Нейрофармакологическое изучение оригинального ноотропного и нейропротективного дипептида ноопепт на моделях болезни Альцгеймера

Актуальность проблемы. Спорадическая болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее значимой причиной старческого слабоумия. Каждые 5 лет после 65-летнего возраста частота заболевания БА удваивается. В мире каждый год в ряды больных БА вливается новые 4.6 миллионов человек, а число больных, одномоментно страдающих БА в мире по данным современных статистик достигает 26 млн. человек (Ferri et al., 2005). Общая численность больных, страдающих БА, в России приближается к 1,4 млн. человек.

Болезнь Альцгеймера представляет собой сложный комплекс различных патогенных процессов, основными из которых являются накопление амилоидных бляшек и нейрофибрил, дефицит холинергической передачи, гибель нейронов, снижение количества ростовых факторов, нарушение когнитивных функций. Данные процессы тесно взаимосвязаны, развитие одного из них активизирует остальные. Совокупность патогенетических факторов БА характеризуется отношениями «замкнутого круга», в котором все факторы связаны закономерностями прямой и обратной связи (Longo et al, 2004; Гаврилова, 2004; Shelat et al., 2008). В связи с этим терапевтические воздействия на течение болезни Альцгеймера должны быть направлены на поиск возможностей разорвать этот замкнутый круг в максимальном количестве звеньев. Оптимальный сценарий терапии должен состоять в применении препаратов, влияющих одновременно на несколько основных патогенетических звеньев заболевания. Другим важным требованием к этим препаратам является отсутствие токсических эффектов при длительном превентивном применении. Это требование обусловлено необходимостью начала терапии на самых ранних этапах аккумуляции бета-амилоида, когда клинические проявления БА еще не диагностируются — на фазе мягкого когнитивного нарушения (МКН), представляющей собой промежуточную 4 стадию между «успешным» старением и деменцией, и обуславливающей повышенный риск развития деменции в течение ближайших 3−5 лет. Таким разнонаправленным действием в сочетании с низкой токсичностью могут обладать пептиды, как многокомпонентные регуляторы эндогенной природы. Известно, что практическое применение пептидов в качестве лекарственных препаратов затруднено ввиду их низкой биологической устойчивости. В качестве рациональных подходов к преодолению этих затруднений описаны такие приемы как использование активных фрагментов сложных пептидов, модификация их структуры, например введением D-изомеров аминокислот, стабилизирующих группировок (Каменский и др., 1989; Ашмарин и др. 1997; Мясоедов и др., 1999; Гривенников, 2006).

Оригинальный подход, развиваемый в НИИ Фармакологии РАМН в течение более чем двух десятилетий, может быть охарактеризован как дизайн коротких пептидов на основании имитации структуры непептидного нейротропного средства (Гудашева и др., 1985). В случае поиска веществ, улучшающих когнитивные функции, в качестве непептидного прототипа выбран стандартный ноотроп, пирацетам, а в качестве пептидноговазопрессин (АВП), точнее его основной метаболит, АВП 4−9. Из синтезированной на основании этого подхода серии производных ацилпролил-глицинов (Gudasheva et al., 1996, Seredenin et al 1995) был отобран для более подробного изучения этиловый эфир КГ-фенилацетил-Ь-пролилглицина соединение ГВС-111, ноопепт). Детальное экспериментальное изучение этого соединения выявило наличие у него совокупности ноотропных и нейропротективных эффектов (Ostrovskaya et al., 1994; Островская и др.,.

2002). Последующее клиническое изучение Ноопепта, выполненное в рамках.

I, II и III фаз, на больных с мягкими когнитивными нарушениями цереброваскулярного и посттравматического генеза, показало, что препарат оказывает отчетливое терапевтическое действие в отношении основных проявлений психоорганического синдрома, ослабляя когнитивные нарушения и оказывая анксиолитическое действие (Бочкарев и др., 2008; Незнамов и др., 5.

2007; Аведисова и др., 2007). Учитывая также тот факт, что ноопепт обладает многокомпонентным нейропротективным действием и усиливает выработку антител к Р-амилоиду (Ostrovskaya et al, 2007), представляет интерес изучить его эффект при более тяжелых формах когнитивной недостаточности, в частности при БА. Для оценки перспективности этих исследований необходимо исследовать эффект препарата на экспериментальных моделях БА. Известно, что моделирование спорадической БА осуществляется с помощью хирургических и инъекционных моделей (Van Dam, 2006), при том последняя группа является наиболее информативной (Степаничев и др., 2002).

Целью данного исследования являлось комплексное изучение поведенческих и нейрохимических эффектов ноопепта на следующих типах моделей БА: введение В-амиломдного пептида 25−35 в ядра Мейнерта, моделирование холинергического дефицита, введение диабетогенного токсина стрептозоцина.

Основные задачи исследования.

1. Изучение эффекта ноопепта при нарушениях когнитивных функций, вызванных введением амилоидного пептида 25−35 в ядра Мейнерта.

2. Изучение влияния ноопепта на обучаемость и память животных в условиях холинергического дефицита различного характера.

3. Сравнение эффектов диабетогенного токсина стрептозоцина при системном и внутримозговом введении.

4. Изучение когнитивных эффектов ноопепта на отобранной модели воздействия стрептозоцина.

5. Оценка влияния ноопепта на экспрессию нейротрофических факторов NGF и BDNF в коре головного мозга и гиппокампе у интактных животных и после воздействия стрептозоцина.

6. Исследование влияния ноопепта на выраженность оксидативного стресса в условиях стрептозоциновой модели.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что ноопепт ослабляет амнестическое действие амилоида 25−35, введенного в ядра Мейнерта. Этот эффект проявляется как в условиях профилактического введения, так и при введении на фоне развившейся патологии. В последнем случае он продемонстрирован в условиях введения препарата, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия, что свидетельствует о большом «терапевтическом окне» действия препарата на этой модели. При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта. На двух моделях пространственной ориентации и памяти (водный лабиринт и трехкамерная версия УРПИ) показано, что нарушение этих процессов более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов. Разработана модель хронического холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина (с последующей отменой) мышам линии BALB/c. Выполнено сравнительно изучение эффекта диабетогенного токсина стрептозоцина в условиях его системного (внутрибрюшинного) введения и введения в желудочки мозга. Поскольку при системном введения стрептозоцина развивается гипергликемия, а при его введении в желудочки мозга сохраняется нормальный уровень глюкозы в крови, модель внутрижелудочкого введения является предпочтительной. Показано, что стрептозоцин вызывает снижение экспрессии нейротрофических факторов в гиппокампе и накопление продукта перекисного окисления липидов — МДА. Установлено, что ноопепт ослабляет изученные метаболические эффекты стрептозоцина и сопутствующий поведенческий дефицит, проявляющийся в отношении долговременной памяти.

Научно-практическая значимость. Предложенные экспериментальные подходы расширяют методологию изучения веществ эффективных для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний. Совокупность 7 выявленных эффектов ноопепта, направленных на некоторые базовые механизмы БА, свидетельствует о целесообразности изучения этого препарата у больных Б, А (начальные и умеренные формы).

ГЛАВА 5. ВЫВОДЫ.

1. Выявлена способность Ноопепта противодействовать амнестическому эффекту нейротоксического гидрофобного С-терминального фрагмента (3- амилоида, А (3 25−35, вводимого в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта. Показано, что нормализующий эффект Ноопепта в отношении памяти проявляется как в условиях профилактического введения препарата, так и при введении на фоне развившейся патологии.

2. Установлено, что мыши линии BALB/c характеризуются худшей долговременной памятью, чем мыши C57BL/6J и что этот дефицит устраняется введением ноопепта. В опытах на мышах и крысах показано, что нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти более выражено в условиях блокады мускариновых, чем никотиновых рецепторов.

3. На разработанной модели хронического холинергического дефицита у мышей Balb/C, вызванного 14-ти дневным введением скополамина (с последующей отменой в течение 7 дней) продемонстрировано нарушение пространственной ориентации и долговременной памяти в тесте водного лабиринта. Ноопепт полностью устраняет вызываемые скополамином нарушения пространственной ориентации и памяти.

4. Когнитивный дефицит, вызванный системным введением диабетогенного токсина стрептозоцина, протекает на фоне гипергликемии. Нарушение памяти, развивающееся при его введении в боковые желудочки мозга, не сопровождается повышением содержания глюкозы в крови, что свидетельствует о центральном избирательном механизме возникающей при этом патологии. Ноопепт устраняет дефицит памяти в тесте УРПИ, вызванный введением стрептозоцина.

5. Стрептозоцин при внутрижелудочковом введении снижает экспрессию генов BDNF и NGF и вызывает накопление малонового диальдегида в тканях мозга. Ноопепт предотвращает окислительный стресс, вызванный стрептозоцином, и усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе.

6. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения клинических исследований ноопепта в качестве средства многофакторной терапии, предотвращающего переход мягких когнитивных нарушений (МКН) в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.

ГЛАВА 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В данной работе в соответсвии с поставленной целью было выполнено изучение эффекта ноопепта на моделях БА и выявлены следующие свойства данного препарата:

• способность оказывать противодействие негативным эффектам (3-амилоида 25−35, введенного в ядра Мейнерта, в отношении обучаемости и памяти,.

• возможность устранять негативные эффекты холиноблокаторов на когнитивные функции,.

• способность устранять амнестические эффекты стрептозоцина (введенного в желудочки мозга),.

• противодействовие снижению экспрессии нейротрофических факторов, вызванных стрептозоцином,.

•способность предотвращать развитие окислительного стресса, вызванного стрептозоцином.

Представляет интерес проанализировать характер патологии, воспроизводимой данными моделями и механизмы действия ноопепта в этих условиях.

Наиболее характерным признаком БА является образование в тканях мозга амилоидных бляшек (Harkany et al., 1998; Yamaguchi et al., 1998; Citron,.

2004). Известно, что основным компонентом таких бляшек при БА является амилоид (1−42) (Whitson et al., 1990). Его нейротоксические эффекты воспроизводятся введением гидрофобного С-терминального фрагмента, рамилоид 25−35 (Liao et al., 2007). Показано, что введение Ар 25−35 в базальные гиганто-клеточные ядра Мейнерта вызывает распространенные дегенеративные изменения нейронов во фронтальной коре и гиппокампе, проявляющиеся в различных формах когнитивных дефицитов (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998). Выполненное нами исследование подтвердило.

97 описанное ранее нарушение воспроизведения УРПИ в условиях билатерального введения Рамилоида 25−35 в базальные ядра Мейнерта у крыс. В предыдущих работах (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998) было показано, что нейродегенеративные изменения в ядре Мейнерта, фронтальной коре и гиппокампе начинают проявляться через 1 неделю после введения рамилоида 25−35 и длятся еще до 4-х недель. Этим морфологическим данным полностью соответствуют результаты наших поведенческих экспериментов, показавших, что при обучении через 4 недели после введения Рамилоида имеется резко выраженная амнезия в тесте УРПИ. Важным результатом проведенных исследований было обнаружение высокой эффективности ноопепта в условиях его профилактического введения. При этом следует отметить длительное «последействие» нормализующего эффекта ноопепта: интервал между окончанием введения препарата и тестированием сохранения памятного следа в тесте УРПИ составляет 24 дня. Несколько менее выраженный, но достаточно четкий нормализующий эффект ноопепта отмечен и в условиях лечебного введения ноопепта, начатого спустя 15 дней после нанесения повреждающего воздействия. Полученные факты свидетельствуют о том, что для действия ноопепта на данной модели характерна большая широта «терапевтического окна» .

Показано, что при введении Рамилоида 25−35 в гиганто-клеточные базальные ядра Мейнерта происходит уменьшение количества холинергических нейронов и снижается высвобождение ацетилхолина нейронами префронтальной коры и гиппокампа (Giovanelli et al., 1995; Harkany et al., 1998). В работах Сторожевой З. И. и соавторов было показано, что введение рамилоида в ядра Мейнерта ведет к угнетению активности холинацетилтранферазы (Storozheva et al., 2008). Ранее в экспериментах на изолированных нейронах виноградной улитки показано, что ноопепт в широком диапазоне концентраций (10″ 6 — 10″ 11 М) усиливает реакцию на микроионтофоретическое подведение ацетилхолина к нейрону. Поскольку ноопепт не влияет на активность ацетилхолинэстеразы, было высказано предположене, что его холино-позитивный эффект реализуется на постсинаптическом уровне. (Островская и др., 2002). Это действие препарата может быть одной из причин эффективности этого дипептида в отношении мнестического дефицита, вызванного введением р амилоида 25−35. В реализации этого эффекта, возможно, играет роль также и описанная ранее (Ostrovskaya et al., 2007) способность ноопепта усиливать выработку антител к Рамилоида 25−35.

Одним из важнейших функциональных расстройств, наблюдаемых при МКН и БА, является поражение холинергической системы мозга, которое приводит к развитию нарушения пространственной ориентации и памяти (Coyle et al., 1983; Lawrence and Sahakian, 1998; Tong and Hamel, 1999). Важно отметить, что выраженность этих нарушений коррелирует с тяжестью заболевания (Ritchie et al., 2004). В связи с наличием электрофизиологических доказательств холинопозитивного эффекта ноопепта представлялось целесообразным изучить его действие в отношении поведенческих нарушений, возникающих при дефиците холинергической системы различной степени выраженности.

Для оценки влияния препарата на слабовыраженные формы холинергической недостаточности было выполнено сравнение пространственной ориентации и памяти в тесте водного лабиринта Мориса у двух линий мышей (BALB/c и C57BL/6J) с различной активностью холинергической системы. Известно, что мыши линии BALB/c характеризуются меньшим содержанием ацетилхолина в тканях мозга (в частности в коре больших полушарий и гиппокампе), чем мыши линии C57BL/6J (Ingram and Corfman, 1980). При сравнении обучаемости и долговременной памяти у мышей линии BALB/c и C57BL/6J показано, что у мышей первой линии имеется дефицит долговременной памяти, который устраняется введением ноопепта.

Но поскольку исследуемые линии мышей отличаются не только по развитию холинергической системы, но также и по большому числу признаков, затрагивающих мембранные рецепторы, гены, кодирующие белки, отвечающие за обмен различных медиаторов, и гены белков, участвующих в формировании мозга (Ingram and Corfman, 1980), для более избирательного моделирования нарушения холинергической системы были проведены эксперименты с острой и хронической блокадой холинергических рецепторов. В экспериментах на мышах использовалась линия BALB/c, исходя из данных о большей выраженности эффекта нопепта у мышей этой линии в экспериментах, проведенных в водном лабиринте. Было показано, что ноопепт способен полностью устранять дефицит пространственной памяти, вызванный введением как блокатора М-холинорецепторов, скополамина, так и блокатора Н-холинорецепторов, мекамиламина. Следует подчеркнуть, что в данной серии экспериментов скополамин в большей степени, чем мекамиламин, повлиял на пространственный компонент обучения. Полученные данные о более выраженном влиянии М-холиноблокаторов на пространственную память согласуются с данными других исследователей (Maubach, 2003).

Близкие данные были получены при изучении эффектов Ни М-холиноблокаторов мекамиламина и скополамина крысам, тестируемым в 3-х камерной модели УРПИ, позволяющей оценить пространственный компонент памяти животного. Показано, что введение обоих холиноблокаторов привело к существенному нарушению долговременной памяти.

Таким образом, при введении крысам блокаторов Ми Н-холинорецепторов наблюдается сходный эффект, но препарат ноопепт был более эффективен в отношении нарушения пространственного компонента памяти, вызванного скополамином, чем мекамиламином.

Ранее была разработана модель, основанная на хроническом введении скополамина крысам (Островская и др., 2001). В данной работе была.

100 поставлена задача разработки модели хронического холинергического дефицита на других объектах-мышах. Хроническое введение скополамина проводилось в специально разработанном нами режиме: 14-ти дневное введение с последующей 7-дневной отменой вызывало у мышей отчетливое амнестическое действие, которое было нами выявлено в тесте водного лабиринта. Ранее в опытах на крысах было показано, что непосредственно после окончания длительного введения скополамина имеет место не ухудшение, а даже улучшение воспроизведения памятного следа. Предполагается, что вследствие длительной блокады холинергических рецепторов происходит включение механизмов обратной связи: развивается начальное повышение плотности и аффинности холинорецепторов (Loullis et al 1983). Развитие амнезии через несколько дней после отмены скополамина рассматривается как следствие холинергического дефицита в результате ускоренного связывания наличного ацетилхолина. Амнезия, вызванная длительным воздействием скополамина, рассматривается как модель ускоренного старения, а продемонстрированная эффективность холинопозитивных веществ (амиридин и такрин) (Буров и др., 1991), подтверждает информативность данной модели. В выполненных ранее исследованиях в качестве теста для выявления когнитивного дефицита использовался тест УРПИ (Буров и др., 1991; Островская и др., 2002) и тест УРАИ (Гарибова и др., 2005). Нами впервые применялся тест водного лабиринта в качестве показателя состояния когнитивных функций в условиях хронической блокады мускаринового типа холинорецепторов. Результаты наших экспериментов не только подтвердили возможность моделирования аналогичного холинергического дефицита на мышах, но и демонстрировали высокую эффективность ноопепта на этой модели. Таким образом, ноопепт способен противодействовать развитию нарушения когнитивных функций при различных нарушениях холинергической системы, в том числе и при нарушениях, носящих длительный характер, которые могут рассматриваться как модель БА.

В литературе описаны попытки лечения БА с помощью холинопозитивных препаратов. Как правило, для этого применялись селективные ингибиторы ацетилхолиноэстеразы, которые замедляют деактивацию ацетилхолина после его выхода в синаптическую щель (Roberson and Mucke, 2006). Позитивное действие на холинергическую систему ноопепта не исчерпывается изменением чувствительности нейронов к ацетилхолину. Основной причиной дисфункции холинергической системы при БА является не снижение синтеза ацетилхолина, а гибель нейронов данной системы. В связи с этим особое значение имеет наличие у ноопепта выраженных нейропротекторных свойств (Chen et al., 2000; Островская и др., 2002; Pealsman et al., 2003).

Деградация нейронов холинергической системы тесно связана с еще одним патогенетическим механизмом БА — снижением количества в тканях мозга, в особенности гиппокампа, нейротрофических факторов (Siegel and Chauhan, 2000). Транспорт таких важных факторов, как NGF и BDNF осуществляется по нейронам холинергической системы, поэтому деградация этих нейронов влечет за собой развитие дефицита ростовых факторов. С другой стороны, недостаток ростовых факторов провоцирует гибель нейронов холинергической системы (Tuszynski., 2002; Longo et al., 2004). Таким образом, недостаток ростовых факторов приводит к процессу гибели нейронов, развивающемуся по принципу положительной обратной связи.

В настоящее время имеются данные о способности ноотропного препарата пептидной природы семакса усиливать экспрессию двух основных нейроторфических факторов NGF и BDNF в гиппокампе и, в меньшей степени, в коре больших полушарий (Shadrina et al., 2001). Учитывая эти данные, а также исходя из выявленной способности ноопепта (Чепкова и др., 1995) облегчать длительную. гиппокампальную потенциацию электрофизиологический эквивалент памяти (Lynch, 2004), представляло интерес изучить возможное влияние ноопепта на экспрессию этих факторов.

Принимая во внимание тот факт, что как ноотропные, так и.

102 нейропротективные эффекты реализуются в условиях длительного введения препаратов, специальный интерес представляло изучение этого эффекта ноопепта в условиях однократного и длительного введения.

Выполненные эксперименты показали, что однократное введение ноопепта способно существенно стимулировать выработку обоих нейроторфических факторов в гиппокампе уже через 45 минут после введения. Экспрессия этих факторов в коре больших полушарий так же повысилась, но незначительно. В условиях хронического введения это повышение синтеза факторов в гиппокампе сохранялось, притом усиление экспрессии мРНК NGF выражено заметнее, чем BDNF.

Имеются данные о том, что дефицит нейротрофических факторов именно в гиппокампе играет ведущую роль в развитии когнитивной недостаточности и что признаки гипотрофии гиппокампа имеют место не только при развитой БА, но уже и на этапе мягких когнитивных расстройств, предшествующих переходу в это заболевание (Peterson et al., 2001). Исходя из этого, можно предположить у данного препарата способность поддерживать нормальный уровень нейротрофических факторов при МКН, и снижать дефицит данных факторов при БА, замедляя, таким образом, необратимые процессы деградации нейронов. Однако для более корректного исследования способности препарата повышать синтез нейротрофических факторов необходимо оценить его действие не на интактных животных, а на животных с поражением ЦНС, сходным с БА.

Обе описанные выше модели БА обладают одним важным недостатком.

— они моделируют только одно определенное проявление заболевания, токсическое действие р-амилоида и холинергический дефицит соответственно. Известно, что при таких многофакторных заболеваниях, каким является БА, все патогенные процессы тесно взаимосвязаны. Поэтому для разработки и тестирования препаратов, которые могут эффективно замедлять прогрессирование патологии при этом заболевании, необходимо использование экспериментальных моделей, наиболее полно.

103 воспроизводящих комплекс компонентов его патогенетических механизмов. В последнее время внимание исследователей начала привлекать модель спорадической БА, основанная на введении диабетогенного токсина стрептозоцина (2-Дезокси-2-(((метилнитрозоамин)карбонил)амино)-Бглюкопираноза).

При внутриже луд очковом введение стрептозоцина наблюдается:

• Образование амилоидных бляшек (Sharma et al., 2002; Lester-Coll et al. 2006),.

• Накопление нейрофибрилл (Sharma et al., 2002),.

• Гибель нейронов и клеток микроглии (Shoham et al., 2003),.

• Нарушение сигнального пути нейротрофических факторов (Salkovic-Petrisic et al., 2007),.

• Развитие оксидативного стресса (Lester-Coll et al. 2006),.

• Выраженная деградация холинергической системы мозга (Blokland and Jolles, 1993; Sonkusare et al., 2005),.

• Нарушение когнитивных способностей, в особенности пространственной памяти (Sonkusare et al., 2005).

Идея использования данного вещества для моделирования БА возникла на основании представлений о спорадической болезни Альцгеймера, как о заболевании, этиологически сходном с сахарным диабетом (Lester-Coll et al., 2006). Этими авторами сформулировано понятие о спорадической БА, как о диабете 3-го, мозгового, типа.

Приступая к разработке стрептозоциновой модели БА, мы исходили из того, что в литературе описано два типа воздействия стрептозоцинасистемное введение (Manschot et al., 2003) и введение в желудочки мозга (Sharma et al., 2002; Lester-Coll et al., 2006; Salkovic-Petrisic et al., 2007).

Наши исследования были начаты с использования модели с внутрибрюшным введением стрептозоцина (200 мг/кг, однократно). В тесте водного лабиринта было показано, что в этом случае происходит выраженное нарушение пространственной памяти у мышей. При этом введение ноопепта практически полностью нивелировало негативное действие стрептозоцина на пространственную память. После введения препарата у испытуемых животных отмечалось повышение уровня сахара (с 5±0.5 до 26±2.1 нмоль/мл), что согласуется с данными о диабетогенном действии стрептозоцина. При этом введение ноопепта не приводило к значимому снижению уровня глюкозы в крови. По всей видимости, ноопепт оказывает действие на когнитивные способности за счет воздействия непосредственно на процессы в тканях мозга, не связанных с изменением уровня глюкозы. Поскольку стрептозоцин при внутрибрюшинном введении не проникает через ГЭБ, для выявления эффектов, оказываемых препаратом на клетки мозга, был применен метод внутрижелудочкового введения препарата. Этот метод позволяет более точно воспроизводить комплекс биохимических изменений, происходящих в тканях мозга при БА (Lester-Coll et al., 2006; Salkovic-Petrisic et al., 2007).

Применяя метод введения стрептозоцина в желудочки мозга, мы показали, что выявленные изменения поведения и метаболизма мозговой ткани протекали на фоне нормального уровня сахара в крови (5,5 нмоль/мл). Это полностью соответствует представлениям о том, что стрептозоцин в условиях его внутрижелудочкового введения не оказывает системного влияния на функции поджелудочной железы и все эффекты этого воздействия реализуются на уровне головного мозга ЦНС. (Lester-Coll et al., 2006).

Используя метод УРПИ, мы показали, что введение стрептозоцина в желудочки мозга вызывает у крыс глубокие нарушения обучаемости и долговременной памяти при отставленном тестировании. В наших экспериментах введение крысам в желудочки мозга стрептозоцина приводило к снижению латентного периода захода в темный отсек, что свидетельствует об амнестическом эффекте этого токсина. У крыс,.

105 подвергшихся действию стрептозоцина и леченых ноопептом, латентный период захода в темный отсек был близок к значениям контрольной группы.

Как указывалось ранее, среди большого количества метаболических нарушений, сближающих модель внутрижелудочкого введения стрептозоцина с БА, ведущую роль играют дефицит нейротрофических факторов и оксидативный стресс, обусловленный нарушением энергетического обмена. В связи с этим в задачу нашего исследования входило изучение влияния стрептозоцина на эти показатели мозгового метаболизма и выявление эффекта ноопепта на указанные нарушения. На первом этапе исследования было необходимо подобрать условия, при которых снижение экспрессии ростовых факторов наиболее выражено. В серии экспериментов, в которой определение проводилось через 4 недели после введения стрептозоцина в желудочки мозга, в тканях гиппокампа отмечалось некоторое повышение экспрессии нейротрофических факторов. В то же время в экспериментах, в которой забой крыс осуществлялся через две недели после введения стрептозоцина в желудочки мозга, наблюдается снижение по сравнению с контрольной группой, экспрессии ростовых факторов в гиппокампе. Полученные нами данные о фазовом характере изменения экспрессии нейротрофических факторов в условиях внтрижелудочкового введения стрептозоцина находятся в полном соответствии с данными, описанными в статье Hellweg et. al., 1994, в которой также отмечалось первоначальное снижение экспрессии, сменяющееся ее повышением спустя 3−4 недели после введения стрептозоцина.

В связи с преобладанием литературных данных о том, что уже на ранних фазах БА и даже в предшествующем ей периоде мягких когнитивных нарушений имеет место снижение скорости синтеза нейротрофических факторов в гиппокампе, дальнейшие эксперименты были выполнены на модели двухнедельной версии эксперимента. Как следует из рис. 28, в группе животных, которым через 14 дней после стрептозоцина вводился ноопепт, имело место усиление экспрессии NGF в гиппокампе. Что касается.

106 экспрессии гена BDNF, его уровень доходил только до показателя пассивного контроля. Более низкая выраженность эффекта ноопепта в отношении экспрессии ростовых факторов в коре больших полушарий на стрептозоциновой модели согласуется с данными, полученными нами на интактных животных.

Таким образом, в данной работе показана способность ноопепта избирательно восстанавливать нарушенную стрептозоцином экспрессию генов NGF и BDNF в гиппокампе. В этих экспериментах был выявлен еще один очень интересный факт, данные изменения касались только гиппокампа, но не затрагивали кору головного мозга. Такое избирательное действие в отношении нейротрофических факторов гиппокампа хорошо согласуется с известными из литературы данными о том, что дефицит нейротрофических факторов уже на начальных фазах БА выражен именно в гиппокампе (Coyle et al., 1980).

Одним из важных механизмов гибели нейронов при БА, как и при синдроме Дауна является высокий уровень в тканях мозга активных форм кислорода и других свободнорадикальных молекул (Pratico, 2008). Ранее уже были получены данные о способности ноопепта противодействовать гибели клеток, обусловленной избытком свободных радикалов в культурах тканей, полученных от плодов с диагностированным синдромом Дауна (Pelsman et al., 2003).

Показано, что после введения стрептозоцина количество в тканях гиппокампа малонового диальдегида (МДА), образующегося при перекисном окислении липидов, существенно повышается. У животных, леченных ноопептом, содержание МДА было достоверно ниже группы активного контроля, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии ноопепта на стрептозоциновой модели БА.

Как следует из полученных результатов, ноопепт противодействует не только описанным метаболическим нарушениям, вызванным.

107 стрептозоцином, но также и поведенчскому эффекту этого воздействия — амнестическому эффекту в тесте УРПИ и нарушению пространственной ориентации и памяти в тесте водного лабиринта. Анализируя возможные механизмы нормализующего действия ноопепта в условиях данной модели, можно полагать, что он развивается за счет следующих выявленных ранее свойств этой молекулы: ноопепт усиливает экспрессию нейротрофических факторов в гиппокампе (Островская и др., 2008), подавляет перекисное окисление (Pealsman 2003), проявляет холиносенсибилизирующее действие (Островская и др., 2001), ослабляет высвобождение глютамата (Ус и др., 2006), и, наконец, вызывает усиление выработки антител к бета-амилоиду (Ostrovskaya et al., 2007). Таким образом, анализ совокупности перечисленных эффектов ноопепта позволяет заключить, что действие этого дипептида направлено на ключевые механизмы данной модели спорадической болезни Альцгеймера.

В целом полученные в настоящей работе данные свидетельствуют об эффективности изучаемого ноотропного и нейропротективного дипептида, ноопепта, на выбранных моделях БА, которые воспроизводят основные патогенетические механизмы этого заболевания.

В настоящее время можно считать сформировавшимся представление о мягком когнитивном снижении, (МКН) как промежуточной стадии между нормальным старением и начальной фазой болезни Альцгеймера. Известно, что уже на этапе МКН имеет место развитие целого ряда патоморфологических изменений в мозговой тканичасть из них отличается от картины БА чисто количественно (Belleville et al., 2007). Поскольку нельзя с полной уверенностью предсказать, перейдет ли данный больной из МКН в БА, в настоящее время применяется стратегия превентивиной терапии. Суть этой стратегии изображает рис. 32, где нижняя кривая отражает прогрессирование заболевания при отсутствии лечения, верхняя кривая — это идеальный сценарий терапии (пока, к сожалению отсутствующий), а промежуточные кривые отражают различные темпы замедления прогрессирования с помощью правильно подобранной терапии. о с о.

3 о с 3.

Cure.

Maintenance.

Symptomatic arid neuroprotective benefit Slowing of disease progression Symptomatic benefit Disease progression.

Time.

Рис. 32 Варианты динамики БА при различных видах терапии (Debby Van Dam, 2006).

Существуют некоторые объективные тесты, которые повышают вероятность правильного предсказания и своевременного начала превентивной терапии, в частности из биохимических маркеров наиболее информативным является присутствие у больного аполипротеина АроЕ4+. Препарат ноопепт был исследован в центре психического здоровья РАМН на 20 больных в возрасте от 50 до 80 лет с синдромом мягких когнитивных нарушений. К окончанию 3-х месячного курса лечения ноопептом положительный амнестический эффект отмечался у 70% больных, притом по 5-ти из 9-ти оценочных когнитивных шкал было достоверное улучшение. Кроме того было обнаружено, что клинический эффект ноопепта был выше у.

9-ти больных, которые имели генотип АроЕ4+, то есть относились к группе высокого риска по развитию БА в ближайшие 3−5 лет (Рис. 33).

1 г 1. Г г1г. 11−1 1 г1 г! 1 L. У.

J-/ J ч®- / У.

J? о*'.

Л.®- 1я группа ¦ 2я группа.

Рис. 33 Сравнение терапевтической эффективности ноопепта по разности средних показателей между тестовыми оценками к моменту окончания и до начала терапии у пациентов с АроЕ 4(-) (1 группа), и АроЕ 4(+) (2 группа) генотипами (цитировано по статье Гавриловой и соавт., 2008).

При рассмотрении полученных результатов в совокупности с выявленными ранее свойствами ноопепта, а также данными о низкой токсичности этого дипептида, обусловленной его способностью метабол изироваться до эндогенных веществ (циклопролилглицин и фенилуксуная кислота), можно заключить, что эту дипептидную молекулу следует рассматривать как препарат с множественными мишенями воздействия, так называемый multitarget drug. Полученные данные могут служить предпосылкой для проведения более масштабных исследований с длительным превентивным применением препарата у людей, страдающих МКН, с целью предотвращения их перехода в начальные и умеренные формы болезни Альцгеймера.