Влияние производных адамантана с различными характерами заместителей на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека

В медицине всё ещё стоит вопрос об эффективности лечения патологий системы свёртывания крови, в частности таких нарушений, как тромбоцитоз (патологическое увеличение числа тромбоцитов) и тромбоцитопения (уменьшение числа тромбоцитов в крови). Повышенная способность тромбоцитов к агрегации наблюдается при ряде заболеваний: ишемической болезни сердца, атеросклерозе, диабетических ангиопатиях и др., что значительно осложняет течение болезни [6, 43]. Путём направленного фармакологического воздействия можно снижать патологически возникшую гиперагрегацию тромбоцитов, или наоборот, повышать их способность к агрегации.

В данной работе исследовано влияние производных адамантана с различными характерами заместителей на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека. Ранее было показано, что амиды N-[(адамантоил-1)-фенил]-антраниловой кислоты проявляли выраженное ингибирование серотонинового отёка, предполагалось, что это явление вызвано блокированием серотониновых рецепторов сосудистой стенки этими амидами.

Научная новизна работы: впервые исследованы вновь синтезированные производные адамантана, способные усиливать или снижать эффект известных индукторов агрегации тромбоцитов посредством модуляции функционирования соответствующих тромбоцитарных рецепторов.

Результаты работы имеют практическое значение — исследованные соединения после более детального изучения механизма их действия могут быть использованы в качестве медицинских препаратов.

По теме дипломной работы опубликовано три статьи (две из них приняты в печать). Результаты представлялись на 56 и 57 научных студенческих конференциях.

Цель работы: изучить механизмы влияния вновь синтезированных производных адамантана на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Задачи исследования:

Выявить среди исследуемых соединений синергистов (или агонистов) и антагонистов серотонина;

Выяснить механизмы влияния этих соединений на индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека;

Проверить наличие свойств агонистов агрегирующих тромбоциты веществ у всех исследуемых соединений;

Выявить синергистов и антагонистов серотонина;

Выявить синергистов и антагонистов АДФ;

6. Выявить синергистов и антагонистов адреналина.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Механизмы агрегации тромбоцитов человека

Тромбоциты — плоские безъядерные клетки крови неправильной округлой формы, образующиеся из мегакариоцитов костного мозга путём отщепления от них участков цитоплазмы. Образование тромбоцитов регулируется гликопротеиновым гормоном тромбопоэтином. Нормальные тромбоциты — клетки диаметром 1−5 мкм, толщиной 0,5−0,75 мкм. Содержание тромбоцитов в крови здорового человека составляет 180−320 тыс. в 1 мл. Молодые тромбоциты проходят период созревания — восемь суток, зрелые циркулируют в кровотоке от пяти до 11 суток, с последующим разрушением в печени и селезёнке. Число тромбоцитов в крови относительно постоянно, но ночью оно снижается, а возрастает при пищеварении, тяжёлой мышечной работе, беременности.

На мембране тромбоцитов адсорбируются факторы свёртывающей системы крови. Тромбоциты способны выделять из фосфолипидов своих клеточных мембран арахидоновую кислоту и превращать её в тромбоксаны (при участии тромбоксансинтетазы), которые повышают агрегационную активность тромбоцитов. Примыкающая к оболочке тромбоцита область неструктурированной цитоплазмы — гиаломер. В гиаломере после активации тромбоцита при электронной микроскопии становятся видны микрофиламенты из актина, миозина и тропомиозина, составляющие вместе с микротрубочками цитоскелет клетки, который определяет её форму и способность перемещать органеллы, прикрепляться к поверхностям и образовывать псевдоподии [42, 48]. Актиновые филаменты имеют диаметр 3−5 нм, а миозиновые 6−10 нм. Микрофиламенты контактируют между собой, плазматической мембраной и мембранами гранул. Микротрубочки в основном состоят из тубулина, их диаметр 25−30 нм. Концентрическая система из 5−30 микротрубочек тромбоцитов образует периферический пучок под плазматической мембраной вдоль экватора клетки. Также присутствуют и другие немембранные структуры — гранулы гликогена.

В тромбоцитах различают две системы мембран: плотную тубулярную систему (ПТС) и систему открытых каналов. ПТС — система узких трубочек диаметром 50 нм, подобная ЭПР скелетной мышцы. Эти трубочки не контактируют с системой открытых каналов, органеллами и плазматической мембраной, расположены и по экватору клетки и среди органелл [36, 86]. Система открытых каналов сообщается с гранулами тромбоцитов и с плазматической мембраной, за счёт чего и осуществляется секреция тромбоцитами специфических соединений в процессе реакции высвобождения. Поверхность тромбоцитов может увеличиваться за счёт системы открытых каналов [36, 82, 86]. Центральная часть тромбоцитов (грануломер) содержит органеллы и множество гранул различной структуры, формы и величины («электроноплотные» гранулы, б-гранулы, лизосомы). В электроноплотных гранулах содержатся АДФ, АТФ, ГТФ, ГДФ, неорганический фосфат, серотонин, Са²⁺; в б-гранулах — трансформирующий ростовой фактор, в-тромбоглобулин, антигепарин (фактор пластинок 4), фибронектин, альбумин, фибриноген, проакцелерин (фактор V), антиген фактора Виллебранда (фактор VIII), калликреин, б₂-антиплазмин, тромбоспондин, гистамин; в лизосомах — кислые гидролазы (в-гексозаминидаза, в-галактозидаза, в-глюкуронидаза, в-арабинозидаза, в-глицерофосфатаза, арилсульфотаза) [22, 42]. В тромбоцитах имеются гликолитические ферменты и ферменты пентозофосфатного цикла, цикла лимонной кислоты и дыхательной цепи, АТФаза.

Важнейшим свойством тромбоцитов является способность к агрегации, в процессе которой в них синтезируется, а затем секретируется ряд белков и биологически активных веществ, стимулирующих свёртывание крови (гемостаз). Тромбоциты принимают участие и в защите организма от чужеродных агентов. Они обладают фагоцитарной активностью, содержат IgG, являются источником лизоцима и в-лизинов, способных разрушать мембрану некоторых бактерий.

Гемостаз осуществляется в 4 фазы: сокращение сосуда, образование тромбоцитарной пробки, формирование красного тромба и его ретракция, полное или частичное растворение тромба. Различают внешний путь свёртывания (в месте повреждения сосудов, индуцируется коллагеном) и внутренний путь свёртывания (в области замедленного кровотока на патологически изменённой поверхности сосудистой стенки, индуцируется факторами плазмы), они различаются начальными этапами, объединяясь на стадии активации фактора Х. В настоящее время известно много факторов свёртывания крови, отсутствие любого из которых может привести к нарушению процесса коагуляции. В основном они представляют собой протеолитические ферменты (факторы XII, XI, X, IX, VII, II и калликреин — сериновые протеазы), присутствующие в крови в неактивной форме в виде проферментов. В процессе свёртывания они активируют друг друга в каскадной последовательности реакций. Активированные факторы обозначаются прибавлением буквы «а», например, X_а. (рис. 1)

Рис. 1. Схема свёртывания крови и фибринолиза. ФП 3 — тромбоцитарный фактор 3 (по Циммерману, 1996)

Сразу после травмы наблюдается первичный спазм кровеносных сосудов, благодаря чему кровотечение в первые секунды может не возникнуть или носит ограниченный характер. Первичный спазм сосудов обусловлен выбросом в кровь в ответ на болевое раздражение адреналина и норадреналина и длится 10−15 с. Повреждение сосудов сопровождается немедленной активацией тромбоцитов вследствие появления высоких концентраций АДФ (из травмированных клеток сосудов), а так же обнажением субэндотелия, коллагеновых и фибриллярных структур. В дальнейшем наступает вторичный спазм, обусловленный активацией тромбоцитов и выбросом в кровь сосудосуживающих агентов — серотонина, тромбоксана А₂, адреналина и др. (реакция высвобождения).

Просвет повреждённых сосудов уменьшается и перекрывается массой тромбоцитов, прилипших к коллагеновым волокнам. Тромбоксан А₂ и АДФ, выделяющиеся при разрушении внутриклеточной структуры активированных тромбоцитов, вызывают присоединение новых тромбоцитов. АДФ также может высвобождаться из разрушенных эритроцитов [32], и способствует превращению кровяных пластинок в диски, а также вызывает секрецию тромбоцитарных белков из электроноплотных и б-гранул. Тромбоциты распластываются, у них появляется до 10 «отростков», которые могут в 5−10 раз превышать диаметр самой клетки [2, 34]. Организованное кольцо микротрубочек распадается, изменяется распределение микрофиламентов и микротрубочек, микротрубочки могут образовывать клубочки [36, 54].

На нескольких из этапов гемокоагуляции существуют перекрёстные взаимодействия между внешней и внутренней системами свёртывания, благодаря чему обеспечиваются «альтернативные» пути для процессов коагуляции [42, 65].

Агрегация тромбоцитов наступает одновременно с их адгезией, это активный процесс, протекающий с затратой энергии. Адгезия тромбоцитов к волокнам соединительной ткани по краям раны обусловлена олигомерным гликопротеином, содержащимся в субэндотелии и кровяных пластинках, — фактором Виллебранда. Он образует мостики между субэндотелиальными структурами и специфическими рецепторами (гликопротеин Ib) на мембране тромбоцитов. Фибриноген — белок, содержащийся в плазме и тромбоцитах, тоже способный образовывать между тромбоцитами связующие мостики, что приводит к появлению сети фибрина и тромбоцитарной пробки. Частичный протеолиз молекулы фибриногена наступает под действием тромбина. Для образования ковалентных связей необходим фибринстабилизирующий фактор XIII (трансглутаминаза), активируемая тромбином в присутствии ионов кальция. Трёхмерная сеть волокон фибрина удерживает клетки крови, формируется красный тромб (рис. 1). Благодаря контрактильному белку тромбостенину тромбоциты подтягиваются друг к другу, тромбоцитарная пробка сокращается и уплотняется, т. е. наступает её ретракция. Сгусток становится более плотным и стягивает края раны, что облегчает её зарастание клетками соединительной ткани. В норме остановка кровотечения из мелких сосудов занимает от двух до четырёх минут.

Таким образом, при повреждении кровеносного сосуда в крови появляются вещества, инициирующие процесс агрегации тромбоцитов. Характер действия этих веществ разный, так, слабыми агрегирующими агентами являются АДФ, серотонин, адреналин, вазопрессин, — они действуют первыми, лишь запуская каскад последующих реакций. Более быстро агрегация происходит под действием коллагена, тромбина, ионофора А23 187. Агрегация тромбоцитов может носить обратимый характер (вслед за агрегацией наступает дезагрегация, распад агрегатов), что зависит от недостаточной дозы агрегирующего агента или от наличия в крови простациклина PGI₂, синтезирующегося в эндотелии сосудов, который ингибирует агрегацию тромбоцитов. Травма сосуда всегда сопровождается образованием сразу нескольких индукторов агрегации, способных инициировать агрегацию тромбоцитов разными путями, и их концентрация достаточно высока, поэтому дезагрегация, как правило, не случается.

Биохимические механизмы активации тромбоцитов с их последующей агрегацией различны, что обусловлено различным характером инициаторов агрегации. Однако, все известные агреганты так или иначе способствуют увеличению концентрации Са²⁺ в цитоплазме тромбоцита.

Общее содержание Са²⁺ в тромбоцитах составляет около 60 нмоль/10⁹ клеток. Четверть этого кальция связана с мембранами тромбоцитов, но значительное его количество содержится в тубулярной системе и плотных гранулах. Концентрация свободных ионов Са²⁺ в цитоплазме тромбоцитов (10^-7 моль/л) почти в 1000 раз ниже, чем в плазме (10^-3 моль/л). Такая разница в концентрации этих ионов по обе стороны плазматической мембраны поддерживается мембранными Са²⁺-АТФазами, которые используют энергию гидролиза АТФ для откачивания Са²⁺ из цитоплазмы в окружённые мембранами клеточные органеллы, а так же аденилатциклазами и фосфодиэстеразами, контролирующими уровень цАМФ. Активированная аденилатциклаза катализирует образование цАМФ из АТФ, фосфодиэстераза осуществляет гидролиз цАМФ до 5-АМФ. Аденилатциклаза тромбоцитов локализована на внутренней стороне плазматической мембраны, на мембранах плотной тубулярной системы и системы открытых каналов. Фосфодиэстераза находится в цитоплазме. Активация аденилатциклазы происходит посредством взаимодействия простагландинов Е₁, I₂ и D₂ со специфическими рецепторами мембран, сопряжёнными с ГТФ-связывающими белками (G-белки). Для этих рецепторов цАМФ служит внутриклеточным медиатором. Активированные рецепторы действуют на G-белки, которые стимулируют аденилатциклазу, образуется цАМФ, активируются цАМФ-зависимые ферменты (протеинкиназы), катализирующие фосфорилирование небольшой группы тромбоцитарных белков.

Адреналин, связываясь со специфическими рецепторами мембраны тромбоцитов, посредством G-белков стимулирует образование тромбоксана А₂. Предполагается, что ускоряющий агрегацию тромбоцитов эффект адреналина связан с модуляцией мембран при его взаимодействии с б-адренорецепторами и изменением её проницаемости к ионам Са²⁺ [73, 79]. Показано, что антагонисты б₂-адренорецепторов способны блокировать агрегацию, а агонисты усиливают её, поскольку активированные G_i-белки ингибируют аденилатциклазу [10, 59]. Через в-адренорецепторы происходит замедление агрегации тромбоцитов. Стимуляция в-адренорецепторов посредством G_s-белков приводит к активации аденилатциклазы, т. е. катехоламины способны регулировать активность тромбоцитов, влияя на уровень цАМФ в клетке. Адреналин вызывает агрегацию тромбоцитов без изменения их формы. Адреналин-индуцированное изменение оптической плотности проб наблюдается через 30 с после его добавления.

Активация тромбоцитов тромбином, коллагеном, фактором активации тромбоцитов (ФАТ) и некоторыми другими агрегантами происходит через образование из фосфолипидов плазматической мембраны (фосфатидилхолина и фосфатидилинозитола) арахидоновой кислоты. Активированная через сопряжённые с G_s-белками рецепторы для ФАТ фосфолипаза С катализирует этот процесс. Арахидоновая кислота способна метаболизировать, вновь включаться в фосфолипиды или диффундировать из тромбоцитов. Высвобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов тромбоцитов могут катализировать также фосфолипаза А₂ и глицеролипаза. Образовавшаяся арахидоновая кислота может окисляться двумя ферментами: цитоплазматической циклооксигеназой (ЦОГ) и мембранносвязанной липоксигеназой (ЛОГ). При действии ЦОГ образуются нестабильные циклические эндопероксиды, которые превращаются в простагландины G₂ и Н₂, тромбоксан А₂, простациклин с дальнейшим образованием из них 6-кето-простагландина Е₁, 12-гидрокси-5,8,10-гептадекатриеновой кислоты, тромбоксана В₂ и малондиальдегида. Конечными продуктами липоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты являются 12-гидрокси-5,8,10,14-эйкозатетраеновая кислота (12-НЕТЕ) и лейкотриены. Образующиеся из арахидоновой кислоты простагландины и тромбоксан А₂ (ионофор кальция) являются агрегантами. Простациклин, синтезируемый клетками эндотелия кровеносных сосудов, напротив, мощный ингибитор агрегации тромбоцитов.

Связывание АДФ со специфическими рецепторами плазматической мембраны тромбоцита приводит к увеличению концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток (увеличивается его поступление из внешней среды и из внутриклеточных запасов). Кроме того, происходит активация фосфолипазы А₂, которая стимулирует высвобождение арахидоновой кислоты из фосфолипидов мембраны и образование из неё тромбоксана А₂ — активного проагреганта и вазоконстриктора. Форма тромбоцитов изменяется без сопутствующей активации фосфолипазы С, что сопровождается ингибированием аденилатциклазы [61, 77]. Реализация метаболических эффектов активации АДФ-рецепторов тромбоцитов осуществляется через сопряжение с мембранным G-белком. Сегодня известно, что при активации на поверхности каждого тромбоцита появляется до 50−100 тысяч гликопротеиновых рецепторов. Экспериментальные данные многих клинических исследований свидетельствуют, что удаление из среды АДФ или связывание АДФ-рецепторов с конкурентным антагонистом существенно угнетает агрегацию тромбоцитов [72, 76, 78, 81].

Для серотонина на поверхности тромбоцитов существует два типа рецепторов — ионные каналы и рецепторы, сопряжённые с G-белком [40, 45]. Согласно [47], механизм действия серотонина состоит в регуляции цАМФ-зависимых путей, и поэтому реакция на серотонин способна блокироваться стимуляторами аденилатциклазы и ингибиторами фосфодиэстеразы. Серотонин стимулирует поступление ионов кальция из плазмы в тромбоциты через рецепторуправляемые каналы для двухвалентных катионов, запуская фосфатидилинозитоловый цикл с образованием фосфатидной кислоты, являющейся кальциевым ионофором. Активация G-белков, сопряжённых с другим типом серотониновых рецепторов приводит к активации фосфолипазы С, которая гидролизует трифосфатидилинозитол (или фосфатидил-4,5-бифосфат) в дифосфатидилинозитол (фосфатидилинозитол-4-фосфат) с образованием 1,2-диацилглицерола (ДАГ), который фосфорилируется в фосфатидную кислоту (ФК). Это самые ранние этапы активации тромбоцитов. Диацилглицерол стимулирует Са²⁺-активируемые фосфолипидзависимые протеинкиназы (в частности, ПК С), которые фосфорилируют белки. Фосфатидная кислота — кальциевый ионофор, высвобождает кальций из внутриклеточных депо, присоединяя к своим фосфатным группам. Ионы кальция стимулируют работу актина и миозина микрофиламентов, в результате чего гранулы тромбоцитов перемещаются к системе открытых каналов, осуществляется реакция высвобождения собственных агрегантов, что усиливает собственный ответ клетки и активирует другие тромбоциты.

Таким образом, активация тромбоцитов начинается при взаимодействии агрегантов с рецепторами плазматической мембраны. Важную роль в передаче сигнала внутрь тромбоцита играют G-белки плазматической мембраны, а также изменение проницаемости мембраны для ионов (если рецептор является ионофором).

1.2. Роль рецепторов плазматической мембраны в процессах агрегации тромбоцитов человека

В настоящее время установлено, что важным моментом трансмембранной передачи сигналов является изменение интенсивности транспорта и внутриклеточной концентрации различных ионов. Одной из основных систем, приводящих к изменению внутриклеточной концентрации ионов, являются селективные ионные каналы биомембран, представляющие собой интегральные мембранные белки, способные при определённых внешних воздействиях (изменение потенциала на мембране, действие медиатора или гормона) избирательно менять проницаемость мембраны для конкретного вида ионов. Агрегацию тромбоцитов и вазоконстрикцию индуцирует 5-гидрокситриптамин (серотонин), который также синергически усиливает эффекты тромбоксана А₂, ангиотензина II, АДФ и коллагена. Эта активность проявляется через взаимодействие со специфическими рецепторами на поверхности тромбоцитов — 5-НТ-рецепторами (рецепторы 5-гидрокситриптамина). Серотонин (5-гидрокситриптамин) является производным триптофана и синтезируется в клетках пищеварительного тракта, нервных (серотонинэргических) и тучных клетках; способен накапливаться в специальных гранулах тромбоцитов. Физиологическое действие серотонина в организме человека разнообразно, он является лигандом для рецепторов клеток практически всех внутренних органов и тканей [67, 87]. Фармакологические эффекты серотонина коррелируют главным образом с возбуждением 5-НТ₂ рецепторов [51, 52, 63]. Исследователями [48, 62, 66, 69, 70] синтезировано множество соединений, способных связываться с этими рецепторами и модулировать их функционирование. Установлено, что рецепторы для 5-гидрокситриптамина (серотонина) находятся на клетках практически всех внутренних органов человека, регулируя многие процессы жизнедеятельности. Классификация 5-НТ рецепторов на семь семейств (от 5-НТ₁ до 5-НТ₇) основана на структурных, функциональных и фармакологических критериях. Семейства в свою очередь делятся на подсемейства [67, 80]. Выяснено, что некоторые 5-НТ рецепторы связаны с G-белками. Рецепторы серотонина, расположенные на тромбоцитах и клетках гладкой мускулатуры сосудов относятся к подтипу 5-НТ_2А рецепторов, остальные представители этого подтипа — 5-НТ_2В и 5-НТ_2С локализованы только на нейронах [71, 80, 84].

Есть данные о примерном расположении в мембране и структуре активного центра 5-НТ₄ рецептора.

Представители некоторых семейств 5-НТ рецепторов синтезируются с использованием методов генной инженерии in vitro, выделяются методом микродиализа или экстракцией из клеточных мембран. На плазматической мембране тромбоцитов локализованы два типа рецепторов для серотонина.

Исследованиями [11, 55] показана зависимость снижения агрегационной способности тромбоцитов от геометрии молекулы изучаемого вещества. Есть данные о том, что сродство к 5-НТ₂ рецепторам увеличивается при наличии объёмного адамантил-заместителя. Так же доказано антагонистическое действие SB-699 551-A (3-циклопентил-N-[2-(диметиламино)этил]-N-[(4-{[(2-фенилэтил)амино]метил}-4-бифенилил)метил]пропанамид дигидрохлорид), имеющего объёмное, сложное молекулярное строение на 5-НТ_5А рецепторы мозга свиньи.

Ионотропные рецепторы для серотонина являются членами суперсемейства мембранных белков, которое включает также рецепторы для никотина, глицина, г-аминомасляной кислоты (ГАМК). Все они обладают одинаковыми свойствами — один и тот же белок является и рецептором и ионным каналом, сформированным различными комбинациями 2б, в, г, д и е субъединиц. Лиганд рецептора этого суперсемейства связывается с б-субъединицей и стимулирует открытие неспецифического ионного канала.

Большинство рецепторов относятся к семейству мономерных гликопротеинов, семикратно пересекающих мембрану. Они выполняют разнообразные биологические сигнальные функции. К таким рецепторам относятся адренорецепторы и рецепторы для АДФ тромбоцитов, а так же часть 5-НТ рецепторов тромбоцитов. АДФ активирует тромбоциты через их три аденозинфосфат-зависимых рецептора: Р2Х, П2И и Р2Т. Гликопротеиновые рецепторы имеют очень древнее происхождение. Их используют, например, клетки дрожжей, которые выделяют необходимые для спаривания полипептидные факторы и распознают их с помощью поверхностных рецепторов, представляющих собой все те же семикратно пересекающие мембрану рецепторы.

Уникальная структура лиганд-связывающих участков семикратно пересекающих мембрану рецепторов позволяет связывать лиганды различной природы и молекулярной массы в широком диапазоне от 32 для Ca²⁺ до более чем 10² кДа для гликопротеинов.

Большинство обычных низкомолекулярных гормонов (типа адреналина и ацетилхолина) связывается с участками внутри гидрофобного ядра (a). Пептидные и белковые лиганды присоединяются к внешней поверхности рецептора (b, c). Некоторые лиганды низкого молекулярного веса, Ca²⁺ и аминокислоты (глутамат, ГАМК) связываются с длинными участками на N-конце, индуцируя их переход в новую конформацию, в которой длинный участок взаимодействует с рецептором (d). В случае рецепторов, активируемых отрезающей протеазой (e), новый N-конец действует как автолиганд. Отрезанный пептид может также взаимодействовать с другим рецептором.

1.3. Биологическая активность производных адамантана

Производные адамантана как физиологически активные вещества находят широкое применение с 70-х годов XX века. Сам адамантан (трицикло[3.3.1.1.]декан, С₁₀Н₁₆) принадлежит к числу трициклических нафтенов мостикового типа (рис. 6).

Рис. 6. Структура молекулы адамантана.

Молекула его состоит из трёх конденсированных циклогексановых колец в конформации кресла. Пространственная модель молекулы адамантана — высокосимметричная конструкция с малой поверхностью и незначительными силами межмолекулярного взаимодействия в кристаллической решётке. Из всех трициклических углеводородов адамантан наиболее устойчив, что объясняется тетраэдрической направленностью связей всех атомов углерода и их фиксированным положением.

Биологическая активность производных адамантана обусловлена симметрией и объёмностью пространственного строения, значительной

липофильностью жёсткого углеводородного каркаса адамантана, что позволяет им легко проникать через биологические мембраны. Поэтому модификация органических соединений с помощью адамантильного радикала значительно изменяет их биологическую активность, нередко усиливая её. С помощью метода спиновых меток было показано, что адамантан, попадая в липидный бислой, способен разрушать гексагональную упаковку метиленовых группировок, характерную для двойного слоя фосфолипидов, и нарушать осевое расположение алкильных цепей фосфолипидов, модифицируя тем самым функциональные свойства клеточных мембран. Принимая во внимание важность порядка расположения метиленовых групп липидов биологических мембран как фактора функционирования связанных с мембранами ферментов, можно отметить косвенное влияние адамантана на их активность.

На данный момент синтезировано более 1000 новых производных адамантана. Фармакологическое изучение показало наличие среди них веществ, обладающих выраженной психотропной, иммунотропной, противовирусной, курареподобной, антикаталептической, противоаллергической активностями, а также соединений, влияющих на ферментативную систему печени. Амиды адамантанкарбоновых кислот проявляют антибактериальную активность.

Есть данные о результатах модификации молекулы энкефалина аминокислотами ряда адамантана. Введённый в положение 5 молекулы энкефалина (S)-адамантилаланин придаёт опиоидному пептиду резистентность по отношению к ферментам, легко разрушающим немодифицированный энкефалин (химотрипсин, проназа, нейтральная протеаза, термолизин).

Показано, что физиологической активностью обладают азотсодержащие производные. Первым в медицинскую практику в 1966 г. вошёл гидрохлорид 1-аминоадамантана, обладающий противовирусной активностью в отношении штаммов вирусов типа А₂, его фирменные названия: мидантан, симметрел, амантадин. Эти препараты используются для профилактики респираторных заболеваний, т. к. обладают способностью блокировать проникновение вируса в клетку. Предполагают, что данные препараты способны работать на начальных этапах репродукции вируса, блокируя синтез вирусоспецифичных РНК. Противовирусная активность некоторых аминопроизводных адамантана связана с их способностью ингибировать ПК С. Ремантадин (полирем, флумадин), как липофильное слабое основание способен повышать рН эндосомального содержимого и препятствовать депротеинизации вируса.

В клинической практике для лечения вирусных заболеваний применяются также такие препараты, как ацикловир (виролекс, герпесин, зовиракс, лизавир, суправиран), диданозин, фоскарнет (триаптен), ганцикловир (цимевен), ламивудин, рибавирин (виразол, рибамидил), ставудин, трифлуридин, видарабин, зальцитабин (хивид), зидовудин (азидотимидин, ретровир). Однако, у большинства этих препаратов относительно узкий спектр противовирусного действия, их недостатком является наличие разнообразных побочных реакций, появление резистентных штаммов вирусов и др. [25, 35].

Противовирусной активностью в отношении штаммов вирусов типа А₂ обладают и производные алкиладамантанов: 1-гидрокси-3,5диметил-7-этиладамантан, 1-метокси-3,5диметиладамантан, которые, в отличие от мидантана, показали высокую противовирусную активность и в отношении штаммов strains of rhino viruses и herpes simplex. Ряд гидрокси-, галогени меркаптопроизводных амидов адамантана тоже обладают противовирусной активностью [7, 19].

Показано, что амантадин способен препятствовать развитию очагов саркомы на зародышевой культуре, другие производные адамантана могут служить снотворными средствами, антималярийными препаратами, инсектицидами. В экспериментах с использованием ВИЧ-инфицированных человеческих лимфобластоидных клеток показано, что некоторые производные адамантана обладают анти-ВИЧ-активностью. Мидантан используется в неврологической клинике для лечения болезни Паркинсона и паркинсонического синдрома. Подобную активность проявляют хлорангидриды 3,5,7-алкилзамещённых 1-аминоадамантанов, некоторые из которых обладают антагонистическими дофамину свойствами. Некоторые четвертичные аммониевые основания с 2-адамантильным радикалом способны действовать как миорелаксанты периферического действия (курареподобная активность). Производные 1-аминоадамантана и 3,3-диамино-1,1-диадамантила противокаталептически активны, бактериостатическое влияние оказывают адамантанкарбоновые кислоты и фосфаты адамантантиолов и их производных. Диалкиламиновые эфиры адамантантиокарбоновой кислоты проявляют бактерицидную, фунгицидную, гербицидную активность. Натриевая соль в-(1-адамантан)-пропионовой кислоты обладает желчегонным действием. 1-адамантиламмоний-в-хлорэтилоксаминоат и некоторые другие производные адамантана типа 1-AdCH₂OCH₂CH (OH)CH₂NRRґ обладают анестезирующим действием.

Антибактериальное действие, сравнимое с антибактериальным препаратом 5-нитро-8-гидроксихинолином, оказывают N-(нитрофенил)-адамантил-карбоксамиды и адамантилзамещённые N-(1-метилпиридиний)йодиды.

Перфторированный адамантан применяется в качестве компонента искусственной крови. Есть данные об антиагрегационной способности производных адамантана по отношению к различным путям агрегации тромбоцитов.

1.4. Производные адамантана, влияющие на агрегацию тромбоцитов

Ярко выраженная липофильная природа каркасного углеродного фрагмента адамантана обуславливает высокую биологическую активность его производных.

Введение

в молекулу производного высоколипофильного радикала усиливает его взаимодействие с гидрофобными областями рецепторных молекул.

Показано влияние модифицированных адамантильных и амидных фрагментов амидов N-[(адамантоил-1)-фенил]-антраниловой кислоты на 5-НТ₂ рецепторы тромбоцитов человека: снижение их АДФи серотонин-индуцированной агрегации. Кроме того, известно, что сродство к данным рецепторам обусловлено наличием объёмного адамантильного заместителя [55, 56, 60, 83]. Была предположена биологическая активность ряда 1-адамантанкарбоксамидов в качестве антагонистов 5-НТ₂ рецепторов тромбоцитов. Высокоспецифическое сродство к изучаемым рецепторам и мощный антиагрегационный эффект был подтверждён и in vitro и in vivo для (S)-N-{1-[2-(4-флуорофенил)этил]пирролидин-3-ил}-1-адамантанкарбоксамид гидрохлорид гидрата (10-(S), Y-39 241).

Ряд синтезированных адамантильных производных гетерофункциональных соединений проявил свойства антагонистов и синергистов серотонина при исследовании их влияния на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Глава 2. Материал и методы исследования

Проведено исследование влияния на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека 19-ти производных адамантана с различающимися по структуре и свойствам заместителями (табл. 1).

Таблица 1.

Исследуемые соединения

Продолжение таблицы 1.

Продолжение таблицы 1.

Эти вещества синтезированы в лаборатории кафедры органической химии СамГУ научным сотрудником кандидатом химических наук Ермохиным В. А. [13, 14, 15, 16]. Строение вновь синтезированных соединений доказано данными ЯМР ¹Н и ИК спектроскопии (Приложение, табл. 1−4). ИК спектры соединений снимали на спектрофотометре ИКС-29 в таблетках из KBr. Спектры ЯМР получены на приборе Bruker WP-200 SY (рабочая частота 200,13 МГц). В качестве растворителя применяли ДМСО-d₆, CD₃CN, CDCl₃. Отсчёт химических сдвигов проводили относительно сигнала ТМС. Для подтверждения индивидуальности всех полученных соединений проводили тонкослойную хроматографию на пластинках Silufol UV в этилацетате. Соединения № 18 и № 19 были синтезированы ранее.

Агрегация тромбоцитов исследована фотометрическим методом Борна. Принцип метода основан на регистрации снижения оптической плотности исследуемой плазмы после введения в неё тромбоцитагрегирующего агента. Происходит «склеивание» тромбоцитов, образующиеся агрегаты постепенно оседают и проба плазмы становится более прозрачной.

Биологический материал предоставлен самарской областной станцией переливания крови. Кровь, взятую из локтевой вены, стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (9:1). Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут. Плазму разбавляли 0,154 М раствором хлорида натрия, рН 7,2 до достижения оптической плотности пробы 0,4−0,6 ед. (стандартизация плазмы). Плазму разливали в кюветы по 2 мл. Изучаемые соединения растворяли в 96% этиловом спирте. В качестве агрегирующих агентов использовали растворённый в 0,154 М физ. растворе рН 7,2 5-гидрокситриптамин креатин сульфат (серотонин) и АДФ в конечной концентрации 1*10^-5 М. В эксперименте в качестве агреганта использовался также адреналина гидрохлорид в концентрации 0,1%. Конечные концентрации всех соединений составляли 0,099 мг/мл. Оптическую плотность измеряли против контроля на СФ-46 при длине волны 600 нм, кювета 10 мм (в контрольную пробу добавляли спирт вместо раствора вещества) в течение 30 минут. Об интенсивности агрегации судили по изменению оптической плотности относительно контроля, которое выражали в условных единицах:? А₃₀ (изменение оптической плотности за 30 минут)1000=х у. е.

Полученные данные анализировали для установления значений их достоверности согласно критерию Стьюдента. Данные считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Биологическая активность любого химического соединения определяется его структурой, конформацией его молекулы. В данном эксперименте сначала были выявлены некоторые производные адамантана, влияющие на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека in vitro. Затем были исследованы механизмы влияния этих соединений на агрегацию тромбоцитов человека.

3.1. Влияние производных адамантана на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Адамантилсодержащие производные гидроксии аминопиридинов и иодидов N-адамантоил-1-метилпиридиния и О_адамантоил-N-метилпиридиния. В пробах с добавлением производного адамантана № 1 агрегация тромбоцитов менее интенсивна по сравнению с агрегацией в контрольных пробах, но это отличие не достоверно (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние N-(1-адамантил)-3-аминопиридина гидрохлорида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Соединение № 2 отличается от соединения № 1 положением азота аминопиридина и наличием метильной группы у этого атома азота, заряд азота пиридина в соединении № 2 экранирован йодид-ионом, а в соединении № 1 — хлорид-ионом (табл. 1). Несмотря на такие незначительные структурные различия, соединение № 2 проявило себя как синергист серотонина в процессе агрегации тромбоцитов (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние 2-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ???- p<0,001 к контролю.

Из полученных данных был сделан вывод о том, что способность изучаемых соединений влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов коррелирует с положением азота пиридина по отношению к кислороду адамантоильной группировки. Вероятно, азот пиридина во втором положении придаёт производному адамантана свойства синергиста серотонина. Для проверки этого предположения был поставлен эксперимент с веществом, азот пиридина которого стоит в четвёртом положении (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние 4-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Предположение подтвердилось: в пробах с 4-[N-(1-адамантоил)амино]-1-метилпиридиний иодидом интенсивность агрегации оказалась почти такой же, как и в контрольных пробах. Производное № 3 не влияет на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, хотя отличается от производного № 2 только положением метилированного азота. Чтобы проверить, зависит ли способность соединения № 2 влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов от наличия в адамантоильной группировке аминогруппы, поставили эксперимент с веществом с карбоксильной группой (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние N-(1-метилпиридиний-3-ил)-адамантил-1-карбоксамид иодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ***- p<0,001 к контролю.

Результаты эксперимента с веществом № 4 почти такие же, как и с веществом № 2, что ещё раз доказывает зависимость биологической активности производных адамантана именно от положения азота пиридина по отношению к кислороду адамантоильной группировки.

Модификация адамантоильной группировки метилированием и внедрение в молекулу производного бромид-иона существенно снизило способность полученного соединения влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов человека (табл. 6).

Таблица 6.

Влияние 2-[N-(1-адамантоил)амино]-4-бром-1-метилпиридиний иодида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Также «неудачной» оказалась модификация соединения, в результате которой получилось более гидрофобное производное № 6. 3_(адамантил-1-карбонилокси)-2_этил₆-метилпиридин (соединение № 6), в отличие от предыдущих веществ, не имеет внутримолекулярного заряда, и почти не проявил биологической активности в отношении агрегации тромбоцитов (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние 3_(адамантил-1-карбонилокси)-2_этил₆-метилпиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Молекула 2_(адамантил₁_карбонилокси)-пиридина тоже сильно гидрофобна, и тоже почти не повлияла на индуцируемую серотонином агрегацию тромбоцитов (табл. 8).

Таблица 8.

Влияние 2_(адамантил₁_карбонилокси)-пиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

И N-(1-адамантилацетил)-2-аминопиридин почти не влияет на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, хотя азот пиридина находится во втором положении (табл. 9).

Таблица 9.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-2-аминопиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Значит, если азот пиридина в составе молекулы производного адамантана находится во втором положении, для проявления его биологической активности необходима полярность молекулы, способствующая её гидратации.

Интересно, что N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин оказался синергистом серотонина (табл. 10).

Таблица 10.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-4-аминопиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ?- p<0,05 к контролю.

Подобное аминопиридиновое производное адамантана с азотом пиридина в третьем положении не влияет на серотониновую агрегацию тромбоцитов (табл. 11).

Таблица 11.

Влияние N-(1-адамантилацетил)-3-аминопиридина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Из всех гидрофобных адамантил-аминопиридинов синергистическими серотонину свойствами обладает соединение, азот пиридина которого находится в четвёртом положении (табл. 10). Из более гидрофильных адамантильных (адамантоильных) пиридиновых производных синергистами серотонина оказались аминопиридиновые производные, азот пиридина которого находится во втором положении (табл. 3, 5). Заметим, что эти соединения имеют внутримолекулярный заряд, который облегчает их растворимость в водной межклеточной среде, сохраняя при этом мембранотропность.

N-адамантоил-б-аминокислоты. Рацемическая смесь триптофанового производного адамантана проявила слабую тенденцию к замедлению серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов (табл. 12).

Таблица 12.

Влияние N-(1-адамантоил)-D, L-триптофана на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Триптаминовое производное способно ускорять серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, а смесь из Dи L-гистидиновых производных напротив, достоверно её замедляет (табл. 13, 14).

Таблица 13.

Влияние 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ???- p<0,001 к контролю.

Таблица 14.

Влияние N-(1-адамантоил)-D, L-гистидина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ???- p<0,001 к контролю.

Из экспериментальных данных видно, что смеси Dи L-аминокислотных производных адамантана проявляют антагонистические серотонину свойства в процессе агрегации тромбоцитов, а триптаминовое производное — синергистические. Способность триптаминового производного (3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола) усиливать индуцируемую серотонином агрегацию тромбоцитов, скорее всего, связана с его структурным сходством с самим серотонином (рис.7).

а. б.

Рис. 7. Строение серотонина (а) и 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индола (б). Видно сходство структуры серотонина (5-гидрокситриптамина) и биологически активного производного адамантана.

Адамантилсодержащие производные 4-аминобензойной кислоты. Первым из производных 4-аминобензойной кислоты был исследован 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоат, который проявил тенденцию к снижению интенсивности серотонин-индуцируемой агрегации тромбоцитов (табл. 15).

Таблица 15.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоата на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Модификация 4-адамантанкарбоксамидо-этилбензоата, в результате которой получился 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензоат, привела к появлению у нового соединения синергистических серотонину свойств (табл. 16).

Таблица 16.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензоата на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ???- p<0,001 к контролю.

Модификация бензоата до бензамида приводит к изменению биологической активности производного вплоть до тенденции к замедлению индуцируемой серотонином агрегации тромбоцитов в опытных пробах по сравнению с контролем (табл. 17).

Таблица 17.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-N-[2-(диэтиламино)этил]-бензамида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

При хлорировании и оксиметилировании бензамида получается производное адамантана, обладающее свойствами синергиста серотонина (табл. 18).

Таблица 18.

Влияние 4-адамантанкарбоксамидо-5-хлор-N-[2-(диэтиламино)этил]-2-метоксибензамида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

П р и м е ч, а н и е: уровень достоверности результатов ?- р<0,05 к контролю.

Адамантилсодержащие производные этилендиамина. Ещё два производных адамантана, которые теоретически должны влиять на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, в эксперименте не проявили ожидаемой биологической активности. В опытных пробах с добавлением N-(1-адамантоил)этилендиамина гидрохлорида почти такая же интенсивность агрегации тромбоцитов как и в контрольных пробах (табл. 19).

Таблица 19.

Влияние N-(1-адамантоил)этилендиамина гидрохлорида на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Производное адамантана № 19, молекула которого симметрична и включает две адамантоильных группировки, проявило лишь тенденцию к снижению интенсивности индуцируемой серотонином агрегации тромбоцитов (табл. 20).

Таблица 20.

Влияние N, N'-ди-(1-адамантоил)этилендиамина на серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Для серотонина на мембране тромбоцитов существует два типа рецепторов — ионные каналы и рецепторы, сопряжённые с G-белками [17, 40]. Поэтому серотонин способен индуцировать процессы агрегации тромбоцитов двумя путями, являясь лигандом для двух разных типов рецепторов. На функционирование какого типа серотониновых рецепторов влияют добавляемые в опытные пробы соединения, можно проверить аналогичными экспериментами, где агрегантом является известный лиганд для рецепторов, сопряжённых с G-белками, например, АДФ и адреналин. Для этих экспериментов было отобрано 5 соединений: соединения № 2, 12, 9, проявившие наиболее выраженное синергистическое серотонину действие (соединения № 15 и 17 больше не исследовались, так как они оказались неустойчивыми); соединение № 13, проявившее свойство антагониста серотонина и № 14, которое хоть очень слабо, но тоже замедляет серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов.

Активность вещества № 4 почти не отличалось от таковой вещества № 2, их структура тоже мало отличается (табл. 3, 5), поэтому чтоб не усложнять эксперимент, вещество № 4 не исследовалось.

Более чётко влияние изучаемых соединений на серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов видно на графиках зависимости оптической плотности проб от времени.

Снижение оптической плотности в опытных пробах с добавлением вещества № 2 происходит интенсивнее, чем в контрольных, что говорит о способности этого соединения усиливать агрегацию тромбоцитов. В опытных пробах с добавлением вещества № 9 оптическая плотность тоже снижается интенсивнее, чем в контрольных, хотя здесь отличие опыта от контроля более сглажено. Вещество № 12 тоже усиливает серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов. Влияние на агрегацию тромбоцитов вещества № 13 замедляет снижение оптической плотности опытных проб. Вещество № 14 тоже способно замедлять серотонин-индуцируемую агрегацию тромбоцитов, но менее интенсивно, чем вещество № 13.