Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом

В настоящее время одним из самых перспективных и развивающихся направлений в медицине являются клеточно-замещающие технологииклеточные трансплантации и тканевая инженерия. Эти технологии применяются для лечения заболеваний связанных с повреждением или дегенерацией различных типов тканей, например ожоги, инсульты, ишемии, травмы спинного мозга, нейродегенеративные болезнисиндромы Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Предполагается, что в качестве замещающего материала наиболее оптимальным будет использование стволовых клеток, то есть клеток способных дифференцироваться в клетки различных типов тканей.

Во избежание иммунных конфликтов для подобного рода трансплантаций наиболее целесообразно использовать аутологичные стволовые клетки человека. Поэтому в настоящий момент во всем мире проводится очень много исследований, связанных с поиском способов получения, культивирования и наращивания аутологичного донорского клеточного материала in vitro, изучением механизмов дифференцировки, способов создания специфичных тканевых трансплантатов для их дальнейшего использования в медицине.

Одной из главных проблем, связанных с культивированием стволовых клеток in vitro является то, что практически все первичные культуры клеток, получаемые из тканей взрослого человека имеют ограниченный пролиферативный потенциал и быстро теряют способность к дифференцировке.

В то же время, множество работ во всем мире, в том числе и в нашей лаборатории, показали, что введение в культивируемые клетки гена каталитического компонента теломеразы hTERT, восстанавливает теломеразную активность внутри клетки, стабилизирует теломерные участки хромосом и увеличивает время жизни клеток в культуре, позволяя получать иммортализованные клеточные линии. Полученные при этом теломеризованные клетки, как правило, сохраняют нормальные механизмы регуляции пролиферации.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения иммортализованных линий стволовых клеток при помощи введения гена каталитического компонента теломеразы и проследить каким образом может влиять экспрессия гена hTERT на способности теломеризованных клеток к дифференцировке.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Проблема концевой недорепликации, структура и функции теломер

С начала XX века в биологии доминировало мнение, что клетки многоклеточных организмов иммортальны, то есть способны к бесконечно долгой пролиферации. Этому способствовали успешные работы, авторы которых доказывали бессмертие клеток, культивируя их в течении долгого периода времени. Например, Каррель и его сотрудники (Carrel, 1912) культивировали фибробласты из сердца куриного эмбриона в течение 34 лет. Клетки асцитной опухоли культивировали в перитонеальных полостях крыс в течение многих лет (Вильсон, 1936).

Однако, наряду с такими успешными опытами, появлялось все больше и больше работ, сделанных в основном на клетках человека, авторы которых наблюдали плавное угасание пролиферации клеток в культуре. В 1961 г. Хейфлик опубликовал результаты своих многолетних наблюдений, указывавшие на закономерности ограничения пролиферации в его опытах (Hayflick and Moorhead, 1961). Оказалось, что культуры диплоидных фибробластов человека (ДФЧ) способны расти только более или менее определенное количество пересевов, порядка 50, после чего клетки дегенерируют.

Жизнь клеток в культуре была разделена Хейфликом на три фазы (рис.1): фаза I представляет собой становление популяции in vitro, фаза II — период последовательных пассажей и экспоненциального роста числа клеток, фаза III — фаза истощения пролиферативного потенциала. Длительность фазы I — это время, необходимое для образования первого сомкнутого монослоя, т. е. до первого субкультивирования. Продолжительность фазы II в течение, которого клетки стабильно делятся, определяется не временем, которое клетки провели в культуре, а числом произведенных удвоений популяции (УП). Для клеток человека, как было указано выше, это число составляет около 50УП. Максимально число УП, которое большинство соматических клеток может проделать в культуре, было названо «пределом Хейфлика». Важно иметь в виду, что приведенная цифра 50+/- 10 относится не к максимальному числу делений клетки в культуре, а к усредненному числу УП культивируемых клеток. Это число обычно определяет следующим простым, но далеко не точным способом. После того как клетки образуют монослой на дне культурального флакона, их рассаживают в два таких же флакона, когда дно этих флаконов заполнится, проводят следующий пересев также с уменьшением плотности клеток и так далее (Михельсон, 1984). Таким образом, между каждыми двумя пересевами (пассажами) число клеток удваивается, то есть в среднем каждая клетка делится при этом один раз. Между тем известно, что часть клеток гибнет при каждом пересевекроме того, не все клетки, пережившие пересев, делятся при каждом субкультивировании.

О Z 4- fi # /0 72 Яремя, /утес.

Рис. 1. Графическое изображение фаз пролиферации ЭФЧв культуре (согласно.

Hayflick, Moorhead, 1961).

Лассажи.

0 ГО 20 30 40 SO.

1−1-1−1 Г~р г.

Фаза Ж 1.

В конце фазы II время, необходимое для образования сомкнутого монослоя после каждого субкультивирования, постепенно увеличивается, митозов становится меньше, в клетках начинаются дегенеративные процессы.

Главным критерием вступления культуры клеток в фазу III является исчезновение митозов. Кроме того, наступление фазы III сопровождается накоплением цитоплазматических включений, укрупнением клеток и увеличением степени их распластывания. Следует отметить, что уменьшение числа митозов и вышеназванные дегенеративные изменения клеток в культуре происходят не вдруг, а нарастают постепенно, с течением времени. После прекращения делений, клетки еще некоторое время остаются метаболически активными, после чего неделящиеся клетки спонтанно дегенерируют, переживая в стационарных культурах, длительное время (Matsumura et al., 1979). Все попытки избежать фазы III путем изменения состава культуральной среды или условий культивирования не увенчались успехом.

Таким образом, после появления работ Хейфлика все клеточные культуры можно было разделить на две группы: с ограниченным пролиферативным потенциалом (смертные или мортальные) и бессмертные (иммортальные).

Помимо ограниченного пролиферативного потенциала, опыты Хейфлика показали, что в ряде клеток существует некий счетчик, обуславливающий верхний предел для количества деления для данной клетки. После того, как в общих чертах стали ясны механизмы синтеза ДНК, появилась гипотеза, предлагающая механизм работы такого счетчика. В 1971 г. А. М. Оловников предположил, что ДНК-полимераза не в состоянии полностью реплицировать линейную матрицу, поэтому реплика получается всегда короче в начальной ее части (Оловников, 1971), (рис. 2). Постепенное укорачивание ДНК (недорепликация) ограничивает пролиферативный потенциал клеток и может служить основой «счетчика» клеточных делений.

1 т.

3'7 5.

3'.

I Л.

3 lm ««.

5'.

3'.

Рис. 2. Схема маргипотомической редупликации ДНК (по Оловникову, 1971, с изменениями). а — молекула полимеразы, зачернен каталитический центр, 1 т —длина маргинотомии, т. е. расстояние от конца молекулы фермента до его активного центраЬ — матричная цепь, с — реплика. Стадии репликации: I — «посадка» фермента на край матрицы, II— дочерняя цепь со стороны 5 '-конца оказывается короче матрицы на 1 т.

Гипотеза Оловникова оставалась умозрительной, пока в 1985 г. Грейдер и Блекборн не обнаружили теломеразу. Выяснилось, что концы линейных хромосом простейшего Tetrahymena, образованы короткой, тандемно повторяющейся последовательностью ДНК (TTGGGG), которую синтезирует специальная РНК-зависимая обратная транскриптаза (теломераза), имеющая постоянно ассоциированную с ней РНК-матрицу (Greider and Blackburn, 1985).

Подавляющее большинство изученных на сегодня хромосом имеют на конце многократно повторяющуюся монотонную последовательность. Это так называемый теломерный повтор. Субъединицей повтора обычно бывает последовательность длиной от 5 до 8 нуклеотидов. Теломерный повтор — удивительно консервативная в эволюции структура (см. таблицу.

1). Хромосомы всех позвоночных оканчиваются последовательностью TTAGGG, повторенной сотни и тысячи раз (Meyne et al., 1990). Удивительно, но теломерная последовательность TTAGGG встречается также у некоторых представителей членистоногих, червей и даже трипаносом (см. таблицу 1). Очень похожие теломерные последовательности имеются у большинства растений TTTAGGG, у части насекомых TTAGG и нематод TTAGGC.

У многих видов теломерные последовательности встречаются не только на концах хромосом, но могут быть расположены и во внутренних областях хромосомы. Например, у китайского хомячка (Cricetulus griseus) в геноме имеется 18 районов теломерных повторов внутри хромосом. Они расположены перицентромерно, по длине значительно превосходя теломерные повторы на концах хромосом (Slijpcevic and Hande, 1999). Хотя обычно внутренние теломерные повторы локализованы в перицентромерных областях (Slijpcevic and Hande, 1999; Meyne et al., 1990, de la Sena et al., 1995), в некоторых случаях они локализуются в областях ядрышкового организатора или около него (Meyne et al., 1990, de la Sena et al., 1995; Salvadori et al., 1995; Abuin et al., 1996). Происхождение и функции внутренних повторов не ясны. Наиболее распространено мнение, что их появление связано с хромосомными перестройками и поэтому отражает эволюцию кариотипа (Ijdo et al., 1991; Vermeesch et al., 1996).

Длина теломерных повторов широко варьируется у различных организмов. У человека она составляет 10−15 T.n.H.(de Lange et al., 1990), у мышей длина теломер различна у разных видов: у вида Mus musculus она примерно равна 50 т.п.н, в то время как у вида Mus spretus — около 5 т.п.н. (de Lange, 1996).

Особые теломерные повторы, состоящие из очень крупных субъединиц (сотни и тысячи нуклеотидов) имеются у хирономид.

Chironomus), у некоторых лилейных (лук) и у ряда двукрылых (дрозофила).

Таблица 1. Разнообразие теломерной ДНК.

Структура субъединицы теломерного повтора Организм Ссылки.

TTAGGG Все позвоночные Physarum polycephalum Didimium iridis Trypanosoma brucei Два вида класса Polychaeta Некоторые муравьи Ракообразное Asellus aquaticus Meyne et al., 1989 Coren et al., 1991 Forney etal., 1987, Van der Ploeg et al., 1984 Jhaetal., 1995 Meyne et al., 1995 Pelliccia et al., 1994.

TTTAGGG Большинство растений: Arabidopsis thaliana, рожь, Кукуруза, ячмень, пшеница Werner etal., 1992.

TTAGG Большинство насекомых некоторые ракообразные Okasaki et al., 1993 Sahara et al., 1999.

TTAGGC Нематоды Caenorhabditis elegans Magnenat et al., 1999 Wicky etal., 1996.

TT (T/A)AGGG Томат Ganal etal., 1991.

TT (C/T)AGGG Plasmodium falciparum Blackburn, 1991.

TTGGGG Tetrahymena thermophila Blackburn, 1991.

TTTTGGGG Euplotes crassus Blackburn, 1991.

TTGCA Parascaris univalens Teschke et al., 1991.

G,.gA Dictyostelium discoideum Blackburn, 1991.

TG2.3(TG),.6 Saccharomyces cerevisiae Shampay et al., 1984.

TCTGGGTG и TCTGGG (TG) Saccharomyces castellii Cohn and Blackburn, 1995.

Повтор 26 нуклеотидов Saccharomyces kluyveri Cohn and Blackburn, 1995.

Повтор 53 нуклеотида Tetrahymena thermophila (митохондриальная ДНК) Morin and Cech, 1986.

Повтор 340 нуклеотидов Chironomus pallidivittatus Kamnert et al., 1998.

Повтор 350 нуклеотидов Chironomus tentans Kamnert et al., 1998.

Повтор 375 нуклеотидов Лук (Allium сера) и некоторые лилейные Pich and Schubert, 1998.

Повторы ретротранспозонов НеТ-А (~6 kb) и TART (-10 kb) Drosophila melanogaster Biessmanet al., 1990 Levis et al., 1993.

Теломеры играют важную роль в жизнедеятельности клеток: 1) Теломеры выполняю защитную функцию: они кэпируют концы линейных эукариотических хромосом и стабилизируют их. Когда хромосома разорвана или лишена полноценной теломеры, бестеломерные концы хромосом претерпевают либо слияние, либо деградацию (McClintock, 1941). Клетки реагируют на разорванные хромосомы или на укороченные теломеры как на поврежденную ДНК (McEachern and Blackburn, 1996). Таким образом, теломеры защищают концы хромосом от деградации, слияний и рекомбинационных процессов (McClintock, 1941). 2) Теломеры участвуют в процессе старения, связанной с проблемой недорепликации. У большинства прокариотических организмов не существуют проблемы недорепликации, так как их хромосомы кольцевые. Эукариоты выработали новое решение проблемы концевой недорепликации, при которой специализированные концевые структуры хромосом — теломерысодержат повторы, некоторые из которых теряются при каждом цикле репликации. Потеря этих последовательностей, в которой нет информации, содержащейся в генах, расположенных ниже, работает как буфер, защищающий эти гены, от потери при каждой репликации ДНК.

Особый интерес в структуре теломер представляет их самая дистальная часть. Двойная спираль ДНК не доходит до самого конца, 5'-цепь обрывается и остается одноцепочечный G-богатый участок. Это свойственно всем теломерам, содержащим теломерные повторы, начиная от простейших и до человека. Длина одноцепочечного 3' конца варьирует от 10−16 нуклеотидов у простейших (Oka et al., 1980; Klobutcher et al., 1981; Henderson and Blackburn, 1989), до нескольких сотен нуклеотидов у человека (Makarov et al., 1997). Стоит отметить, что свободный З'-конец имеется как в клетках с функционирующей теломеразой, так и без нее (Makarov et al., 1997). Поэтому его наличие невозможно объяснить деятельностью теломеразы.

Наличие одноцепочечного фрагмента на каждой теломере означает, что его формирование идет путем деградации 5'-конца. Совсем недавно показано, что длина одноцепочечного участка коррелирует со скоростью недорепликации (Huffman et al., 2000), что свидетельствует в пользу того, что деградация 5' конца не вносит заметного вклада в укорачивание теломер. И, наконец, показано, что длина З'-конца может меняться в процессе развития у растений: его длина различна в разных тканях (Riha et al., 2000).

Конформация одноцепочечного 3'-конца привлекает внимание исследователей, исходя из термодинамических особенностей последовательности, содержащей повторяющиеся кластеры GGG. Расчеты показывают, что такая последовательность может легко образовывать неканонические структуры (триплексы, квадруплексы). Реальным подтверждением возможности существования такой структуры явились опыты Де Ланж и сотр. (Griffith et al., 1999).

На основании анализа вероятности появления ковалентных сшивок между нитями ДНК была создана модель теломерных петель, (рис. 3).

ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ З'-КОНЕЦ ДНК.

3' 5.

ИЗБЫТОК TRF1 и TRF2.

СВЯЗЫВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ.

СВЯЗЫВАНИЕ TRF2.

Рис. 3. Схема строения теломеры согласно Griffith et al. (1999).

По этой модели свободный 3'-конец, в комплексе с белками вступает во взаимодействие с двойной спиралью теломерной ДНК и вытесняет одну из цепей (образуется тройной комплекс цепей ДНК). Вытесненная цепь образует D-loop (вытесненную петлю (D — displace)), а сама теломера при этом образует теломерную петлю (t-loop). По данным авторов, длина теломерной петли коррелирует с длиной теломер, измеренной I независимыми методами. Модель оставляет необъясненным, каким образом D-loop образуется именно в начале теломерной последовательности.

Одноцепочечная G-богатая теломерная последовательность способна образовывать внутрицепочечные и межмолекулярные квадруплексы. Разнообразные соединения, взаимодействующие с квадруплексами in vitro, стабилизирующие их, подавляют теломеразную активность (Mergny et al., 1999; Han and Hurley, 2000; Kerwin, 2000; Hurley et al., 2000), в том числе и в клетках (Izbicka et al., 1999). Обнаружен фермент гираза, специфически разрушающий квадруплексы (Sun et al., 1998). Мутации этой гиразы вызывают заболевание, носящее название синдром Блюма, характеризующееся целым спектром изменений, начиная от специфических хромосомных перестроек и заканчивая внешним видом больных. Существование таких белков доказывает, что ДНК в теломерах может иметь самую необычную конформацию и эта конформация существенным образом влияет на функционирование всей клетки.

II. Фермент теломераза, и ее функция в клетке.

Теломераза — это рибонуклеиновый фермент. РНК-компонент теломеразы содержит короткую матрицу, комплементарную одному повтору (часто матрица бывает длинней, чем один повтор) G-богатой цепи теломерной ДНК (Blasco et al., 1995).

Механизм действия теломеразы — повторное копирование матрицы, включающее этап элонгации, когда дезоксирибонуклеотиды последовательно добавляются к З'-концу G-богатой цепи теломеры и транслокации фермента на конец новообразованной цепи (рис. 4.) В результате действия теломеразы образуется достаточно длинный 3-конец, по которому затем достраивается комплементарная цепь. В итоге теломера становится длиннее. теломера этап присоединения нуклеотидов показаны желтым) к З'-концу тепомерной ДНК (показан синим).

5* в соответствии с матрицей (показана красным) hTR (ЭЛОНГАЦИЯ).

3' одноцепочечный G-богатый конец ДНК перемещение теломеразы иненный З'-конец теломерной ДНК ТРАНСЛОКАЦИЯ) повтор элонгации.

5*.

Рис. 4. Схема действия теломеразы, hTERTбелковый компонент, hTR —РНКкомпонент.

РНК-компонент теломеразы человека составляет 430 н. в длину, и экспрессируется в большинстве клеток человека, независимо от теломеразной активности (Feng et al., 1995, Avilion et al., 1996, Chen et al., 2000) (рис. 5.). Интересным фактом является то что, матричный район в мышиной РНК составляет всего 8 нуклеотидов, а в РНК человека 11 нуклеотидов, несмотря на то, что обе они кодируют одну и ту же последовательность. Таким образом, было выяснено, что матрица длинее чем один теломерный повтор (Blasco et al., 1995).

РНК-компоненты теломеразы из разных организмов довольно сильно отличаются, как по первичной структуре, таки по длине. Даже у таких эволюционно близких видов как мышь и человек гомология составляет всего 65% (Blasco et al., 1995). Тем не менее консервативность РНК довольно высока на уровне вторичной структуры (Romero and Blackburn, 1991). Относительно хорошо изучены вторичные структуры РНК теломеразы простейших (в основном тетрахимен) и позвоночных (Romero and Blackburn, 1991, Chen et al., 2000). На основе сравнительного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей и компьютерного моделирования укладки цепи этих РНК, была предложена схема их эволюции (Chen et al., 2000). Основными элементами этой структуры являются несколько шпилек и довольно протяженный одноцепочечный участок, содержащий матрицу для синтеза РНК.

Рис. 5. Вторичная структура РНК-компонента теломеразы человека (согласно.

Теломераза была обнаружена в большинстве исследованных видов эукариот, имеющих линейные хромосомы. В 1997 году были клонированы гены РНК-компонента теломеразы (Feng et al., 1997) и ген каталитической белковой субъединицы теломеразы человека (Nakamura et al., 1997, Meyerson et al., 1997). В конце этого же года удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток. Оказалось, что для этого.

Chen et al., 2000). достаточно присутствие двух компонентов — каталитического компонента теломеразы (hTERT) и РНК-компонента (hTR) (Weinrich et al., 1997).

В соответствии с теорией Оловникова, теломеразная активность (ТАК) должна присутствовать в клетках половой линии и раковых клетках. Действительно, теломераза активна в половых и в ряде стволовых клеток, но не активна в большинстве соматических клеток (Harley, 1991, Harley et al., 1990). На определенной стадии развития, приходящейся на ранний эмбриогенез, происходит выключение гена, теломеразы в подавляющем большинстве соматических клеток человека. Выключение теломеразного гена есть этап онтогенеза, совершающийся в определенный момент жизни организма и не во всех типах клеток. ТАК была обнаружена в некоторых соматических клетках костного мозга, лейкоцитах периферической крови, в Ти Влимфоцитах (Zhang et al., 1996, Weng et al., 1996., Igarashi and Sakaguchi, 1996), в семенниках, эпидермисе кожи и эпидермисе шейки матки (Pao et al., 1997, Kyo et al., 1997) в клетках нижней части крипт толстой кишки (Kuniyasu, 1997), в клетках эндометрия матки (Kyo et al., 1997, Saito et al., 1997). Все эти ткани характеризуются высокими темпами обновления. Важно отметить, что ТАК в пересчете на одну клетку в этих нормальных популяциях существенно ниже, чем в популяциях раковых клеток (Wright et al., 1996). Теломеразная активность детектируется у многих иммортальных клеточных культур, например, ТАК была обнаружена в экстрактах опухолевых иммортальных клеток человека линии HeLa (Morin, 1989), и затем еще в других опухолевых культурах. Было примерно подсчитано, что ТАК присутствует в 85% различных опухолевых клеток (Kim et al., 1994). Кроме того, оказалось, что в большинстве раковых клеток теломеры довольно короткие, обычно короче тех, которые имеют место в клетках тех тканей, из которых они возникли (Counter et al., 1992, Shay and Wright, 1996, Hastie et al., 1990).

Поскольку примерно 85% опухолей человека обладают теломеразной активностью, то можно утверждать, что активация теломеразы участвует в онкогенезе. Следовательно, увеличение надежности репрессии этого фермента должно резко уменьшать вероятность развития опухоли. Можно предположить, что особенности регуляции теломеразы у человека связаны с тем, что репрессия теломеразы имеет еще одну функцию — защиту от опухолей.

Если полагать, что клетки человека способны в среднем на 50 удвоений, то из одной клетки может образоваться 2−1050 клеток, которые будут весить около 1000 кг. Очевидно, что при весе опухоли в 1 т говорить о защите организма поздно. Однако, на самом деле, такой расчет неверен. Эпидемиологическая статистика позволила рассчитать, что в среднем для превращения нормальной клетки в опухолевую требуется от трех до семи независимых случайных событий (Альберте, 1994). Таким образом, при развитии опухоли происходит несколько этапов клонирования. Если положить, что в среднем частота мутаций 1 на 106 клеток, то каждое такое событие потребует примерно 20 генераций (220 ~ 106). Значит, для образования опухоли потребуется в среднем от 60 до 140 генераций. Как видно, ограничения в 50 удвоений вполне достаточно для остановки роста большинства опухолей на еще не диагностируемых стадиях. Кроме того, посылка о том, что клетка организма способна в среднем на 50 делений, сомнительна, поскольку к такому количеству делений способна только малая доля клеток. К сожалению, трудно установить пролиферативный потенциал отдельных клеток в составе организма. Опыты, проведенные в культуре клеток, свидетельствуют, что даже внутри одного клона клеток существует огромная гетерогенность клеток по пролиферативному потенциалу.

Частота спонтанной реактивации теломеразы в диплоидных фибробластах человека, трансформированных вирусом SV40, после прохождения ими дополнительных раундов репликации, составляет 3*10″ 7−5*10″ 8 (Shay and Wright, 1996). В нормальных^{трансформированных} фибробластах человека спонтанная реактивация теломеразы (иммортализация) настолько редка, что, подобные случаи невоспроизводимы. Столь низкая вероятность указывает на то, что, скорее всего, реактивация теломеразы требует как минимум двух мутационных событий.

Все воспроизводимые случаи иммортализации фибробластов человека в культуре происходят после того, как клетки пройдут дополнительные раунды репликации, а это значит, что реактивации теломеразы предшествует чрезмерное укорачивание теломер.

Возможной причиной увеличения вероятности реактивации теломеразы при чрезмерном укорачивании теломер является резкое увеличение генетической нестабильности хромосом с короткими теломерами.

Учитывая все вышесказанное, можно предположить (Егоров, 1997), что, в большинстве случаев, первым шагом при канцерогенезе является не реактивация теломеразы, но другие события, позволяющие клетке, прежде всего, получить селективное преимущество в росте. В пользу этой возможности свидетельствует также тот факт, что теломеры опухолевых клеток с реактивированной теломеразой почти всегда короче, чем теломеры из окружающей опухоль нормальной ткани.

Была показана возможность моделирования процесса опухолеобразования, при котором активация теломеразы не является первым событием. В присутствии азидотимидина или карбовира (ингибиторы обратных транскриптаз, воздействующие также и на теломеразу) спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши ведет к образованию клонов клеток без теломеразной активности (Yegorov et al., 1996).

Как уже указывалось выше, без активации теломеразы большинство опухолей не могло бы достигать стадий, опасных для здоровья. Можно поэтому полагать, что подавление теломеразной активности, начатое вовремя, могло бы помочь большинству онкологических больных.

В зависимости от вида опухоли можно ожидать, по крайней мере, два типа реакций опухолевых клеток на угнетение функции теломеразы. Если в клетках сохранены механизмы, способные останавливать пролиферацию при достижении теломерами некой малой длины, можно ожидать замедления пролиферации, укрупнения клеток, их перехода в состояние покоя и длительного переживания в этом состоянии. Если в клетках отсутствуют такие механизмы (исчезли в процессе онкогенеза), то действие препарата вызовет чрезмерное укорачивание теломер, за которым последует массированная гибель и многократное увеличение изменчивости оставшихся клеток. Повышенная изменчивость клеток может оказаться причиной появления устойчивости к препарату и увеличения злокачественности (Егоров, 1997). Это может ограничить применение таких препаратов.

Другим серьезным минусом антителомеразной терапии является относительно большой латентный период от момента начала лечения до наступления эффекта. Опыты по подавлению теломеразы в культуре клеток почти однозначно подтверждают это. Постоянная экспрессия антисмысловой конструкции против РНК-вого компонента теломеразы приводит к гибели клетки HeLa примерно через 25 удвоений популяции (УП) (Feng et al., 1995). Такая же процедура, проведенная с клетками злокачественной глиомы, приводит к частичной дифференцировке или апоптозу через 30 УП. Катехины зеленого чая, которые подавляют теломеразную активность в опухолевых клетках человека U-937 и НТ-29 в культуре, вызывали их старение через 35 и 60 УП, соответственно (Naasani et al., 1998). В работе Кондо и др. (Kondo et al., 1998b) был получен быстрый эффект: путем специфической активации РНКазы L вызывали деградацию теломеразной РНК в клетках злокачественной глиомы человекапри этом происходила быстрая индукция апоптоза.

Учитывая запаздывающую диагностику опухолей, эффект может быть менее значителен. Однако, принимая во внимание короткие опухолевые теломеры, можно ожидать, что подавление теломеразной активности окажет относительно быстрое действие.

III. Иммортализация клеток.

В конце 1997 г. после того как удалось реконструировать теломеразную активность в лизате клеток, следующим шагом было введение hTERT в клетки человека. Уже давно известно, что РНК-компонент экспрессируется в большинстве клеток человека независимо от теломеразной активности (Feng et al., 1995; Avilion et al., 1996). Поэтому после трансфекции клеток человека геном hTERT в них появилась теломеразная активность (Bodnar et al., 1998; Vaziri andBenchimol, 1998).

Введенная теломераза обладала способностью поддерживать длину теломер, пролиферация клеток перестала угасать со временем и, по всей видимости, клетки стали иммортальными. Опыты, проведенные другими группами ученых, подтвердили эти результаты (Nakayama et al., 1998). Полученные данные можно суммировать следующим образом.

Введение

теломеразы — «теломеризация» клеток — может приводить: к стабилизации длины теломер (результат должен зависеть, по крайней мере, от эффективности работы промотора — возможна частичная компенсация недорепликации, полная компенсация и даже удлинение теломер) и к приобретению клетками способности к неограниченному размножению. В результате «теломеризации» клетки не приобретают никаких признаков злокачественной трансформации (независимость роста от прикрепления к субстрату, от наличия сыворотки, от клеточной плотности, способность к росту в полужидком агаре), а кариотип клеток остается стабильным, как в культурах диплоидных фибробластов человека.

Таким образом, теломерная теория старения клеток получила всестороннее признание.

Для объяснения процессов иммортализации клеток человека в процессе канцерогенеза была предложена М1-М2 гипотеза (Wrigh et al., 1989; Shay et al., 1993) (рис. 6). Согласно этой гипотезе, для иммортализации клеткам необходимо преодолеть два различных механизма, ограничивающих пролиферацию. Первый механизм (Ml) включается, когда длина теломер достигает некоего минимума. Именно Ml ответственен за старение клеток в культуре (предел Хейфлика). иммортализация репрессия теломеразы] нормальный рост клеток| стабилизиция теломер г'' теломеразная активность опухоль.

Рис. 6. М1-М2 теория иммортализации клеток человека.

До сих пор не ясно, каким образом запускается Ml, поскольку длина теломер при этом составляет несколько тысяч нуклеотидов (Shay et al., 1993). По одной гипотезе, относительно короткие теломеры способны служить в качестве сигнала повреждения ДНК (Levy et al., 1992). По другой, — укорачивание теломер изменяет экспрессию регуляторных генов, локализованных в субтеломерном гетерохроматине (Wright and Shay, 1992а).

Белки различных опухолевых ДНК-содержащих вирусов способны увеличивать пролиферативный потенциал клеток человека, и тем самым, обходить (отменять) Ml. Этими свойствами обладают Т-антиген SV40, антигены Е6/Е7 вируса папилломы человека типа 16, антигены Е1а/Е1 В аденовируса типа 5 (Wright and Shay, 1992b).

Различными способами показано, что в реализации Ml участвуют белки р53 и pRb или pRb-подобная активность (Нага et al., 1991; Shay et al., 1991). В эпителиальных клетках человека Ml менее надежен, чем в фибробластахв его реализации не участвует pRb (Shay et al., 1993; Gollahon and Shay, 1996). Вероятно, пролиферативный блок при Ml опосредуется факторами типа р21, которые подавляют активность комплексов циклин/cdK (Sherr and Roberts, 1995).

Отмена Ml позволяет клеткам пролиферировать дополнительное время (для фибробластов человека — около 30−40 удвоений популяции), пока второй механизм (М2) не вызовет состояние кризиса. Кризис характеризуется процессом пролиферации, сопровождающимся массовой гибелью клеток. При этом размер популяции какое-то время может быть стабильным. С низкой вероятностью после кризиса могут возникнуть иммортальные клетки. Полагают, что кризис вызывается чрезмерным укорачиванием теломер, приводящим к их физическому исчезновению (Shay et al., 1993; Shay and Wright, 1996). В большинстве случаев единственным путем выхода из кризиса является реактивация теломеразы.

IV. Стволовые клетки в организме человека а) Понятие стволовости, стволовые клетки, мезенхималъные стволовые клетки.

Термин «стволовая клетка» (СК) был впервые введен в биологию А. А. Максимовым в 1908 году на съезде гематологического общества в Берлине. Исследуя процессы кроветворения, Максимов пришел к выводу, что во взрослом организме пожизненно сохраняются недифференцированные клетки способные превращаться в лимфоциты и другие специализированные клетки крови и соединительной ткани. Позже Максимов назвал открытые им клетки «стволовыми». Они получили название «стволовых», так как находятся в стволе воображаемого генеалогического дерева развития клетки, которое венчает крона из различных специализированных клеток.

Клетки называемые стволовыми, характеризуются рядом важных свойств, отвечающих их от остальных клеток организма. Прежде всего, стволовые клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, как правило, большим, чем у любой другой дифференцированной клетки. Обычно, деление стволовых клеток происходит ассиметрично (Терских и др., 2007а), когда одна из дочерних клеток сохраняет свои стволовые свойства, оставаясь в недифференцированном состоянии и тем самым, обеспечивая самоподдержание пула стволовых клеток, а другая дочерняя клетка способна к дифференцировке в с образованием более комитированных предшественником, прогениторных и прекурсорных клеток, а также дифференцированных клеток. Термин стволовая клетка, применяют чаще всего к клеткам способным к различным направлениям дифференцировки, то есть к клеткам в той или иной мере обладающим свойством пластичности. Тотипотентность — способность давать все возможные клеточные типы — характерно только для зиготы. Эмбриональные стволовые клетки, направления возможной дифференцировки которых неограниченно клеточными типами одного зародышевого листка или одной ткани, — плюрипотентны. Мультипотентность — возможность дифференцироваться в различные клеточные типы, характерные для одного зародышевого листка или одной ткани. Дальнейшие ограничения возможных направлений дифференцировки в пределах одной ткани, имеет место у более комитированных олиго трии бипотетных клеток-предшественников. Полагают, что стволовые клетки взрослого организма мультипотентны, они находятся в различных тканях и их мультипотентность в определенных условиях обеспечивает восполнение дифференцированных клеток, свойственных данной ткани и обуславливающих должное функционирование.

Основным вместилищем стволовых клеток взрослого организма является костный мозг. В нем различают два основных пула стволовых клеток, гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются клетками предшественниками для клеточных элементов крови, образование которых происходит в костном мозге. Источниками гемопоэтических стволовых клеток, являются костный мозг, периферическая и пуповинная кровь, а также ряд пренатальных органов. Наряду с гемопоэтическими стволовыми клетками, костный мозг также содержит большое количество клеток, окружающих гемопоэтические клетки. К ним относятся эндотелиальные клетки, фибробласты, адипоциты, стромальные клетки костного мозга. Все эти клеточные элементы создают микроокружение для гемопоэтических клеток, оказывающее регуляторные эффекты на пролиферацию и дифференцировку ГСК (Терских и др., 2007b). В свою очередь, среди клеток стромы костного мозга выделяют немногочисленную популяцию клеток, которые не только играют важную роль в гемопоэзе, но и в определенных условиях способны к дифференцировке в различные клеточные типы. Они являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также обладают высоким пролиферативным потенциалом, то есть обладают всеми характеристиками стволовых клеток. Эти клетки называются мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), или костно-мозговыми стромальными клетками, а также — в некоторых источниках — мезенхимальными прогениторными клетками (Minguell et al., 2001). MCK впервые были выделены, А .Я. Фриденштейном и описаны как колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф), способные к дифференцировке в остеобласты, хондробласты и адипоциты (Friedenstein et al., 1976). Позже для MCK были показаны другие возможные направления дифференцировки. Ключевым этапом выделения популяции МСК является их адгезия к субстрату. В многочисленных работах показано, что локализация МСК не ограничивается костных мозгом (Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002; Roufosse et al., 2004; Wagner et al., 2005; Da Silva Meirelles et al., 2006), и они могут быть выделены из стромы различных органов и из периферической крови (Zvaifler et al., 2000; Kuznetsov et al., 2001). Следует отметить, что помимо ГСК и МСК во взрослом организме существуют специализированные и согласно ряду исследователей — более ограниченые в своем дифференцировочном потенциале, тканеспецифичные стволовые клетки, обладающие различным дифференцировочным потенциалом. Так, нейральные стволовые клетки, фактически мультипотентны, а дифференцировочный потенциал некоторых тканеспецифичных «стволовых клеток» ограничиваются только одним-двумя направлениями дифференцировки. Вопрос об ограниченных тканеспецифических стволовых клеток не является однозначным и согласно ряду работ, эти клетки способны к дифференцировке не только в клеточные типы характерные для ткани в которой они локализуются, но и к так называемой транс-дифференцировке (Clarke and Frisen, 2001).

Одним из нерешенных вопросов биологии МСК является их иммунофенотипическая характеристика, поскольку на сегодняшний день не определен маркер или набор маркеров, который бы наиболее полно и специфически характеризовал мезенхимальные стромальные клетки предшественники, в том числе костно-мозгового происхождения, и коррелировал бы с их способностью к длительной пролиферации и самоподдержанию, а также к определенной степени пластичности. Так, охарактеризованные по широкому списку маркеров, очищенные популяции МСК не отличались от культур клеток полученных простой адгезией из более чем одной колонии, а мультипотентные линии МСК, каждая из которых была получена из одной клетки, тем не менее характеризовались неодинаковыми паттернами экспрессируемых маркеров, которые к тому же изменялись в течение времени культивирования МСК (Fibbe, 2002; Bianco et al., 2001). Таким образом, в дополнении к неспецифичности фенотипических характеристик МСК, они также могут изменяться в ответ на сигналы, получаемые от их микроокружения in vitro и in vivo (Bianco et al., 2001). В настоящее время, разными лабораториями проведен большой объем работы по определению спектра маркеров, присутствующих на МСК.

В большинстве исследований показано, что для мезенхимальных стволовых клеток человека, мышей и крыс не характерна экспрессия маркеров, свойственных гемопоэтическим стволовым клеткам. Это относится к маркерам CD4 (экспрессируется на тимоцитах и Т-хелперах, корецептор Т-хелперов и лиганд МНС II), CDllb (экспрессируется на моноцитах, макрофагах и естественных киллерах, лиганд ICAM-I и iC3b), CD34 (ранний маркер гемопоэтических стволовых клеток, может обнаруживаться на эндотелии капилляров), CD43 (экспрессируется лейкоцитами, за исключением В-лимфоцитов, лиганд ICAM-I), CD45 (тирозинфосфатаза участвующая в передаче сигнала от Т-клеточного рецептора, панлейкоцитарный антиген), CD117 (c-kit, рецептор фактора стволовых клеток является маркером кроветворных предшественников), CD31 (также называемый RECAM-1, обнаруживается на моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах и эндотелии) (Zuk et al., 2002; Lee et al., 2003; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002; Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002;

Pittenger et al., 1999; Conget and Minguell, 1999; Javazon et al., 2001; Da Silva Meirelles et al., 2006; Kolf et al., 2007).

Обычно на негемопоэтических прогениторных клетках из костного мозга, обладающих клоногенностью, идентифицируется маркер Stro-1 (Bianco et al., 2001, Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002). Экспрессия этого маркера может теряться при длительном культивировании, однако неизвестно каким образом эта потеря сказывается на МСК с точки зрения сохранения их свойств (Kolf et al., 2007). Также, характеристикой МСК является взаимодействие их с антителами к SH-2 — одному из эпитопов рецептора ТФР-[3 эндоглина (CD105), а также с антителами к SH-3 и SH-4 -различным эпитопам мембран-связанной экто-5'-нуклеотидазы (CD-73), — не реагирующими с гемопоэтическими клетками, остеобластами и остеоцитами (Barry and Murphy, 2004; Kolf et al., 2007). Маркеры CD105 и CD73 используются для идентификации МСК в большом количестве работ (Zuk et al., 2002; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002; Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002, — Pittenger et al., 1999; Conget and Minguell, 1999).

Также в ряде исследований на МСК определялись: CD71 (рецептор к трансферрину, экспрессируется активированными лейкоцитами), CD90 (Thy-1, экспрессируется тимоцитами и предшественниками Т-лимфоцитов, участвует в рециркуляции и адгезии), CD13 (металлопротеиназа, экспрессируется на макрофагах и моноцитах), CD44 (выполняет селектиноподобные функции и взаимодействует с межклеточным матриксом и эндотелием сосудов) (Zuk et al., 2002; Wagner et al., 2005; Wexler et al., 2002, Minguell et al., 2001; Fibbe, 2002; Lee et al., 2003; Pittenger et al., 1999; Kolf et al., 2007; Da Silva Meirelles, et al., 2006).

Таким образом, МСК экспрессируют большое количество молекул адгезии, обуславливающих их способность к связыванию с белками внеклеточного матрикса и рядом клеток, что указывает на функциональную вовлеченность МСК в межклеточные взаимодействия.

Эти функции соответствуют костномозговой локализации, возможной миграции и последующему хоумингу этих клеток в ряд органов и тканей.

Известно, что МСК обладают рядом черт фибробластов, а также имеют некоторые характеристики, свойственные миобластам и эндотелиальным клеткам. Так, они экспрессируют белки внеклеточного матрикса, некоторые из которых характерны для фибробластов, например коллагены I, III, IV, V, VI типов, фибронектин, ламинин, а также протеогликаны (Prockop, 1997; Minguell et al., 2001; Conget and Minguell, 1999).

Изучение пластичности мезенхимальных стволовых клеток взрослого организма представляет собой огромный интерес. В большом количестве работ показана способность костномозговых МСК направляться по наиболее очевидным, учитывая их проихсождение, путям дифференцировки — остеобластном и хондробластном как in vitro, так и in vivo (Caplan, 1994; Prockop, 1997). Доказательством способности этих клеток к остеогенной дифференцировке in vitro является увеличение степени экспрессии щелочной фосфатазы, образование клеточных агрегатов — узелков и минерализации внеклеточного матрикса в среде, что было показано для МСК человека и многих видов животных (Jaiswal et al., 1997. Pittenger et al., 1999. Kadiyala et al., 1997; Fibbe 2002; Bariy and Murphy, 2004; Панюхин и др., 2008). Также предсказуемым направлением дифференцировки МСК является их способность формировать адипоциты, что было продемонстрировано в большом количестве работы. Наиболее очевидным доказательством адипогенеза, является накопление в МСК липидных капель, сливающихся с течением времени в более крупные капли (Pittenger et al., 1999; Barry and Murphy, 2004; Fibbe, 2002; Bianco et al., 2001; Dennis et al., 1999).

Также, в ряде экспериментов была показана возможность дифференцировки МСК человека в эндотелий, в миогенном направлении, в кардиомиоциты in vitro (Oswald et al., 2004; Wakitani et al., 1995; Makino et al., 1999). б) Стволовые клетки жировой ткани.

Впервые метод выделения клеток из жировой ткани был описан в 1960;х годах: используя комбинацию протеолитического расщепления и дифференциального центрифугирования удалось разделить зрелые адипоциты от более плотной клеточной фракции, которую назвали стромально-сосудистая фракция (ССФ) (Rodbell, 1966; Rodbell and Jones, 1966). ССФ гетерогенна и представлена клетками крови, фибробластами, перицитами, эндотелиальными клетками и преадипоцитами. На конечном этапе выделения проводили селекцию клеток по адгезии к пластику. Позднее получили культуры из ССФ и показали, что клетки ССФ способны дифференцироваться в зрелые адипоциты (Hauner et al., 1989; Hauner et al., 1988; Poznanski et al., 1973; Van Den Berg et al., 1998). В 2001r в работе Zuk с соавторами было показано, что клетки, полученные из жировой ткани человека, обладают множественными потенциями дифференцировки и способны дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и миогенном направлениях in vitro, что предполагает наличие в ССФ жировой ткани не только преадипоцитов, но и мультипотентных стволовых клеток (СК) (Zuk et al., 2006; Zuk et al., 2002; Zuk et al., 2001).

Морфологически свежевыделенная фракция стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) гетерогенна и содержит фибробластоподобные, эндотелиальные, гладкомышечные клетки и макрофаги. С использованием проточной цитометрии было показано, что содержание контаминирующих клеток (эндотелиальные и гладкомышечные клетки) составляет 5−20% от всей популяции СКЖТ. При культивировании количество этих клеток уменьшается, при этом остается гомогенная фибробластоподобная популяция СКЖТ, также как и в случае культивирования мезенхимных стволовых клеток (МСК) костного мозга. Остальные 80% популяции СКЖТ, как и МСК, экспрессируют виментин и маркер AS02 (Zuk et al., 2006).

При культивировании в стандартных условиях СКЖТ имеют фибробластоподобную морфологию. Состав среды культивирования и плотность посева культуры влияют на дифференцировку СКЖТ. Так, большее количество адипоцитов можно получить при культивировании в среде DMEM и при низкой плотности посева, по сравнению со средой а-МЕМ, однако среда а-МЕМ наиболее эффективна для остеогенной дифференцировки (Lee et al., 2004). Более того, была показана дифференциальная экспрессия 441 гена в зависимости от среды культивирования (Dicker et al., 2005). Контакт с пластиком и время посева на пластик также может влиять на экспрессию генов поверхностных молекул (Nakagami et al., 2006).

В настоящее время иммунофенотип поверхности СКЖТ исследован разными независимыми лабораторными группами (Aust et al., 2004; Case et al., 2005; De Ugarte et al., 2003; Gronthos et al., 2001; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Nakagami et al., 2005; Safford and Rice, 2005; Williams et al., 1994; Yoshimura et al., 2006; Young et al., 1992; Zuk et al., 2002). В ряде работы было показано, что профиль экспрессии поверхностных молекул зависит от состояния клеток в культуре (Gimble et al., 2007; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Schaffler and Bushier, 2007).

В культуре СКЖТ экспрессируют белки адгезии, рецепторные молекулы, белки цитоскелета и внеклеточного матрикса, белки, связанные с фенотипом стромальных клеток. Классические стромальные маркеры (CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166) присутствуют только на 0.8%-54% клеток ССФ. При пассировании происходит селекция клеток, и стромальные маркеры присутствуют уже на 98% клеток. Такие изменения паттерна экспрессии характерны также и для МСК (Pittenger et al., 1999; Zuk et al., 2002).

Сравнительный анализ профилей экспрессии поверхностных маркеров в культурах клеток, выделенных из жировой ткани и костного мозга, показал их схожесть. Обе популяции экспрессируют CD 13, CD29, CD4, CD58, CD90 (Thyl), CD105, CD166, CD73 (SH3), STRO-1. Не выявлена экспрессия CD3, CD4, CDllc, CD14, CD15, CD16, CD19, CD31, CD33, CD38, CD45, CD56, CD62P, CD104, CD144 (Aust et al., 2004; Case et al., 2005; De Ugarte et al., 2003; Gronthos et al., 2001; Katz et al., 2005; Mcintosh et al., 2006; Mitchell et al., 2006; Nakagami et al., 2005; Safford and Rice, 2005; Williams et al., 1994; Yoshimura et al., 2006; Young et al., 1992; Zuk et al., 2002).

Стволовые клетки жировой ткани способны дифференцироваться в адипоциты, миоциты, остеоциты, хонроциты (Dicker et al., 2005; Zuk et al., 2002; Zuk et al., 2001; Shi et al., 2005; Owen et al., 1990; Cheng et al., 1994; Erickson et al., 2002; Huang et al., 2004; Lin et al., 2005; Mizuno et al., 2002; Rodriguez et al., 2005; Parker and Katz, 2006; Cao et al., 2005). Кроме того, в некоторых работах было показана возможность СКЖТ дифференцироваться не только в клетки мезодермального происхождения, но и например, в нейроны, кардиомиоциты, гепатоциты, эндокринные панкреатические и эндотелиальные клетки (Zuk et al., 2006; Lin et al., 2006; Betre et al., 2006). в) Нейралъные стволовые клетки.

Представления о том, что в зрелом мозге млекопитающих на протяжении всей жизни происходит нейрогенез с образованием новых нервных клеток, только недавно приобрели широкое распространение, хотя экспериментальные данные, подтверждающие генерацию новых нейронов, накапливались на протяжении всего XX столетия. С развитием авторадиографического метода появилась возможность выявлять пролиферирующие клетки, а также исследовать миграцию и судьбу их потомков. Таким образом, исследования с использованием авторадиографического метода помогли подтвердить существование областей мозга, в которых в норме сохраняется пролиферативная активность клеток и происходит генерация новых нейронов на протяжении всей жизни млекопитающих (Altman, 1962; Altman, 1963; Altman, 1969; Altman and Das, 1965; Bayer, 1983; Kaplan and Hinds, 1977; Kaplan and Bell, 1983). В дальнейшем эти исследования были подтверждены и развиты с применением новых методов выявления делящихся клеток, таких как мечение бромодезоксиуридином — маркером S-фазы клеточного цикла, с последующим выявлением его методами иммуногистохимии (Corotto et al., 1993; Doetsch et al., 1999; Palmer et al., 2000).

Первоначально были получены и в дальнейшем неоднократно подтверждены данные о том, что в боковой стенке, а именно в передней части субвентрикулярной зоны (СВЗ), боковых желудочков зрелого мозга крыс существует популяция пролиферирующих клеток, и происходит постоянная генерация клеток нейральных предшественников, которые затем мигрируют по ростральному миграционному пути, образованному клетками продольно ориентированной глии, в обонятельную луковицу, где они дифференцируются во вставочные нейроны (Altman, 1969; Bayer et al., 1983; Corotto et al., 1993, Lois and Alvarez-Buylla, 1994, Thomas et al., 1996). Другой областью постнатального нейрогенеза является зубчатая извилина гиппокампа как у грызунов (Altman and Das, 1965; Kaplan and Bell, 1983; Bayer et al., 1982; Cameron et al., 1993a), так и у приматов (Kornack and Rakic, 1999), включая человека (Eriksson et al., 1998). Нейральные клетки-предшественники зубчатой извилины гиппокампа взрослого мозга локализованы в субгранулярной зоне, мигрируют и дифференцируются в нейроны и глию гранулярного слоя (Cameron et al., 1993а).

Данные о том, что нейрогенез происходит на протяжении всей жизни млекопитающих, ставят вопрос о существовании популяции специализированных — так называемых стволовых клеток мозга или нейральных стволовых клеток (НСК), которые по аналогии со стволовыми клетками, поддерживающими гематопоэз, способны к самовоспроизведению (т.е. к поддержанию своей популяции на протяжении всей жизни животного) и обладают мультипотентным статусом (т.е. их потомки дифференцируются во все клеточные фенотипы ЦНС).

Одним из подходов к решению данного вопроса служило культивирование клеток, выделенных из различных областей зрелого мозга. Так впервые, клетки взрослого мозга, способные генерировать три основных клеточных фенотипа ЦНС, были выделены из образцов тканей стриатума мыши (Reynolds and Weiss, 1992). Однако эти клетки были названы прогениторными клетками (progenitor cells) или клетками-предшественниками, поскольку для них не было показано свойство самовоспроизведения, характерное для стволовых клеток. Такие клетки-предшественники, дающие начало трем основным клеточным фенотипам ЦНС, были выделены из различных отделов зрелого головного, а также спинного мозга: из СВЗ мыши (Lois and Alvarez-Buylla, 1993), крысы (Palmer et al., 1995) и человека (Kukekov et al, 1999) — из зубчатой извилины гиппокампа крысы (Palmer et al., 1995) и человека (Kukekov et al., 1999) — из обонятельной луковицы человека (Pagano et al., 2000) и мыши (Gritti et al., 2002) — из спинного мозга мыши (Weiss et al., 1996). Кроме этого клетки-предшественники были выделены из тканей уже мертвого мозга. Так в нескольких работах культивировали клетки, выделенные спустя несколько часов после смерти: из СВЗ и спинного мозга мыши (Laywell et al., 1999), из обонятельной луковицы человека (Roisen et al., 2001), из СВЗ и гиппокампа человека (Palmer et al., 2001).

Показанная в этих работах мультипотентность выделенных клеток, а также возможность долгого культивирования с наращиванием общего количества клеток позволила авторам полагать, что среди популяции клеток-предшественников существуют стволовые клетки. Кроме того, в этих работах было установлено, что клетки, дающие начало нейронам, глии и олигодендроглии, экспрессируют белок промежуточных филаментов — нестин. Ранее его экспрессия была показа для нейроэктодермальных стволовых клеток (Lendahl et al., 1990), отсюда и название белка: NeuroEctodermal STem cells — NESTIN. Впоследствии нестин стал служить основным молекулярным маркером НСК, хотя позже было показано, что он также экспрессируется в стволовых клетках некоторых других тканей (Alvarez-Buylla and Garcia-Verdugo, 2002).

Признание факта существования стволовых клеток ЦНС, поддерживающих нейрогенез на протяжении всей жизни млекопитающих, имеет не только фундаментально-научное значение, но и потенциальную перспективу практического применения стволовых клеток и знаний, полученных при исследовании их свойств, в разработке подходов к лечению нейродегенеративных заболеваний и травм головного и спинного мозга. С одной стороны, возможность сохранения и размножения стволовых клеток в культуре in vitro может быть использована для получения клеточного материала пригодного для нейротрансплантации. С другой стороны, выяснение механизмов, контролирующих нейрогенез, может обеспечить разработку подходов для манипуляции эндогенными стволовыми клетками ЦНС с целью использования их потенций для восстановления поврежденных участков мозга вследствие патологии или травмы. г) Индуцировано-плюрипотентные стволовые клетки человека (iPS-клетки).

В настоящее время активно ведутся исследования в области получения плюрипотентных соматических клеток животных и человека. Описаны два принципиально разных пути получения подобных клеток: использование методов клонирования (например, клеточного слияния, переноса ядер соматических клеток в овоцит второго делений мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNT)) (Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996; Byrne et al., 2007) и индукция репрограммирования с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells), сходных с ЭСК (Wernig et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006). К настоящему времени уже получены iPS клетки мышей (Takahashi et al., 2006), а методом SCNT клонированы клетки целого ряда животных (Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996; Byrne et al., 2007).

Концентрирование интересов клеточных технологов вокруг исследований, связанных с выделением совместимых плюрипотентных клеток, обусловлено возможностью использования их в моделировании и изучении заболеваний человека, разработке, тестировании и совершенствовании лекарственных препаратов, а также терапевтического применения при большом спектре заболеваний (Takahashi et al., 2007).

В 2007 году, двумя группами исследователей практически одновременно были опубликованы материалы исследований по получению iPS клеток человека. В этих работах индукцию плюрипотентности проводили используя разные виды клеток (кожные фибробласты взрослого человека, веретеновидные синовиоциты, фетальные и неонатальные фибробласты) и сравнивали полученные клетки между собой и с контролем — ЭСК человека. (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007).

Схема репрограммирования предполагает внедрение в клетки генов плюрипотентности, сверхэкспрессия которых способна вернуть дифференцированную клеточную популяцию к плюрипотентному статусу. В качестве индукторов репрограммирования K. Takahashi и S. Yamanaka в 2006 году предложили 4 транскрипционных фактора, выявленных ими из 24 претендентов: Oct4, Sox2, с-Мус, Klf4 (Takahashi and Yamanaka, 2006), которые и были использованы в их работе 2007;го года. Oct4 и Sox2 являются ключевыми факторами регуляции пролиферации и полипотентности стволовых клеток и характеризуются высоким уровнем экспрессии в ЭСК снижающимся в процессе пролиферации (Boyer et al., 2005). Вовлечение Klf4 и с-Мус в процессы репрограммирования может быть связано с их ролью в качестве модификаторов хроматина, способствующих активации Oct4 и Sox2. В группе Томпсона (Yu et al., 2007), на начальном этапе исследований выбирали гены из 14 кандидатов, и в результате была осуществлена замена Klf4 и с-Мус, входящих в стандартный набор транскрипционных факторов стволовости на Nanog и Lin28. Роль Nanog, наряду с Oct4 и Sox2 общепризнана в индукции плюрипотентности соматических клеток (Boyer et al., 2005; Chambers et al., 2003), тогда как существенная значимость Lin28 в репрограммировании подтверждена еще не была. Необходимость замены с-Мус представляется вполне целесообразной, поскольку в ряде работ выявлена его негативная роль, заключающаяся в индукции апоптоза ЭСК человека (Sumi et al., 2007), а также стимуляции в 20% случаев опухолевой трансформации iPS клеток мышей (Okita et al., 2007).

В обоих исследованиях (групп Takahashi и Thomson) селекцию культур iPS клеток проводили на основании морфологического соответствия ЭСК человека (компактность колоний, высокое ядерно-фитоплазматическое соотношение, четкая визуализация ядер). Иммунофенотип полученных клеток, в обеих работах соответствовал фенотипу ЭСК человека — были показаны экспрессия SSEA-3, SSEA-4, Тга-1−60 и Тга-1−81. Методом RT-PCR в iPS клетках показан характерный для ЭСК высокий уровень экспрессии эндогенных Oct4 и Nanog. Высокая экспрессия других генов маркеров ЭСК человека — REX1, FGF4, ESG1, DPPA2, DPPA4, hTERT, также указывает на дополнительное соответствие полученных в работе культур ЭСК. Также было показано деметилирование цитозингуаниндинуклеотидных последовательностей промоторных областей генов Nanog и Oct4 в подтверждении их высокой функциональной активности. В контроле (исходные культуры фибробластов) данные области были метилированы.

Для определения дифференцировочного потенциала iPS клеток, их культивировали в условиях, необходимых для формирования эмбриоидных тел, нейронов или кардиомиоцитов. Клетки были способны экспрессированы маркеры, характерные для клеток эктодермального (b-III-tubulin, GFAP), мезодермального (a-SMA, desmin) и эндодермального (AFP) происхождения. Для подтверждения полипотентного статуса iPS клеток, в работах проводили подкожную трансплантацию iPS клеток. В местах инъекции развивались «тератомы», состоящие из комплекса тканей, морфологически сходных с производными всех трех зародышевых листков.

Несмотря на ряд различий в материалах, методиках и обоснованиях полученных данных, глобальным результатом исследований нескольких независимых групп ученых явилось получение iPS клеток человека, сходных по морфологическим, иммуногистохимическим и генетическим критериям с ЭСК человека. Это является первым значимым достижением в области получения аутогенных плюрипотентных клеток путем репрограммирования соматических клеток человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

I. Культуры клеток.

1.1 Мезенхималъные стромалъные клетки костного мозга человека, культура XI.

Первичная культура мононуклеарной фракции клеток костного мозга человека, была получена из аспирата костного мозга подвздошной кости человека, любезно предоставленого К. Н. Ярыгиным (Лаборатория клеточных технологий в здравоохранении, Российского государственного медицинского университета). Аспират костного мозга разбавили 1:1 раствором PBS, осторожно, не допуская перемешивания наслоили сверху на равный объем Ficoll-Paque (Sigma, США) в 50 мл центрифужной пробирке, и центрифугировали в течение 10 минут, 800 об/мин (1000g), при +4°С. Мононуклеарные клетки остались на разделе фаз двух растворов, тяжелая эритроцитарная масса выпала в осадок. Отобрав нужную фракцию, клетки два раза отмывали от Ficoll-Paque при помощи PBS и осаждения на центрифуге. В конце клетки ресуспендировали в ростовой среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), (Hyclone, США), 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина и высевали на пластиковую 10 см чашку Петри (Corning-Costar, США). Клетки инкубировали в течение 7 дней без смены среды, к этому времени в чашке образовывались колонии фибробластоподобных пластик-адгезивных клеток по 50−500 клеток в каждой. После достижения монослоя клетки пересевали в разведении ½−¼ используя растворы Версена и трипсин-Версена.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы человека (JiTERT) был иммортализован ряд культур стволовых и прогениторных клеток человека: а) нейральные стволовые клетки б) мезенхимальные стромальные клетки из костного мозга в) мезенхимальные стромальные клетки из губчатой кости г) мезенхимальные стромальные клетки из жировой ткани.

2. Иммортализованные нейральные стволовые клетки сохраняют экспрессию нестина, способны образовывать нейросферы и дифференцироваться в нейрональном и глиальном направлениях. На уровне 100 удвоений популяции эти клетки сохраняют теломеразную активность и нормальный диплоидный кариотип.

3. Иммортализованные мезенхимальные стромальные клетки сохраняют способность к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях также как и исходные клетки.

4. Иммортализованные введением гена hTERT мезенхимальные стромальные клетки из губчатой кости сохраняют способность к контактному торможению и переходу в покой в условиях сывороточного голодания.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор благодарит своего научного руководителя Е. Е. Егорова за предложенную тему диссертации, помощь в проведении экспериментов и обработке результатов, общие ценные замечания по работе.

Автор выражает искреннюю благодарность Х. С. Вишняковой за помощь в проведении экспериментов с флуоресцентной гибридизацией in situ и исследованием кариотипа, М. В. Молдавер за помощь в проведении экспериментов со стромальными клетками жировой ткани человека.

Автор выражает благодарность всему коллективу Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терпаии ИМБ РАН и всему коллективу Лаборатории проблем клеточной пролиферации ИБР РАН за моральную поддержку и за проявленный интерес к работе.