее повышение содержания паргилина в реакционной смеси существенно не изменяло степени его включения.

2. Конъюгирование сиднофена с бычьим сывороточным альбумином (БСА) проводили с помощью 1%-ного глутарового альдегида (фирма Serva, Германия) при молярном соотношении белок/сиднофен 1:80 в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5−8,0. Конъюгат, полученный при таком молярном соотношении компонентов реакции, после диализа содержал от 18 до 27 молей сиднофена на 1 моль белка. Количество связанного сиднофена определяли спектрофотометрически по поглощению при 310 нм.

3. Синтез ковалентных конъюгатов депренила и изатина с БСА в молярных соотношениях 1:100 и 1:200, а также фрагмента ХЦК (30−33) с молярным соотношением 1:100 проводился аналогичным образом с использованием КДИ.

4. Синтез и конъюгация эпитопа АДГ (265−276) с гемоцианином был проведен В. Н. Прозоровским (Ин-т биомедицинской химии РАМН) при помощи 25%-ного глутарового альдегида в 0.1М фосфатном буфере, рН

7.0. Соотношение белка с пептидом составляло 1:30. Там же были получены и любезно предоставлены нам антитела к трем фрагментам АДГ печени лошади: 265−276 (титр антител — 1/12 000), 93−115 (титр — 1/15 000) и 1−14 (титр -1/20 000), которые использовались для пассивной иммунизации.

Иммунизация крыс конъюгатами или препартом АДГ проводилась три раза, с интервалом в 7−8 дней, в четыре точки спины- первые два раза с использованием в основной части экспериментов иммуностимулятора адъюванта Фрейнда (ICN Biomedical Inc, США) в объемном соотношении 1:1. В отдельных сериях в качестве иммуностимуляторов были использованы вакцина БЦЖ, оксид алюминия, гуанилмюрамил дипептид и полиоксидоний. Дозы иммунизации, как правило, были выбраны из расчета 600−800 мкг белка конъюгата на кг веса. В качестве контроля использованы группы с введением 1) физраствора,

2) адъюванта Фрейнда и 3) БСА, обработанного глутаровым альдегидом, с адъювантом Фрейнда.

При пассивной иммунизации используемые агенты вводились в хвостовую вену.

Иммунологический анализ сывороток крови контрольных и опытных животных проводился с использованием твердофазного иммуноферментного метода (ELISA) — фосфатный посадочный буфер рН 7,5 (М.Ф.Обухова).

Поведенческие исследования проводили через три — четыре недели после начала иммунизации и в более поздние сроки с использованием следующих тестов.

1. Двигательная и ориентировочно-исследовательская активность оценивалась в автоматическом приборе «РОДЭО» как в обычных условиях, так и при наличии стрессового раздражителя -прерывистого звукового сигнала. Общее время тестирования составляло 5−10 минут.

2. Для выявления компонентов тревожности и страха в поведении крыс был использован приподнятый крестообразный лабиринт (Pellowetal., 1985).

3. Склонность крыс к развитию депрессивно-подобного состояния оценивали по методике Порсольта в тесте неизбегаемого плавания (Porsolt et al., 1978). С использованием компьютерной программы регистрировали продолжительность активного (энергичные движения всеми лапами) и пассивного (слабые гребки задними лапами) плавания, а также иммобилизации — неподвижности животного.

4. Для оценки способности крыс к обучению использована модель пищедобывателыюго условного рефлекса в У-образном лабиринте и условного рефлекса активного избегания (УРАИ).

5. Порог болевой чувствительности определяли в тесте «tail-flick» по времени отдергивания хвоста при помещении его в сосуд с нагретой до 55° водой. Измерения проводились 4 раза с интервалом 10 минут (каждое измерение — не дольше 30 секунд).

6. Оценка судорожной готовности крыс проводилась с использованием однократного подкожного введения пороговой дозы коразола (60 мг/кг веса) в течение 30 минут от момента введения. Для формирования модели фармакологического киндлинга коразол вводился в подпороговой дозе (30 мг/кг) ежедневно в течение 21 дня.

7. Алкоголизация животных проводилась по методике свободного выбора между 15%-ным этанолом и водой (Буров, Ведерникова, 1985) в индивидуальных клетках с регистрацией количества этанола и воды, выпитые каждой крысой за сутки.

8. Чувствительность к наркотической дозе этанола оценивалась по продолжительности бокового положения после внутрибрюшинного введения 25%-ного раствора этанола из расчета 4,5 г чистого этанола на ю- веса (СЬигЬ е1 а1., 1979).

Биохимические исследования.

Для определения активности АДГ (исследования осуществлены при сотрудничестве с Ин-том Биомедхимии сотрудниками А. В. Пшежецким и Т.А.Москвитиной) мозг, печень и надпочечники после иммунизации дважды гомогенизировались в 0.1 М фосфатном буфере- рН

7.4. Гомогенаты центрифугировались при 10 5000g в течение 1.5 часов. Осадки отбрасывались, супернатанты фильтровались и использовались для определения активности АДГ. Активность АДГ определялась спектрофотометрически в 8 мМ ИАБН и 60 мМ этанола (Ое^е1 й а1., 1996), используя спектрофотометр Shimad7. ii Ц/-240 с термостатированной кюветой при 37 °C (340 пш). Концентрация белка определялась по Лоури.

Для определения активности эндогенных изоферментов МАО (Т.А.Москвитина) у контрольных и опытных крыс выделяли печень, сосуды и замораживали при I —20° С. Выделение митохондриальной фракции проводилось по общепринятой методике дифференциального центрифугирования из 10% гомогената. Осадок после центрифугирования при

§ несколько раз промывали 0,05 М К-Ыа фосфатным буфером, рН 7,4, хранили не более 3-х суток при г -20°С. Белок определяли по методу Лоури, активность МАО — радиометрически (модифицированный радиометрический метод определения активности аминооксидаз), используя в качестве субстратов для МАО, А и МАО Б, соответственно, серотонин (100 иМ, С14, 4 Кю/моль) и фенилэтиламин (50 иМ, С14,5 Кю/моль).

В опытах по -- определению общей активности МАО (Е.В.Шмальгаузен) активность измеряли по накоплению окрашенного продукта (450нм) в ходе окисления п-нитрофенилэтиламина при 25° С. Реакционная смесь содержала 950 мкл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, 25 мг тритона Х-100, 50 мкл суспензии митохондрий и 0,1 мМ п-нитрофенилэтиламина. Изменение поглощения на 0,01 соответствует образованию 0,33 нмоль N114+.

Уровень моноаминов и их метаболитов (в сотрудничестве с М. Л. Цирениной и Е. И. Мельником, а также И. И. Афанасьевым и Э.А.Андяржановой) определялся с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией.

Для статистической обработки полученных данных использовали U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента, двухфакторный дисперсионный анализ из пакета статистических программ «Stadia», а также пакет статистических компьютерных программ Excel и Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Физиологические и биохимические эффекты иммунизации к фермептам — алкогольдегидрогеназе и ацетальдегиддегидрогеназе.

1.1. Иммунизация к алкогольдегидрогеназе.

Алкогольдегидрогеназа (АДГ) является одним из ключевых ферментов метаболизма этанола. В отличие от ацетальдегиддегидрогеназы (АцДГ), ингибирование которой широко используется для формирования аверсии к этанолу, роль АДГ в биохимических механизмах формирования влечения к алкоголю далеко не ясна.

Мы использовали активную иммунизацию беспородных белых крыс и крыс линии Wistar гетерологичной лошадиной АДГ (первый изозим АДГ -АДГ1) для направленной и избирательной регуляции активности. АДГ у подопытных животных in vivo с последующей оценкой разных форм поведения (и, прежде: всего, алкогольной мотивации) и активности эндогенной АДГ. С целью выявления оптимальных условий для реализации действия гетерологичной АДГ были использованы различные методы иммунизации и экспериментальные режимы.

Было обнаружено, что иммунизация интактных крыс (трехкратное введение 150 мкг АДГ в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) с интервалом 7−10 дней) на достаточно длительный период (до 2 месяцев) подавляет у крыс формирование экспериментального алкоголизма в ситуации свободного предпочтения воды и 15%-ного раствора этанола (Рис.1).

Активная иммунизация предварительно иммунизированных крыс эффективна только в том случае, когда она проводится на фоне временного лишения крыс алкоголя (по аналогии с обычными клиническими условиями лечения алкоголизма). Менее сильные и продолжительные эффекты были отмечены при снижении дозы иммуногена до 50 и 25 мкг на животное.

Рис. 1. Среднесуточное потребление 15%-ного раствора этанола (мл) крысами после иммунизации против лошадиной АДГ, проводимой до начала алкоголизации (а) и после предварительной алкоголизации и на фоне депривации (б). Период депривации и иммунизации соответствует пробелу на кривых. Различия между опытными (сплошная линия) и контрольными группами в период с 1-го по 170-й дни (а) и с 1-го по 70-й (б) дни статистически значимы (р < 0,001).

Следует подчеркнуть, что подавление алкогольной мотивации имело место в сопоставлении с двумя типами контрольных животных — интактными (введение физраствора) и инъецированными адъювантом Фрейнда.

Степень выраженности антиалкогольного эффекта иммунизации сильно зависит от исходной алкогольной мотивации подопытных крыс, которая может значительно варьировать как среди крыс разных экспериментальных серий, так и в пределах одной серии. Поэтому, для получения стабильного и наиболее выраженного эффекта иммунизации и возможного выявления метаболических особенностей, обуславливающих различную выраженность подавления алкогольной мотивации, были проанализированы несколько других линий крыс — August, MR (Maudsley reactive) и MNRA (Maudsley nonreactive). Согласно данным литературы крысы линии MNRA менее тревожны и обладают большей устойчивостью к неизбегаемому острому и хроническому стрессу по сравнению с крысами линии MR (Commissaris et al., 1996). У крыс MNRA больше чувствительность тормозных альфа-адренергических нейронов мозга, меньше содержание катехоламинов в структурах положительного подкрепления, а также ниже стресс-реактивность этой системы (Sara et al., 1993).

Сравнение линий крыс по количеству потребляемого этанола показало, что крысы линии MNRA потребляют больше 15%-ного раствора этанола по сравнению с остальными линиями, а также быстрее достигают высокого уровня среднесуточного потребления этанола. Результаты исследований с активной иммунизацией к АДГ показали, что наиболее стабильное и эффективное подавление алкогольной мотивации наблюдается именно у «многопьющих» крыс линии MNRA по сравнению с другими линиями (Рис. 2). сутки алкоголизации

Рис. 2. Потребление 15%-пого этанола крысами линии MNRA (в % к контролю) после иммунизации к АДГ. Различия между контролем и опытом статистически значимы при р< 0.005.

Иммунологический анализ (ELISA) свидетельствовал о наличии в сыворотке крови иммунизированных к АДГ лошади крыс устойчивого и значимого титра антител к этому ферменту (Рис.3). Эти антитела обладали значительной реактивностью по отношению к одной из изоформ АДГ печени крысы — АДГ-3 (соответствующей АДГ-1 человека). Способность антител крыс против АДГ реагировать с АДГ-3 печени крысы была продемонстрирована и методом иммуноблотинга. Титр антител к АДГ-2 печени крысы статистически значимо не отличался от контрольного уровня (М.Ф.Обухова, А.В.Пщежецкий).

Рис. .1 Гис. ч

Рис. 3. Титры антител в' сыворотках контрольных (светлые столбики) и иммунизированных АДГ (темные столбики) крыс: а — против АДГ печени лошади, б — АДГ-2, в — АДГ-3 печени крысы.

Рис. 4. Активность (ти на мг белка в супернатанте) различных АДГ-изозимов в тканях контрольных крыс (светлые столбики) и после иммунизации к лошадиной АДГ (темные столбики) — а — АДГ-3 в печени, б -АДГ-2 в печени, в — АДГ-1 в слизистой желудка, г — АДГ-2 в мозге.

Таким образом, показано, что активная иммунизация к гетерологичной АДГ вызывает длительную продукцию антител.

Исследование специфической активности этого фермента в тканях различных органов показало, что иммунизация крыс АДГ печени лошади не отражается на уровне активности изоферментов АДГ-1 в стенках желудка, а также АДГ-2 в печени и мозге. В то же время уровень активности АДГ-3 в печени иммунизированных крыс снижен практически в два раза по отношению к контролю (Рис.4).

Антиалкогольный эффект иммунизации против гетерологичной АДГ был подтвержден в опытах с пассивной иммунизацией алкоголизированных крыс. Внутривенное введение выделенных специфических антител против АДГ печени лошади вызывало такие же изменения в потреблении алкоголя, как после активной иммунизации, однако, продолжительность подавления была много меньше, около 2−3 суток.

Иммунная основа механизма подавления влечения к этанолу в опытах с активной иммунизацией к АДГ была продемонстрирована и в совместных опытах с Л. А. Ляпиной (лаб.крови каф. физиологии человека и животных) с переносом лейкоцитов. Для этого через 1 сут после внутривенного введения крысам АДГ из крови их извлекались лейкоциты и вводились внутривенно интактным крысам. Аналогичная операция без АДГ проводилась с контрольными крысами. Выбор срока извлечения лейкоцитов диктовался как общими соображениями о динамике иммунопоэза, гак и полученными данными о динамике элиминации АДГ из плазмы. Через 10 дней крысы, получившие лейкоциты от животных, у которых развивались начальные стадии иммунопоэза после введения АДГ, демонстрировали достоверное снижение уровня потребления этанола (Рис. 5). мл

Рис. 5. Среднесуточное потребление 15%-ного этанола (мл) крысами после внутривенной инъекции фракции лейкоцитов: 1 — от контрольных крыс- 2 — от крыс, получивших АДГ.

Высокий уровень иммуноспецифичности эффекта и отсутствие какой-либо взаимосвязи между энзиматической активностью АДГ в препаратах, используемых для иммунизации, и последующим подавлением алкогольной мотивации показан в исследованиях с иммунизацией крыс энзиматически неактивными фрагментами АДГ-1, известными как эпитопы АДГ (ОггеЬепзЫкоуа с1 а!., 1994), любезно предоставленными нам В. Н. Прозоровским.

Большое число эпитопов в молекуле АДГ (Уи-ЭДа! Но е1 а1., 1991) требовало выяснения вопроса о том, какой именно из них является ключевым для развития феномена подавления алкогольной мотивации.

Фракции антител против эпитопов АДГ 1−14, 93−115 и 265 276, полученные в исследованиях В. Н. Прозоровского, были использованы для пассивной иммунизации предварительно алкоголизированных крыс. Только антитела против эпитопа 265 276 вызывали значительное подавление алкогольной мотивации в течение 3 дней после введения. Поэтому, в дальнейших экспериментах с активной иммунизацией был использован эпитоп 265−276. Поскольку размер эпитопа АДГ 265−276 относительно невелик, для эффективной иммунизации был использован его ковалентный конъюгат с гемоцианином в качестве антигена-носителя. Иммунизация фрагментом АДГ 265−276 продемонстрировала значительное снижение уровня потребляемого этанола. Это свидетельствует о том, что АДГ 265 276 является эпитопом, ответственным за подавление алкогольной мотивации, вызываемой иммунизацией к целой молекуле АДГ.

Таким образом, все представленные выше данные указывают на иммунную основу длительного снижения алкогольной мотивации у крыс, иммунизированных гетерологичной лошадиной АДГ. Этот феномен, в принципе, согласуется с подавлением алкогольного влечения некоторыми препаратами, являющимися ингибиторами АДП, такими, например, как 4-метил-пиразол и метронидазол (Се<1егЬаит ег а1., 1982- 1№ге"?апс1,1982). Однако, иммунизация к АДГ обеспечивает гораздо более длительный и глубокий эффект. Механизм этого феномена мало изучен. При его рассмотрении выявляется ряд противоречий с современными представлениями о роли АДГ в алкогольной мотивации:

1) подавление АДГ-I у алкоголизированных животных должно выражаться в уменьшении образования ацетальдегида, который, как хорошо известно, является аверсивным фактором при потреблении этанола- следовательно, подавление АДГ-1 должно, напротив, увеличивать потребление этанола-

2) подавление АДГ-I активности в печени (основном органе, содержащем АДГ-I) у иммунизированных крыс показано, но степень торможения достаточно умеренна- вероятно, существуют какие-либо другие мишени для анти АДГ-антител.

Возможный ответ на эти вопросы заключен в гипотезе о существовании других форм участия АДГ-I в регуляции поведения, которые не связаны с образованием ацетальдегида. Имеется достаточно большое число публикаций, указывающих на участие АДГ-I в метаболизме ретиноидов (Napoli, 1999), стероидов (Gough et al., 1991) и биоаминов (Raskin et al., 1970- Tabakoff et al., 1970- Mardh et al., 1985- 1976- Consalvi et al., 1986- Doo-Hong Park et al., 1991). Среди регуляторных систем организма, связанных с потреблением этанола, биоамины являются одними из наиболее признанных регуляторов (Diamond et al., 1997).

Основным органом, содержащим АДГ-I, является печень. Но АДГ-I широко представлена и в других периферических органах, доступных для антител. Однако, лишь немногие из них могут рассматриваться как возможные участники в синтезе веществ, регулирующих алкогольную мотивацию в масштабах целого организма. Поэтому, мы сосредоточили внимание на эндокринных органах, которые могут реализовать быстрое и сильное влияние на поведение. Исходя из этого, мы решили исследовать надпочечники, как один из ведущих периферических эндокринных органов, синтезирующих биоамины и содержащих значительное количество АДГ-I (Julia et al., 1987- Estonius et al., 1996).

Изменения активности АДГ-I в надпочечниках и печени иммунизированных к АДГ и контрольных крыс (выполнено Т.А.Москвитиной) представлены в табл.1. В соответствии с литературными данными активность АДГ-1 в надпочечниках намного меньше, чем в печени. Однако, как показывают результаты экспериментов, степень подавления АДГ после иммунизации намного выше, чем в печени, — практически полная (более чем в 50 раз, принимая во внимание максимальную чувствительность определения фермента).

Таблица

Активность АДГ в печени и надпочечниках контрольных крыс и после иммунизации АДГ-1 печени лошади.

Активность АДГ (пМ/т^пйп) % к

Органы контрольные крысы иммунизированные крысы контролю

Печень 512,2+67,1 281,7+73,7 55+

Надпочечники 31,8 ± 15,

Развиваемое представление о том, что роль АДП в формировании влечения к этанолу непосредственно не сопряжена с метаболизмом этанола, а более вероятно участие АДГ в метаболизме нейромедиаторов и гормонов, подкрепляется биохимическими данными об изменении уровня ряда биоаминов в плазме крови и мозгу белых крыс (Рис.6).

Рис. 6. Содержание биоаминов в плазме и мозге крыс (% к контролю) после введения АДГ. * - р < 0,05- ** - р < 0,01.

Однократное внутривенное введение 150 мкг АДГ I без адъюванта существенно снижало уровень серотонина в плазме крови и мозге и норадреналина в плазме крови.

1.2. Иммунизация к ацетальдегиддегидрогеиазе.

Ацетальдегидцегидрогеназа (АцДГ) обеспечивает снижение концентрации ацетальдегида, и подавление активности АцДГ, ведущее к накоплению последнего, должно снижать влечение к алкоголю. Именно этот эффект лежит в основе действия таких фармакологических средств, как тетурам и его аналоги, которые подавляют активность апетальдегиддегидрогеназы (АцДГ) и повышают таким образом уровень ацетальдегида, образующегося при окислении экзогенного этанола. Ацетальдегид вызывает тяжелые субъективные ощущения и индуцирует аверсию к этанолу опосредованно, формируя негативный рефлекс на прием алкоголя. Иммунизация к АцДГ встречает дополнительные препятствия — главный изозим АцДГ находится внутри митохондрий, доля АцДГ в цитоплазме клеток сравнительно невелика. Воздействие антител на митохондриальные ферменты возможно, по-видимому, лишь на стадии сборки митохондрий и синтеза их компонентов.

В наших исследованиях показано, что иммунизация крыс разными дозами гетерологичной дрожжевой АцДГ сопровождается формированием антител к АцДГ и снижением влечения крыс к этанолу, но этот эффект был менее значительным и менее продолжительным, чем в опытах с иммунизацией к АДП. Иммунизация крыс к двум ферментам одновременно (АДГ и АцДГ) вызывала более значительное и длительное (до 2 месяцев) уменьшение потребления этанола, чем иммунизация к АцДГ. Трактовка этих результатов представляется более простой по сравнению с аналогичными данными для АДГ. В этом случае вероятны повышение уровня ацетальдегида и его аверсивное действие. Тем не менее, и здесь нельзя исключить роль АцДГ в других метаболических процессах. Учитывая мягкость режима иммунизации к АцДГ, трудно предполагать значительное подавление активности фермента, основная ацетальдегид-расщепляющая форма которой локализована в митохондриях.

1.3. Влияние иммунизации к АДГ на поведение крыс.

Влияние иммунизации к АДГ на алкогольную мотивацию является следствием и/или спутником изменений других высших функций мозга. Действие аутоантител к АДГ1 на алкогольную мотивацию и вообще на функции мозга может осуществляться именно через непрямые, косвенные влияния, так как в самом мозге АДГ1 отсутствует и можно лишь допустить миграцию биорегуляторов через ГЭБ при изменении их уровня вне мозга.

Изучение психо-эмоционалыюго статуса крыс, иммунизированных АДГ, выявило следующие моменты. В большинстве случаев у иммунизированных крыс, как интактных, так и предварительно алкоголизированных, отмечено повышение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности.

Использование теста Порсолта для оценки возможной поведенческой депрессии в условиях неизбегаемого плавания показало, что иммунизация крыс против лошадиной АДГ I в разные сроки после ее начала статистически значимо снижает время иммобилизации животных, причем эффективны все исследованные дозы иммуногена — 25, 50 и 150 мкг на крысу. Как видно (Рис. 7), иммунизация 50 мкг АДГ более чем в два раза снижает время иммобилизации по сравнению с контрольной группой животных (р<0.01), а увеличение доза антигена до 150 мкг увеличивает эти различия почти в 4.5 раза (р<0.005), т. е. эффект дозозависимый.

Аналогичный эффект наблюдается и при иммунизации предварительно длительное время (5−6 месяцев) алкоголизированных крыс.

Время, с Ш

Рис. 7. Время иммобилизации (в тесте Порсолта) у контрольных (1) и иммунизированных 50 (2) и 150 мкг (3) АДГ крыс. *- р < 0,01- **- р< 0,005.

Позитивные эффекты иммунизации отмечены и при формировании у иммунизированных крыс условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением.

В тесте этанолового наркоза (при введении наркотической дозы 25%-ного раствора этанола) отмечено увеличение продолжительности сна в 1,5 — 2 раза как после активной иммунизации нативных крыс АДГ, так и при однократном введении АДГ (р<0.01). Иммунизация предварительно алкоголизированных крыс не приводит к изменениям продолжительности сна в среднем по группе, но процент «короткоспящих» животных в опытной группе значительно меньше, чем в контрольной алкоголизированной группе (р<0.05). Полученные факты могут быть следствием снижения активности эндогенной АДГ печени у иммунизированных крыс.

Таким образом, показано, что иммунизация крыс ферментами метаболизма этанола и, прежде всего, АДГ сопровождается образованием аутоантител к этим ферментам, снижением активности АДГ в печени и надпочечниках иммунизированных крыс и вызывает длительное снижение процесса формирования экспериментального алкоголизма.

Отсутствие негативных побочных эффектов и даже некоторое улучшение показателей поведения при иммунизации белых крыс к АДГ и его эффективность в плане алкогольной мотивации дает основание для разработки метода иммунокоррекции тяжелых случаев алкоголизма у людей. По степени гетерологичности, различиям последовательностей составляющих аминокислот АДГ1 крысы, лошади и человека близки друг к другу.

Однако, этот подход встречал зйачительное затруднение для использования в клинике — применяемый в эксперименте адъювант Фрейнда не разрешен Минздравом для применения на людях.

Проводимые нами исследования с использованием других адъювантов, таких как вакцина БЦЖ, оксид алюминия, гуанилмюрамил дипептид, свидетельствовали о меньшем антиалкогольном эффекте по сравнению с адъювантом Фрейнда.

В последних исследованиях мы использовали новый иммуномодулятор полиоксидоний (созданный в Ин-те иммунологии Минздрава РФ) — сополимер N-окиси 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазина бромида, который в настоящее время с успехом применятся в клинике. Антиалкогольный эффект при иммунизации крыс к АДГ вместе с полиоксидонием по своей эффективности не уступает аналогичной процедуре с адъювантом Фрейнда.

Кроме того, на основании полученных данных был предложен еще один подход для иммунокоррекции алкогольной мотивации. Известно, что хроническое потребление алкоголя приводит к модификации различных белков за счет образования ацетальдегид-аддуктов (Lin, Lumeng, 1990, Worrall et all, 1994). Наиболее уязвимыми мишенями такого связывания являются АДГ и АцДГ, в непосредственной близости от которых находится образующийся ацетальдегид. Вследствие такой модификации они могут приобретать аутоиммуногенные свойства и вызывать образование аутоантител. Однако без иммуностимуляции, вследствие низкой общей иммунореактивности больного алкоголизмом, подобная аутоиммунизация выражена очень слабо. Повышение иммунного статуса организма различными иммуйомодуляторами на стадии алкоголизма, когда можно ожидать появления иммуномодифицированных АДГ и АцДГ, с целью усиления собственного образования антител к ферментам обмена этанола — АДГ и АцДГ могло бы привести к снижению алкогольной мотивации, как в случае с иммунизацией к АДГ.