Получение и изучение квадром на модели гибридом к вирусу гриппа и пероксидазе

3.1 Актуальность проблемы.

Разработка и совфшенствование гибридомной технологии, и успехи, достигнутые в настоящее время в получении продуктов клеточных моноклонов, привели к созданию нового перспективного направления биотехнологии — конструирования бисайтшецифических моноклональных иммуноглобулинов методами клеточной инженерии. Этот тип антител оказался весьма перспективным для применения в различных областях иммунохимии, иммунодиагностики и иммунотерапии" что является предметом постоянных исследований, дискуссий и публикаций.

На основании данных молекулярной структуры иммуноглобулина основное различие бисайтшецифических МКА и «обычных» моноспецифических антител — моноклональных или сывороточных поликлональных, состоит в следующем. Молекулы «обычных» иммуноглобулинов имеют два или более идентичных по антигенной специфичности активных центра Бисайтспецифи-ческие МКА также имеют два или более активных сайта связывания, но их специфичность различнапервый из сайтов специфичен к одному антигену (антигенной детерминанте), второй — к другому. Это свойство делает их уникальным инструментом иммуноанализа и терапии, так как они могут служить «мостиком», например, между искомым антигеном и маркерной молекулой (фермент, флюорохром и т. п.) или клеткой-мишенью и эффектором киллинга (эффекторной клеткой организма или цитотоксическим соединением).

Имеются публикации, посвященные созданию таких моноклональных антител и перспективам их практического применения в иммунодиагностике и иммунотерапии различного рода патологий человека и животных Рядом авторов показано, что использование бисайтшецифических МКА в различных иммунологических и серолошческих вариантах анализа позволяет существенно упростить процедуру и сократить время постановки реакции, а также ликвидировать проблемы, связанные с синтезом и использованием коньюга-тов иммуноглобулинов с ферментными или флуоресцентными маркерами.

Хотя существует несколько способов получения антител с данными свойствами, наиболее целесообразным является использование методов клеточной инженерии — создание биологических систем-продуцентов (триом и.

Введение

6 квадром). Получение этих клеточных гибридов и на их основе бисайтспеци-фических МКА — задача существенно более проблемашчная, чем получение конвенциональных гибридом и МКА. Поэтому необходимо не только получать би-МКА к кошфетным объектам, но и совершенствовать методические приемы технологии их получения, учитывая неразвитость работ в этом направлении в России.

В настоящее время максимально ранняя этиологическая диагностика является важнейшим принципом контроля возникновения и распространения возбудителей инфекционных патологий. В последние года гфедпринимаются активные попытки создания новых систем иммуноферментного анализа Эти системы предназначены для надежного качественного и количественного определения вирусных антигенов в сложных многокомпонентных клинических образцах Методы иммуноанализа таких антигенов, где основным звеном аналитической тест-системы могли бы выступать бисайтспецифические моноклональные антитела, не описаны в литературе. В этой связи представлялось целесообразным получить эти антитела и изучить потенциальную пригодность их применения для иммуноанализа вирусного антигена на модели нуклеопротеяда вируса гриппа птиц типа А.

Этим обусловлен выбор цели настоящей работы.

3.2 Цель и задачи исследования.

Цель работы заключалась в получении клеток квадром, секреяирукяцих бисайтспецифические моноклональные иммуноглобулины к нуклеопротеиду вируса гриппа, А птиц и пероксидазе из корней хрена, и конструирования на их основе модельной тест-системы для иммуноферменгаой детекции вышеуказанного вирусного белка Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задами.

1. Получить мышиные гибридомы — продуценты моноклональных иммуноглобулинов к пероксидазе из корней хрена и изучить ряд иммунохи-мических характеристик этих антител.

2 На основе стабильных клеток клонов гибридом, секретарующих моноклональные антитела к нуклеопротеиду вируса гриппа, А птиц (гибри-дома 5С10) и пероксидазе из корней хрена (гибридомы, полученные в процессе выполнения данной работы), создать маркированные субклоны гибридом, дефектные по генам, кодирующим ферменты тимидинкиназу (ТК.

Введение

7 варианты) и шпоксаштш-гуанин-фосфорибоз*^^ (ГТФРТварианты).

3. Получить клоны клеток квадром, гфодуцирукжцие бисайтспеци-фические моноююнальные иммуноглобулину путем выполнения соматической гибридизации между клетками дефектных клонов гибридом.

4. Провести частичную хроматографическую очистку бисайтспе-цифических моноклоналшых иммуноглобулинов и изучить некоторые их иммунохимические характеристики.

5. Оптимизировать параметры применения бисайттецифических монокшнальных иммуноглобулинов в системе двухсайтового иммунофер-меншого определения нуклеопротеида вируса гриппа.

6. Сконструировать модельную тест-систему на основе бисайттецифических моноклональных иммуноглобулинов для выявления нуклеопротеида вируса гриппа птиц типа, А в биологическом материале и охарактеризовать ее в сравнительном аспекте с тест-системой на основе пероксидазного коньюгата МКА гибридомы 5С10.

3.3 Научная новизна.

Научная новизна работы заключается в получении следующих д анных в результате проведенных исследований.

Установлено, что в процессе селекции исходных родительских клеток гибридом по системе ЬМе1Мс1 имеет место образование клеток-мутантов, экшресхжрующих кодефектный фенотип (З-ВОи^в-АО11) с частотой встречаемости данного признака от 10″ 2 до 10'4.

Впфвые получены клетки клонов квадром, секретирующие бисайтспе-цифические моноклональные антитела к нуклеопротеиду вируса гриппа птиц типа, А и пероксидазе из корней хрена ГЪказано, что эш клетей продуцируют гибридные молекулы иммуноглобулинов, являющихся результатом рекомбинации Н-цепей мышиных 1§-£г1 и 1§?г2Ь, а рекомбинантные иммуног-лобулиновые молекулы сохраняют антигенную специфичность, свойственную родительским клонам.

Впервые сконструирована модельная тест-система на основе бисайт-шецифических моноклональных иммуноглобулинов для обнаружения нуклеопротеида вируса гриппа в биологических образцах. Показана возможность использования в таком иммуноанализе фермента низкой степени очи.

Введете 8 сиси, и отсутствия необходимости приготовления анштепьных коньюгатов. Установлено, что модельная тест-система энзимного иммуноанализа нуклео-протеида вируса гриппа на основе бисайтспецифических МКА не уступает по параметрам специфичности, чувствительности и воспроизводимости получаемых данных классическим вариантам иммуноферменшого анализа этого антигена.

3.4 Практическая ценность.

В ходе исследований адаптирован ряд методических приемов (селекция клеток квадромных клонов, метод частичной хроматографической очистки бигайтспецифических иммуноглобулинов на одном из антигенов, скрининг би-МКА в ^иЬ1е-апй§ еп-ИФ"А), которые могут бьпъ применены при проведении НИР в области гибридомной технологии и биотехнологии бисайтспецифических иммунореагентов для белков других вирусов.

По результатам экспериментальной части работы подготовлены «Методические рекомендации по клеточно-инженерному конструированию гибри-домных гибридом (квадром, триом) — продуцентов бисайтспецифических моноклональных иммуноглобулинов к деум различным антигенам на модели пероксидазы и нуклеопротеида вируса гриппа» .

Получены и охарактеризованы два кдана квадром, продуцирующих би-сайтспецифичесоше моноююнальные антитела к нуклеопротеиду вируса гриппа, А птиц и пероксидазе из корней хрена На основе этих моноклональных антител разработан непрямой твердофазный вариант энзимного иммуноанализа нуклеопротеида вируса гриппа, который может служить потенциальной моделью иммуноферменшого метода обнаружения вирусных белков с помощью бисайтспецифических моноклональных иммуноглобулинов.

3.5 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

1. Все полученные в ходе работы моноююнальные иммуноглобулины к пероксидазе из корней хрена, секретируемые гибридомами, демонстрируют избирательную антигенную специфичность. Они взаимодействуют только с группой катаонных изоэнзимов пероксидазы, связываясь как с линейными, так и конформационно зависимыми эпитопами. Некоторые из полученных антител способны частично ингибировать каталитическую активность фермента в жидкой фазе.

Введвтяе 9.

2. При проведении экспериментов по изоляции и характеристике маркированных субклонов гибридом, дефектных по генам, кодирующим ферменты тимидинкиназу (ТТС-варианты) и гш1оксаншн-гуаноаин-фосфорибо-зилгрансферазу (ГГФРТ-варианты) установлено следующее. В клонах гибридом высока инцидеитносгь (частота 10″ 3 — 10″ 5) клетокэкспрессмрующих НАТ^-фенотип. В процессе ступенчатой селекции исходных родительских клеток гибридом по системе Littiefield J. W в популяции HAT5 — клеток накапливаются клетЕси-мутанты, экспрессирующие кодефектный по обоим фе$>-меитам фенотип (частота 10″ -10) вне зависимости от того, какой из токсических аншюгов нуклеотидов используется для этой селекции на начальном этапе.

3. Результаты конструирования клеток квадром, секретирующих би-сайтсиецифические моноклинальные антитела к нуклеопротеиду вируса гриппа птиц типа, А и пероксндазе из корней хрена, показали следующее. V Клетки квадром одновременно продуцируют конвенциональные моноспецифические и гибридные бисайтспецифические молекулы иммуногаэбулинов. Последние, являясь результатом рекомбинации двух изотопов №цепей мышиных (IgGl и IgG2b) иммуноглобулинов, сохраняют в отношении каждого антигенсвязьюающего сайта специфичность исходных антител.

4. Сравнение свойств и эффективности применения модельной тест-системы на основе бисайтспецифических моноклоналшых иммуноглобулинов для обнаружения нуклеопротеида вируса гриппа птиц типа, А в биологических образцах с тест-системой на основе моноспецифических МКА показало следующее. Модельная тест-система энзимного иммуноанализа на основе бисайтспецифических МКА лишена недостатков классических вариантов ИФА и имеет следующие преимущества по сравнению с последними В новой тест-системе не используется пероксидазный коньюгат антител, поэтому тест-система более стабильна при хранении, при ее изготовлении не требуется выоокоочищенного препарата фермента, при применении нет надобности в контроле и титровании коньюгата.

3.6 Апробация результатов paoormi.

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных» (9−10 декабря, 1998 г.), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (16 апреля 1998 г. и 23 марта 1999 г.), совещаниях научных сотрудников лаборатории «Гибридомной Биотехно.

Введете 10 лэгии" ВНИИВВиМ (1997;1999) и на межлаборагорном совещании сотрудников ВНИИВВиМ (7 сентября, 1999).

3.7 Публикация результатов исследований.

По результатам теоретических и экспериментальных работ, выполненных по теме диссертации, опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 из них в центральных научных журналах.

3.8 Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 140 листах машинописного текста по общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (343 источника, в том числе 81 отечественные). Работа иллюстрирована 16 таблицами, 8 рисунками и дополнена приложениями.

7. Выводы.

7.1. Представленные препараты асцитных жидкостей клонов Bi-1F4 и Bi-1D12 содержат бисайтспецифические моноклональные антитела, одновременно взаимодействующие с NP-белком ВГП-А и пероксидазой.

7.2. Установлена принципиальная пригодность представленных бисайтспецифических моноклональных антител Bi-1F4 и Bi-1D12 для обнаружения NP-белка ВГП-А в антигенсодержащем материале.

8. Рекомендации.

Комиссия рекомендует разработчикам:

8.1. Получить. аффинно очищенные бисайтспецифические моноклональные антитела и оценить их пригодность как компонента иммуноферментных тест-систем для диагностики ГП-А;

8.2. Продолжить исследования в области биологического конструирования рекомбинантных молекул иммуноглобулинов.

Акт рассмотрен на Ученом совете ВНИИВВиМ, одобрен и рекомендован для утверждения директором института.

Председатель комиссиичлены комиссии.

Протокол заседания Ученого совета № ^ «г. Л.

Ученый секретарь (/у/7 /Федоров Г. П./.

Российская Академия С е л ь с к о х о з я й с т в е и и ы х // а у к Всероссийский НИИ Ветершшртй Вирусологии и Микробиологии.

ПО КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНОМУ КОНСТРУИРОВАНИЮ ГИБРИДОМНЫХ ГИБРИДОМ (КВАДРОМ, ТРИОМ) — ПРОДУЦЕНТОВ БИСАЙТСПЕЦИФИЧЕСКИХМОНОКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ К ДВУМ РАЗЛИЧНЫМ АНТИГЕНАМ НА МОДЕЛИ ПЕРОКСИДАЗЫ И НУКЛЕОПРОТЕИДА ВИРУСА ГРИППА.