Гемолитическая болезнь новорожденных. 
Клинико-лабораторная характеристика

Министерство здравоохранения Республики Беларусь Учреждение образования

" Гомельский государственный медицинский университет"

Медико-диагностический факультет Кафедра педиатрии Дипломная работа

" Гемолитическая болезнь новорожденных. Клинико-лабораторная характеристика"

Исполнитель:

Тимошенко В.А.

Научный руководитель:

Зарянкина А.И.

Гомель

Реферат Ключевые слова: гемолитическая болезнь новорожденных, резус — сенсибилизация, резус-антитела, реакция Кумбса, заменное переливание крови, АВО — изоиммунизация, гемагглютинины.

Объект исследования: медицинские карты стационарного больного новорожденных, находившихся на стационарном лечении в ГОДКБ в 2008 году.

Цель работы: изучить особенности течения, методы диагностики и лечения гемолитической болезни новорожденных у детей Гомельской области и г. Гомеля.

Экономическая эффективность и практическая значимость: своевременное применение предложенного комплекса профилактических, диагностических и лечебных мероприятий помогает в выборе адекватной тактики ведения каждого конкретного ребенка с гемолитической болезнью новорожденного и позволяет избежать перинатальных осложнений и неблагоприятных исходов, улучшить демографические показатели, высвободить коечный фонд и значительно снизить затраты государственного здравоохранения на лечение.

Содержание Введение Глава 1. Обзор литературы

1.1 Этиология гемолитической болезни новорожденных

1.2 Патогенез гемолитической болезни новорожденных

1.3 Классификация ГБН

1.4 Клиническая картина ГБН

1.5 Диагностика и лечение гемолитической болезни новорожденных

1.6 Течение и прогноз ГБН

1.7 Профилактика гемолитической болезни Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Определение билирубина в сыворотке крови

2.1.1 Определение содержания БР и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом по Иендрашику

2.1.2 Прямые спектрофотометрические методы

2.1.3 Микрометод определения билирубина в капиллярной крови новорожденных

2.2 Определение почасового прироста БР Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение Заключение и выводы Список использованных источников

Введение

гемолитический болезнь новорожденный билирубин Среди иммунологически обусловленных осложнений беременности ведущее место занимает АВО-изоиммунизация и резус-конфликт, следствием чего является гемолитическая болезнь плода и новорожденного.

Гемолитическая болезнь новорожденных (morbus haemolyticus neonatorum), или фетальный эритробластоз (Erythroblastosis faetalis) — заболевание, вызванное изоиммунизацией в результате несовместимости крови матери и ребенка по резус-фактору и его типам, а также при наличии несовместимости по групповым агглютиногенам системы ABO и другим менее изученным системам — M, N, S, P, Lutheran, Kell, Kidd, Levis и др.

Гемолитическая болезнь новорожденных является одним из тяжелых заболеваний детей периода новорожденности. В развитых странах среди основного населения проблемы резус-несовместимости крови матери и ребенка решены за счет профилактических мероприятий, заключающихся в использовании антирезус-г-глобулина. В нашей стране до настоящего времени беременность у женщин протекает на фоне имеющихся в крови или вырабатываемых ею антирезус-антител, до сих пор встречаются тяжелые формы гемолитической болезни новорожденного вплоть до гибели детей, что связано с недостаточным проведением профилактических мероприятий. Решение проблемы резус-сенсибилизации заключается в правильном и своевременном проведении профилактических мероприятий. Профилактика резус-сенсибилизации включает в себя комплекс мероприятий:

— осуществление любого переливания крови с учетом резус-принадлежности крови пациента и донора;

— сохранение первой беременности у женщин с резус-отрицательной кровью;

— специфическая профилактика резус-сенсибилизации у женщин с резус-отрицательной кровью без явлений сенсибилизации путем введения антирезус-иммуноглобулина после любого прерывания беременности (роды резус-положительным плодом, аборты, внематочная беременность).

С целью снижения степени сенсибилизации в условиях стационара проводят плазмаферез. Применение мероприятий по оптимизации ведения беременности и родов у пациенток с резус-сенсибилизанией и гемолитической болезнью плода и новорожденного позволит: снизить перинатальные потери, изменить структуру заболеваемости гемолитической болезнью за счет уменьшения частоты развития тяжелой (отечной) формы, снизить частоту преждевременных родов (до 36 нед), уменьшить количество маловесных детей (менее 2000 г), уменьшить частоту и кратность применения операции ЗПК у новорожденных с ГБ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Этиология гемолитической болезни новорожденных Гемолитическую болезнь новорожденных по этиологическому фактору, вызвавшему заболевание, можно разделить на:

1. связанную с несовместимостью по резус-фактору и его типам;

2. связанную с несовместимостью по групповым факторам системы ABO;

3. связанную с несовместимостью по другим групповым факторам крови.

Из известных на сегодняшний день 23 антигенных систем эритроцитов наибольшее значение для клинической практики имеют системы ABO (001) и резус (004).

Совместимость по этим двум системам в обязательном порядке учитывается при каждой трансфузии. Антигены групп крови передаются по наследству в соответствии с хромосомной теорией и по законам наследственности Менделя.

Система — резус (004)

Одна из наиболее комплексных систем групп крови, объединяющая 45 антигенов, обозначаемых номерами от RH1 до RH51 (из них 6 антигенов отсутствуют), которые наследуются и не меняются в течении всей жизни. Антигены системы резус, имеющие наибольшее значение — D, C, E, c, e — кодируются двумя высокогомологичными, тесно связанными генами, расположенными на коротком плече 1-й хромосомы. Ген RHD контролирует продукцию D-антигена, ген RHCE — образование антигенов Cc, Ee.

Открытие антигенов системы резус относится к 1939 году, когда Levine and Stetson изучали причины возникновения гемолитических реакций у женщин, разрешившихся мертвым плодом, при трансфузии им крови мужей.

Сыворотка у 80% женщин агглютинировала перелитые им эритроциты полностью идентичные по системе ABO, MN и P. Они предположили, что матери были иммунизированы каким-то неизвестным фактором, находящимся на эритроцитах плода, послуживших причиной образования антител.

Эритроциты всех людей делятся по наличию в фенотипе антигенов D на Rh+(D+) и Rh-(D-).

Rh (-) это лица, у которых имеется делеция гена RHD, а парные аллели гена не выявляются. Парные антигены C и c, E и e кодируются вторым геном в общем комплексе локуса резусных антигенов, т.к. не выявлено рекомбинаций между D, Cc, Ee. Аллели, наследуемые, как гаплотипы, обозначаются Dce, DCE, dce и т. д. Следует особо подчеркнуть, что d означает отсутствие антигена D.

При серологических исследованиях зачастую невозможно определить истинный генотип индивидуума, и выявляют только фенотипы. При оценке резус-принадлежности доноров к резус+ причисляют всех лиц, эритроциты которых содержат антигены D, C, E. Резус — называют доноров, эритроциты которых не содержат ни одного из данных антигенов.

Такая оценка резус-принадлежности позволяет избежать возможности сенсибилизации реципиента к любому из этих антигенов, обладающих высокой иммуногенной активностью.

Частота резус+ лиц составляет 85% среди европейской популяции. Встречаемость других антигенов: C-70%, E-30%, c-85%, e-97%.

Ряд антигенов Rh-Hr не имеют своих аллелей, а представляют собой разновидность антигенов, образующихся в результате мутации соответствующего гена. Наибольшее клиническое значение имеет вариант антигена Rh₀ (D)-D^u, который встречается в 1.5% случаев среди Rh+ лиц. Он является иммуногенным для Rhлиц. В то же время переливание эритроцитов, содержащих Rh₀(D) антиген реципиентам, эритроциты которых содержат фактор D^u, может сенсибилизировать их к антигену D. Во избежание таких осложнений доноров, имеющих D ^u причисляют к резус+, а реципиентов — к резус-. Фактор D ^u в комбинации с двумя другими антигенами — CD^ue, cD ^uE встречается у 1.5% лиц, а cD ^ueу 0.5%. Встречаются варианты антигенов C, E, c, e, которые обозначаются C _u, E _u, E _w, C _w, e _x,имеют неизмеримо меньшее значение.

Редко встречаются лица, эритроциты которых не содержат ни одного из антигенов системы резус. Такой фенотип обозначают как Rh null. Считается, что они имеют ген Xr ₀ в гомозиготной форме, который подавляет выработку всех антигенов системы резус. Не проявляя фенотипически резус-антигены, лица с фенотипом Rh null могут передавать их по наследству.

Антитела против антигенов резус — иммунные, появляются вследствие изосенсибилизации. Их специфичность обусловливают антигены, являющиеся причиной их образования. Различают полные и неполные антитела. Полные резус-антитела относятся преимущественно к Ig M, имеют большой молекулярный вес, встречаются реже, следовательно, имеют меньшее значение при трансфузии, чем неполные антитела.

Полные антитела способны непосредственно без предварительной подготовки склеивать резус+ эритроциты в пробирке. Неполные антитела относятся к Ig G, они фиксируются на резус+ эритроцитах, не вызывая агглютинацию. Она происходит лишь в присутствии протеолитических ферментов, коллоидных растворов или после предварительной обработки специальной антиглобулиновой преципитирующей сывороткой. Неполные антитела обладают значительно меньшим, чем полные, молекулярным весом, легко проходят через неповрежденную плаценту. При сенсибилизации к антигенам сначала образуются полные антитела, затем они трансформируются в неполные. При переливании резус+ эритроцитов лицам с противорезусными антителами возникают посттрансфузионные реакции гемолитического типа. Более 90% осложнений связано с резус несовместимостью донора и реципиента по антигену Rh ₀(D).

Среди антигенов системы резус трансфузионно опасным является также антиген hrґ©. Частота встречаемости 80−82%. Эритроциты 18−20% людей не содержат этот антиген и являются гомозиготами по аллельному гену C. Это группа высокого риска аллоиммунизации и возникновению посттрансфузионных осложнений, т.к. им в 80% случаев переливают эритроциты с hrґ© антигеном.

В 1939 г. Левин и Стетсон выяснили, что система Rhesus связана с тяжелым заболеванием новорожденных. Уже в 1941 г. они обнаружили связь между Rh-фактором и гемолитической болезнью новорожденных (фетальный эритробластоз), возникающей при иммунизации Rh (-) матери Rh (+) плодом. В силу того, что иммунные антитела анти-Rh являются иммуноглобулинами класса G, относительно небольшой размер, которых позволяет проникать через плацентарный барьер, иммунизация материнского организма ведет к гемолитической болезни новорожденного (ГБН). Острота иммунологического конфликта возрастает с каждой последующей беременностью, любым оперативным вмешательством, приводя к более тяжелой форме гемолитической болезни ребенка и возможной внутриутробной гибели плода. Более высокая частота возникновения ГБН на почве Rh-конфликта наблюдается у матерей с группой крови A по сравнению с женщинами, имеющими группу крови 0 системы AB0. В настоящее время иммунизацию матери предотвращают с помощью введения анти-D-иммуноглобулина в первые 12 часов после родов, которая разрушает D-положительные клетки плода в кровотоке матери.

Антигены групп крови Rhesus представляют собой белки в комплексе с липидами. При удалении липидов с мембраны антигенные свойства утрачиваются. Антигены системы Rhesus достаточно хорошо выражены на всех этапах онтогенеза. Установлено, что наименьший плод, в эритроцитах которого обнаружены Rh-антигены, имел возраст 8 недель.

Система ABO (001)

Первая эритроцитарная система антигенов, открыта венским ученым Ландштейнером в 1900 году (Lansteiner, 1900).

Определение групп крови по данной системе основывается на наличии в эритроцитах группоспецифических антигенов (A, B, O), а в сыворотке — изоиммунных антител: анти-A (б) и анти-B (в).

Антигены ABO составляют триаллельную систему антигенов. Группоспецифические антигены — A, B, O — генетически обусловлены. Формирование антигенов A, B и O связано с действием генов на субстанцию H, которая является их предшественником. Один из трех аллельных генов передается от матери, другой — от отца. Генетически возможно 6 комбинаций аллельных антигенов — OO, AO, AA, BO, BB, AB. Фенотипически различают 4 группы крови, т.к. гетерозиготы и гомозиготы причисляются к одной группе крови, поскольку не обладают различными свойствами.

Принято буквенно-цифровое обозначение групп крови — O (I), A (II), B (III), AB (IV). Но, в настоящее время, в связи с рекомендацией ISBT, 1980 внедряется буквенное обозначение — O, A, B, AB. Группа крови в течении всей жизни не меняется.

У лиц I группы крови эритроциты всегда гомозиготны, содержат антиген O. Эритроциты IV группы содержат антиген AB и всегда гетерозиготны. Клетки II и III групп крови могут быть гомозиготными AA, BB и гетерозиготными AO, BO.

Особенностью системы ABO является наличие в плазме людей естественных (не иммунных) антител к отсутствующему на эритроцитах антигену — анти-A и анти-B.

У подавляющего большинства людей антигены ABO выражены на эритроцитах достаточно хорошо, что позволяет при наличии реагентов (антисывороток) соответствующего качества и направленности уверенно их идентифицировать. Антигены A и B могут быть представлены в виде нескольких вариантов. Для клинической практики преимущественное значение имеют варианты A1 и A2. «Слабые» варианты антигена A встречаются чаще и количество их разновидностей больше, чем антигена B (таблица 1).

Таблица 1 — Частота встречаемости подгрупп антигенов A и B (среднеевропейская популяция)

Эритроциты A1 содержат антигены A и A1, а эритроциты A2 — A и H. Эритроциты A1 обладают более агглютинирующими свойствами по отношению к б — антителам. Различия между A1 и A2 делят на качественные и количественные. Качественные определяются тем, что ДНК гена A1 отличается от ДНК гена A2 одной 156-й позицией, где АМК пролин заменена на лейцин. Количественные различия зависят от %-ого содержания антигенов A и H на эритроцитах. Это определяет агглютинирующую способность эритроцитов лиц с группой крови A2 и A2B и иммуногенность при гемотрансфузиях. A2 встречается у 1−9% лиц с группой крови A и 0.64−25% с группой крови AB.

При исследовании крови новорожденных детей и детей первого года жизни для идентификации вариантов антигенов A необходимо использовать высокочувствительный гелевый тест или эритротест анти-A1, т.к. эритроциты таких детей в силу их физиологической незрелости часто показывают мелкую агглютинацию со стандартными сыворотками, даже если ребенок имеет группу крови A1 или A1B.

В 1930 году Lansteiner и Levine опубликовали данные о наличии еще одного субварианта антигена A, который назвали Aint, т.к. он занимает промежуточное положение между A1 и A2. Уровень антигена H у Aint был выше, чем у A2. Антиген Aint более характерен для негроидной расы — 8.5%, у европеоидов в 1% случаев.

В очень редких случаях эритроциты не содержат ни один из антигенов системы ABO. Фенотип таких эритроцитов — «Бомбей» обусловлен генотипом hh. Отсутствию H-антигена способствует репрессирование генов, ответственных за выработку антигенов системы ABO, одновременно у этих лиц выявляются б и в агглютинины.

Антитела против антигенов системы ABO.

Особенность системы ABO в том, что в плазме у неиммунных лиц имеются естественные, нормальные антитела к отсутствующему на эритроцитах антигену: O группы — антитела к A, B; A группы — к антигену B; B группы — к антигену A; AB группы — O.

Естественные антитела — полные холодовые изогемагглютинины, относящиеся к классу Ig M. Способность к их выработке передается по наследству. Уровень этих антител колеблется в течении всей жизни — он низок у новорожденных детей, снижен при некоторых гематологических заболеваниях, при иммуносупрессиях.

Кроме естественных антител существуют иммунные антитела против антигенов системы ABO, образующиеся при трансфузии ABO несовместимых эритроцитов, что приводит к развитию различных гемолитических реакций и (или) осложнений (ДВС-синдром, почечная недостаточность, смерть). Иммунные антитела относятся к IgG, которые существуют в полной и неполной форме. Они выявляются непрямой пробой Кумбса. Могут иметь более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой средой.

Следует отметить, что рождение ребенка с резус-положительной кровью, не совместимой с кровью матери по системе АВ0, снижает возможность иммунизации. Механизм этого действия до конца не ясен. Возможно, защитное действие связанно с клональным соревнованием за антиген. Существует гипотеза, что суть этого механизма состоит в разрушении групповыми антителами несовместимых клеток в местах ретикулоэндотелиальной системы, где нет иммунокомпетентных клеток.

Система Келл-Челанд (006)

Включает три пары антигенов — Kk, Kp ^aKp, Js ^aJs ^b.

Наибольшее значение имеет фактор Келл (K) — у 10% лиц, в гомозиготном состоянии — у 0.3% лиц.

Иммуногенная активность антигена K несколько ниже антигенов системы резус. Сенсибилизация к фактору K может быть причиной гемолитической болезни новорожденных, также аутоиммунной гемолитической анемии. В настоящее время скрининг на антиген K проводится у всех доноров крови.

Келл+ компоненты крови в лечебную сеть не выдают. Донору с антигеном Келлпредлагают донорство плазмы. Антитела анти-К — иммунные, относятся к Ig M, которые фиксируют комплемент. нты ковиноров Система Левис (007)

Представлена рядом плазменных факторов, адсорбирующихся на эритроцитах из плазмы. Антигены Левис обнаруживаются в плазме, слюне, на лейкоцитах и др. Система Левис включает и антигены — Le^a, Le ^b,Le ^c, Le ^d. Антигены Le связаны с группой крови ABO. Люди с антигенами Le ^b и Le ^d являются выделителями групповых веществ A, B, H, которые образуются в слюне и других жидкостях. При отмывании эрироцитов физиологическим раствором или инкубации при t 37 ⁰C антигены Levis легко удаляются с их поверхности. При изосенсибилизации к факторам Le ^a, Le ^b образуются холодовые антитела (Ig M), обусловливающие развитие посттрансфузионных осложнений.

Система Даффи (008)

Включает два аллельных антигена — Fy ^a, Fy ^b. Они образуют 3 фенотипа. Гомозиготные особи с фенотипом Fy ^a Fy ^a встречаются в 17% случаев, а Fy ^b Fy ^b — в 34%. Гетерозиготы Fy ^aFy ^b — 48%. Фактор Fy ^a более иммуногенен, чем Fy ^b. Антитела к Fy ^a— иммунные, относятся к Ig G, образуются при сенсибилизации к этому фактору. При несовместимости по фактору Fy ^a возможно развитие осложнений.

Система Кидд (009)

Кодируется двумя аллельными генами Jk ^a и Jk ^b. Антигены Jk ^a и Jk^b

Встречаются одинаково часто у 75% лиц. Частота гомозигот — 25%. Оба иммуногенно активны. Изосенсибилизация к антигену Jk носит сопутствующий характер и антиJkантитела встречаются в сочетании с антителами антиRh ₀ (D), антиrhґ, анти-K и др.

Система Диего (010)

Малоизученная система эритроцитарных антигенов. Известно 2 аллельных антигена Di ^a и Di ^b. Для европеоидов антиген Di ^a в гемотрансфузии относительно не имеет большого значения, т.к. отсутствует практически у всего белого населения. Сенсибилизация к антигенам системы Диего возможна при трансфузии и беременности. Антитела выявляются в непрямой пробе Кумбса.

Система H (018)

Включает антиген H, который является общим предшественником группоспецифических факторов A, B, O. Ген, кодирующий образование H-антигена, расположен на 19-й хромосоме в локусе FUT ¹. Ген H с очень высокой частотой встречается во всех популяциях и, следовательно, на эритроцитах большинства людей экспрессируется антиген H. Лица, эритроциты которых не содержат Hантиген, являются гомозиготами hh.

H-антиген присутствует в жидкостях, секретах и выделениях 80% лиц, называемых ABH-секреторами. Одновременно с H-антигеном у лиц, эритроциты которых идентифицируются как клетки A, B или AB антигены. Выделительство контролируется 2 парами аллельных генов SE и se, расположенных на 19-й хромосоме в локусе FUT ², который тесно сцеплен с локусом FUT ¹.

Ген SE доминантный по отношению к se. Лица гомозиготы по гену se не являются «выделителями» (нет факторов A, B, H). Клиническое значение «выделительства» обусловлено наличием у 80% людей в плазме крови или сыворотке групповых антигенов, аналогичных на эритроцитах. При несоблюдении этих правил иногруппное введение плазмы, относящейся к «выделителям», может привести к осложнениям.

Система Ii

Взрослые индивидуумы в норме содержат один антиген I и некоторое количество антигенов i, которые присущи эритроцитам эмбриона человека. В первые месяцы жизни антигены i заменяются на антигены I и через 18 месяцев как у взрослых дивидуумы в норме содержат один антиген отке групповых антигенов, аналогичных Антигены I присутствуют на эритроцитах, лейкоцитах, в плазме, секретах организма.

Анти-I-антитела — полные, холодовые аутогемагглютинины, в основном Ig M, реже неполные. Изоиммунизация выявляется редко у лиц, не содержащих этого антигена. Аутоиммунизирующие антитела могут быть в очень высоких титрах и обуславливать болезнь холодовых антител.

Анти-i-антитела всегда аутоиммунной природы. Анти-I,-i-антитела выявляются методами солевой агглютинации, непрямой пробой Кумбса, с анти-IgM глобулиновой или противокомплементарной сывороткой.

К часто встречаемым относятся антигены Vel, Ge, Lan, San, к редко встречаемым Wp ^a, B ^I, B ^j, Bp ^a [9,11].

1.2 Патогенез гемолитической болезни новорожденных Эритроциты плода регулярно обнаруживают в кровотоке матери, начиная с 16−18 нед. беременности. Непосредственно перед родами фетальные эритроциты можно найти в крови 75% беременных, но обычно количество их небольшое — 0.1−0.2 мл. Наиболее выраженная трансплацентарная трансфузия происходит во время родов — 3−4 мл крови плода. Проникшие в кровоток матери эритроциты плода, имеющие D-антиген, отсутствующий у матери, приводят во время первой беременности к синтезу вначале Rh-антител, относящихся к иммуноглобулинам класса M, которые через плаценту не проникают, а затем и антител класса IgG, которые уже могут проникать через плаценту. При первой беременности иммунизируются 10% женщин, а при последующих беременностях риск иммунизации также составляет 10%.

Во время беременности и из-за малого количества эритроцитов плода и из-за активных иммуносупрессорных механизмов первичный иммунный ответ у матери снижен, но после рождения ребенка и в связи с большим количеством эритроцитов ребенка в кровотоке матери, проникших в родах, и из-за снятия иммуносупрессии происходит активный синтез резус-антител. Поэтому введение экзогенных резус-антител в течение 24−72 часов после родов или аборта — эффективный метод снижения резус-сенсибилизации и частоты резус-ГБН.

Не всегда имеется соответствие между титром резус-антител и тяжестью ГБН. Причинами этого могут быть:

— неодинаковая чувствительность резус-отрицательных женщин к резус-фактору, что объясняется генотипическими структурными особенностями самого резус-фактора;

— имеет значение характер реактивности организма матери и его способность вырабатывать антитела;

— огромную роль играет индивидуальная особенность сосудистой системы плаценты, определяющая возможность проникновения эритроцитов плода в кровоток матери (этому способствуют инфекционные болезни матери, гестозы беременности);

— определенное влияние оказывают повторные трансфузии крови женщине без строгого учета резус-принадлежности.

Еще более непросто объяснить патогенез конфликта по ABO-системе антигенов. Проще понять, почему не в каждом случае несовместимости по группе возникает ГБН. Естественные антитела у 0(I)группы женщин-би в-агглютинины — крупномолекулярные, относятся к IgM и через плаценту не проникают. Иммунные анти-А и анти-В антитела, проникающие через плаценту и обусловливающие положительную прямую пробу Кумбса-IgG (они не агглютинируют эритроциты, а блокируют их, т. е. сенсибилизируют). Поэтому у 15−20% детей, имеющих Аили В-антигены, отсутствующие у матери, в пуповинной крови выявляют слабо положительную прямую реакцию Кумбса. Но только примерно у 10% детей разовьется ГБН.

Причина этого неясна. Вероятно, это можно объяснить предохранительными механизмами у плода. Основную барьерную функцию выполняет плацента, где групповые антитела матери связываются антигенами амниона.

Для развития ГБН, обусловленной групповой несовместимостью, необходим ряд условий, идентичных таковым при резус-конфликте.

Механизм изоиммунизации при ГБН по АВО-несовместимости тот же, что и при Rh-конфликте. Но существуют определенные отличия:

В норме в сыворотке матери есть б-агглютинин (1:64−1:128) и в-агглютинин (1:16—1:64), которые могут проникать в плод. Rh-антител нет в норме ни у матери, ни у плода. Ткани плода содержат «А" — или «B"-вещество, которое обычно нейтрализует анти-А и анти-В-антитела. Rh-антитела таким антигеном не нейтрализуются, вследствие этого ГБН при АВО-несовместимости развивается без предварительной сенсибилизации, а при Rh-конфликте нужна предварительная сенсибилизация предыдущей беременностью или трансфузиями крови.

При АВО-несовместимости страдают дети от первой беременности, кроме того титр антител не увеличивается при последующих беременностях. Это связано с тем, что антигены плода, проникая в организм матери, вступают в связь с несовместимыми групповыми изоантителами. В случаях одновременной Rhи АВО-несовместимости редко возникает ГБН по резус-конфликту, т.к. резус-положительные эритроциты плода в кровотоке матери сразу разрушаются нормальными би в-антителами, не вызывая ее сенсибилизацию.

Кроме того, организм матери может сенсибилизироваться редкими антигенами систем М, N, K (Kell), Fy (Duffy), Levis и др. Вследствие сенсибилизации этими антигенами у ребенка может развиться ГБН, в связи с чем важным для клиницистов является изучение особенностей гемолитической болезни в зависимости от этиологического фактора [8,15,16].

Основным повреждающим фактором при ГБН является осложнение повышенного гемолиза — гипербилирубинемия с неконъюгированным билирубином (НБ).

Гемолиз эритроцитов при ГБН происходит в макрофагах печени, селезенки, костного мозга, а при тяжелых формах заболевания может быть внутрисосудистым. Неполные антиэритроцитарные антитела, IgG, повреждают мембрану эритроцита, приводя к повышению ее проницаемости и нарушению обмена веществ в эритроците. Эти измененные под действием антител эритроциты активно захватываются макрофагами перечисленных органов и преждевременно гибнут. Образующееся большое количество НБ, поступающее в кровь, не может быть выведено печенью, и развивается гипербилирубинемия. Если гемолиз не слишком интенсивен при небольшом количестве материнских антител, печень активно выводит НБ, и у ребенка в клинике доминирует анемия при отсутствии или минимальной выраженности желтухи. Считается, что если антиэритроцитарные антитела проникали к плоду длительно и активно в течение беременности до начала родовой деятельности, то развиваются внутриутробная мацерация плода или отечная форма ГБН. В большинстве случаев плацента предотвращает проникновение аллоиммунных антител к плоду. В момент родов барьерные свойства плаценты резко нарушаются, и материнские изоантитела поступают к плоду, что и обусловливает, как правило, отсутствие желтухи при рождении, появлении ее в первые часы и дни жизни. Антитела могут поступать к ребенку с молоком матери, что увеличивает тяжесть ГБН.

Свойства свободного БР

— Высокая токсичность вызывает разрушение мембран клеток.

— Липофильность легко проникает внутрь митохондрий, вызывая разобщение окисления и фосфорилирования —> при проникновении в клетки ганглиев головного мозга нарушает функции ЦНС (патогенез ядерной желтухи).

— Образует комплексы с альбумином и другими белками —> резкое снижение биологической активности.

— Может вытесняться с молекулы альбумина лекарственными веществами, свободными жирными кислотами или др. — токсическое действие БР возрастает.

Не всегда имеется прямая связь между выраженностью желтухи и содержанием БР в крови. На проявления желтухи влияют особенности липидного, белкового обмена и другие факторы.

Непрямой билирубин токсичен для всех клеток, но особенно клеток, содержащих липиды. Очень богаты липидами клетки ЦНС, в которых НБ подавляет окислительные процессы и нарушает жизнедеятельность, с чем связано развитие «ядерной желтухи». Возникновение ядерной желтухи зависит от уровня НБ в крови: так, при НБ в сыворотке крови 428−496 мкмоль/л она развивается у 30% доношенных детей, а при 518−684 мколь/л — у 70%. Однако, билирубиновая энцефалопатия может возникать и при гораздо меньшем уровне НБ в крови, например, у недоношенных со сроком гестации менее 28 нед даже при гипербилирубинемии 171−205 мкмоль/л.

Факторами риска билирубиновой энцефалопатии и реализации нейротоксичности НБ считаются:

1) повреждающие гематоэнцефалический барьер и повышающие его проницаемость — тяжелый респираторный ацидоз, кровоизлияния в мозг и его оболочки, нейроинфекция, артериальная гипертензия;

2) повышающие чувствительность нейронов к токсическому действию НБ — недоношенность, тяжелая асфиксия (особенно гиперкапния), гипотермия, голодание, гипогликемия, анемия;

3) снижающие способность альбуминов прочно связывать НБ — недоношенность, гипоальбуминемия, ацидоз, инфекции, гипоксия, лекарства — сульфаниламиды, фуросемид, дифенин и диазепам и др.

Прогрессирующая анемия (за счет гемолиза) в основном развивается в случаях ГБН по lye-системе. Судьба плода зависит от быстроты развития анемии, т. е. от взаимоотношения между интенсивностью усиления гемолиза и компенсаторным кроветворением с активацией экстрамедуллярных очагов и выведения незрелых эритроцитов. В случае понижения уровня гемоглобина до величин, несовместимых с жизнью, наступает внутриутробная гибель или ребенок погибает вскоре после извлечения.

Анемия стимулирует синтез эритропоэтина. Когда образование в костном мозге эритроцитов не может компенсировать их разрушение, возникает экстрамедуллярное кроветворение в печени, селезенке, почках, плаценте и слизистой оболочке кишечника плода. Это приводит к обструкции портальной и пуповинной вен, портальной гипертензии, нарушению белоксинтезирующей функции печени. Снижается коллоидное осмотическое давление крови, результатом чего является отек.

Изучается роль гиперчувствительности замедленного типа в патогенезе ГБН. Вероятно, у части детей, в патогенезе участвуют материнские сенсибилизированные лимфоциты, проникшие в кровоток плода. Полагают, что отечная форма ГБН обусловлена материнскими Т-киллерами, вызвавшими реакцию «трансплантат против хозяина», и материнскими антителами к тканям плода [3, 5].

1.3 Классификация ГБН Классификация ГБН предусматривает установление:

1) вида конфликта (резус, АВО-, другие антигенные системы);

2) клинической формы (внутриутробная смерть плода с мацерацией, отечная, желтушная, анемическая);

3) степеней тяжести при желтушной и анемической формах (легкой, средней тяжести, тяжелой);

4) осложнений (билирубиновая энцефалопатия, ядерная желтуха, геморрагический синдром или синдромы поражения печени, сердца, почек, надпочечников, синдром «сгущения желчи»);

5)сопутствующих заболеваний и фоновых состояний (недоношенность, внутриутробные инфекции, асфиксии и др.)

Классификация ГБН

1. Время возникновения:

а) врожденная;

б) постнатальная.

2. По этиологии:

а) RH-конфликт;

б) АВО-несовместимость;

в) редкостные факторы.

3. Клиническая форма:

а) внутриутробная смерть плода с мацерацией;

б) отечная;

в) желтушная;

г) анемичная.

4. Степень тяжести:

а) легкая (без ОЗПК);

б) среднетяжелая (1 ОЗПК);

в) тяжелая (2 и более ОЗПК).

5. По течению:

а) острое (несколько часов, проникновение антител к плоду интранатально);

б) подострое (1−3 дня, проникновение антител к плоду перед родами);

в) субхроническое (врожденная, внутриутробно, задолго до родов).

6. Осложнения: анемия, билирубиновая энцефалопатия, токсический гепатит, синдром «сгущения желчи», геморрагический синдром, миокардиодистрофия, надпочечниковая недостаточность.

7. Периоды:

а) острый;

б) восстановительный;

в) остаточных явлений.

1.4 Клиническая картина ГБН Отечная форма — наиболее тяжелое проявление резус-ГБН. Типичным является отягощенный анамнез матери — рождение предыдущих детей в семье с ГБН, выкидыши, мертворождения, недонашиваемость, переливания резус-несовместимой крови, повторные аборты. При ультразвуковом исследовании плода характерна поза Будды — голова вверху, нижние конечности из-за бочкообразного увеличения живота согнуты в коленях, необычно далеко расположены от туловища; «ореол» вокруг свода черепа. Из-за отека значительно увеличена масса плаценты. В норме масса плаценты составляет 1/6—1/7 массы тела плода, но при отечной форме это соотношение доходит до 1/3 и даже 1/1. Ворсинки плаценты увеличены, но капилляры их морфологически незрелые, аномальные. Характерен полигидроамнион. Как правило, у матерей имеется тяжелый гестоз в виде преэклампсии, эклампсии. Уже при рождении у ребенка имеются: резкая бледность (редко с иктеричным оттенком) и общий отек, особенно выраженный на наружных половых органах, ногах, голове, лице; резко увеличенный в объеме бочкообразный живот; значительные гепато-и спленомегалия (следствие эритроидной метаплазии в органах и выраженного фиброза в печени); расширение границ относительной сердечной тупости, приглушение тонов сердца. Асцит, как правило, значительный даже при отсутствии общего отека плода. Отсутствие желтухи при рождении связано с выделением НБ плода через плаценту и его разведением за счет гиперволемии. Очень часто сразу после рождения развиваются расстройства дыхания из-за гипопластических легких или болезни гиалиновых мембран. Причину гипоплазии легких видят в приподнятой диафрагме при гепатоспленомегалии, асците. Нередок у детей с отечной формой геморрагический синдром (кровоизлияния в мозг, легкие, желудочно-кишечный тракт). У меньшей части этих детей выявляют ДВС-синдром, но у всех — очень низкий уровень в плазме крови прокоагулянтов, синтез которых осуществляется в печени.

Характерны: гипопротеинемия (уровень белка сыворотки крови падает ниже 40—45 г/л), повышение уровня в пуповинной крови БДГ (а не только НБ), тяжелая анемия (концентрация гемоглобина менее 100 г/л), разной степени выраженности нормобластоз и эритробластоз, тромбоцитопения. Анемия у таких детей бывает настолько тяжелой, что в сочетании с гипопротеинемией, повреждением сосудистой стенки может привести к сердечной недостаточности. Оказалось, что при рождении у детей с отечной формой ГБН объем циркулирующей крови — обычный и гиперволемия отсутствует. Гипоальбуминемию связывают с утечкой альбумина и воды из крови в интерстиций тканей, хотя у отдельных детей возможен и дефицит его синтеза печенью. У большинства больных дефицита синтеза альбумина нет, ибо, как только восстанавливается нормальный диурез (что бывает у выживших на 2—3-й день жизни), так и нормализуется уровень альбуминов крови. Одним из патогенетических факторов асцита, накопления жидкости в плевральной полости считают снижение дренажной функции лимфатической системы.

У выживших после активного лечения детей с врожденной отечной формой ГБН (около половины таких детей умирают в первые дни жизни) нередко развиваются тяжелые неонатальные инфекции, цирроз печени, энцефалопатии.

Иногда довольно выраженный отек развивается у ребенка с ГБН через несколько дней после рождения. Прогноз у таких больных при адекватном лечении всегда благоприятен, но в этих случаях надо диагностировать не отечную форму ГБН, а желтушно-анемическую форму ГБН, осложнившуюся отечным синдромом.

Желтушная форма — наиболее часто диагностируемая форма ГБН. У части детей желтуха имеется уже при рождении (врожденная желтушная форма), у большинства она появляется в первые сутки жизни. Чем раньше появилась желтуха, тем обычно тяжелее течение ГБН. При врожденной желтушной форме у ребенка часты инфекционные процессы (внутриутробные или неонатальные). При тяжелых послеродовых формах резус-ГБН желтуха появляется в первые 6—12 ч жизни, а при средней тяжести и легких — во 2-й половине первых суток жизни. При АВО—ГБН желтуха появляется на 2—3-й день жизни и даже позже. Интенсивность и оттенок желтухи постепенно меняются — вначале апельсиновый оттенок, потом бронзовый, затем лимонный и, наконец, цвет незрелого лимона. Характерны также увеличение печени и селезенки, желтушное прокрашивание склер, слизистых оболочек, нередко наблюдается пастозность живота.

По мере повышения уровня НБ в крови дети становятся вялыми, адинамичными, плохо сосут, у них снижаются физиологичные для новорожденных рефлексы, появляются другие признаки билирубиновой интоксикации. При анализе крови выявляют разной степени выраженности анемию, псевдолейкоцитоз за счет увеличения количества нормобластов и эритробластов, нередко тромбоцитопению, реже лейкемоидную реакцию. Значительно повышено и количество ретикулоцитов (более 7%). Корреляционной связи между выраженностью гипербилирубинемии и анемии нет, что подчеркивает важную роль в генезе повышения уровня НБ нарушения функционального состояния печени.

Хотя степень иктеричности кожи и отражает выраженность гипербилирубинемии, но, к сожалению, не всегда. Вместе с тем желтушность ладоней (проверять после надавливания пальцем исследователя) обычно бывает при уровне НБ более 257 мкмоль/л. И все же ориентироваться в оценке выраженности гипербилирубинемии лишь на цвет кожных покровов, в том числе и при пользовании билирубинометром, нельзя. В то же время с помощью билирубинометра можно выявить детей с уровнем билирубина более 205 мкмоль/л, т. е. с патологической желтухой, но после этого совершенно необходимо определение уровня билирубина в крови биохимическим методом.

Билирубиновая энцефалопатия (БЭ) клинически редко выявляется в первые 36 ч жизни, и обычно ее первые проявления диагностируют на 3—6-й день жизни. Характерны 4 фазы течения:

1) доминирование признаков билирубиновой интоксикации — вялость, снижение мышечного тонуса и аппетита вплоть до отказа от пищи, бедность движений и эмоциональной окраски крика (монотонный крик), неполная выраженность рефлекса Моро (есть только первая его фаза), срыгивания, рвота, патологическое зевание, «блуждающий взгляд»;

2) появление классических признаков ядерной желтухи — спастичность, ригидность затылочных мышц, вынужденное положение тела с опистотонусом, «негнущимися» конечностями и сжатыми в кулак кистями; периодическое возбуждение и резкий «мозговой» крик, выбухание большого родничка, подергивание мышц лица или полная амимия, крупноразмашистый тремор рук, судороги; симптом «заходящего солнца»; исчезновение рефлекса Моро и видимой реакции на сильный звук, сосательного рефлекса; нистагм, симптом Грефе; остановки дыхания, брадикардия, летаргия, иногда повышение температуры тела;

3) период ложного благополучия и исчезновения спастичности (начиная со 2-й недели жизни), когда создается впечатление, что обратное развитие неврологической симптоматики приведет к почти полной реабилитации ребенка;

4) период формирования клинической картины неврологических осложнений начинается в конце периода новорожденности или на 3—5-м месяце жизни: детский церебральный паралич; атетоз, хореоатетоз, параличи, парезы; глухота; задержка психического развития; дизартрия и др. Летальный исход как следствие поражения мозга может быть как в 1-ю, так и во 2-ю из названных фаз БЭ и возникает на фоне появления геморрагического синдрома, расстройств сердечной деятельности и дыхания. Отмечено, что не всегда у новорожденных, особенно недоношенных, с диагностированной на секции ядерной желтухой, клинически были классические ее признаки. Считается, что в первой фазе БЭ поражение мозга в принципе обратимо.

К сожалению, все клинические симптомы первой фазы БЭ неспецифичны, а потому разрабатывают инструментальные подходы к ее диагностике. В частности, предлагают для этого изучать ответ мозгового ствола (энцефалограмма) на звук разных высот, проводить клиническую оценку ответа ребенка на резкий звук, оценивать ядерно-магнитное изображение мозга.

Анемическая форма диагностируется у 10—20% больных с ГБН. Дети бледные, несколько вялые, плохо сосут и прибавляют массу тела. У них обнаруживают увеличение размеров печени и селезенки, в периферической крови — разной степени выраженности анемию в сочетании с нормобластозом, ретикулоцитозом, сфероцитозом (при АВО-конфликте). Иногда гипорегенераторная анемия, т. е. нет ретикулоцитоза и нормобластоза, что объясняется торможением функции костного мозга и задержкой выхода из него незрелых и зрелых форм эритроцитов. Уровень НБ обычно нормальный или умеренно повышенный. Признаки анемии обнаруживают в конце 1-й или даже на 2-й неделе жизни. В ряде случаев анемия впервые развивается на 3-й неделе жизни и под влиянием внешних факторов — инфекционные заболевания, назначение некоторых медикаментов (сульфаниламиды, нитрофураны, налидоксиновая кислота, парацетамол, витамин К, ацетилсалициловая кислота, антигистаминные препараты, левомицетин, тетрациклин, тиазиды и др.) на фоне естественного вскармливания (потенциальный источник изоантител) может привести к резкому усилению гемолиза и даже развитию ДВС-синдрома. Вероятно, у таких больных под влиянием антител стойко снижена активность глюкозофосфатдегидрогеназы эритроцитов и глутатионредуктазы.

1.5 Диагностика и лечение гемолитической болезни новорожденных Диагностировать тяжелое течение ГБН возможно антенатально. У всех женщин с резус — отрицательной кровью не менее трех раз определяют титр анти-резусных антител. Первое исследование делают при постановке на учет в женскую консультацию. Оптимально далее сделать повторное исследование в 18−20 недель, а в третьем триместре беременности производить исследование каждые 4 недели. Если титр резус-антител 1:16—1:32 и больше, то в 26−28 недель проводят амниоцентез и в околоплодных водах определяют оптическую плотность билирубина. По специальным номограммам оценивают потенциальную тяжесть гемолиза у плода. Наиболее точным методом выявления ГБП и определения степени ее тяжести, начиная с 24 недель беременности, является исследование плодовой крови, полученной путем кордоцентеза (пункция пуповины). Исследование крови плода включает определение группы крови, резус-принадлежности плода, непрямой пробы Кумбса, уровней гемоглобина, гематокрита и билирубина. Наиболее важным диагностическим критерием тяжести ГБП считается величина гематокрита, являющегося показателем компенсаторных возможностей гемопоэза. По степени снижения гематокрита судят о тяжести ГБП.

Современным методом диагностики ГБП, в частности отечной формы, является УЗИ, позволяющее выявить изменение толщины плаценты и размеров плода. Характерными УЗ-критериями отечной формы ГБН являются выраженная плацентомегалия (до6−8см), гепатоспленомегалия, асцит, многоводие. С целью выявления первых признаков УЗИ целесообразно проводить начиная с 18−20-й недели беременности. До этого срока УЗ-признаки, как правило, не определяются.

План обследования при подозрении на ГБН:

1) определение группы крови и резуспринадлежности матери и ребенка;

2) анализ периферической крови ребенка с подсчетом количества ретикулоцитов;

3) динамическое определение концентрации билирубина в сыворотке крови ребенка;

4) иммунологические исследования (прямая проба Кумбса с эритроцитами ребенка и непрямая с сывороткой крови матери, анализ динамики резус-антител, при АВО-несовместимости определяют аллогемагглютинины). План дальнейшего лабораторного обследования включает определение уровня гликемии (не менее 4 раз в сутки в первые 3−4 дня), НБ (не реже 2−3 раз в сутки до начала снижения уровня НБ в крови), гемоглобина, количества тромбоцитов, активности трансаминаз и другие исследования в зависимости от клинической картины [12, 15].

Дифференциальный диагноз проводят с наследственными гемолитическими инфекции, токсоплазмозе.

Лечение гемолитической болезни новорожденных комплексное и направлено, прежде всего, на быстрейшее удаление из организма новорожденного токсических продуктов распада эритроцитов (гемолиза), билирубина и антител, чтобы не продолжался процесс гемолиза после рождения. Внутривенно вводятся дезинтоксикационные растворы, витамины, АТФ, глюкоза. Назначают фенобарбитал, который способствует связыванию и выведению билирубина, энтеросорбенты. Проводят фототерапию лампами синего или голубого цвета. Ребенку необходимо обильное питье, введение витаминов группы В (B1, В2, В6, B12). При неэффективности дезинтоксикационной терапии и при очень быстром нарастании содержания билирубина в крови, при выраженном снижении уровня гемоглобина решают вопрос о проведении заменного переливания крови [1, 7, 10].

1.6 Течение и прогноз ГБН Зависит от формы и тяжести болезни, своевременности и правильности лечения. При отечной форме прогноз часто неблагоприятный. Прогноз для жизни у большинства детей с желтушной формой болезни благоприятный. Необходимо помнить о фазе ложного благополучия при БЭ и всех детей с гипербилирубинемией более 343—400 мкмоль/л направлять в неврологическое отделение для новорожденных или под наблюдение невропатолога для проведения реабилитационных мероприятий, если у них были лишь признаки билирубиновой интоксикации, т. е. первой фазы БЭ. У 5—30% больных с гипербилирубинемией 257—342 мкмоль/л, не имевших отчетливых неврологических расстройств в неонатальном периоде, в дальнейшем развиваются задержки психомоторного развития, астенический синдром, неврозы и другие отклонения от нормы в нервно-психическом статусе. Активная нейротропная терапия таких больных, начатая в неонатальный период, значительно улучшает отдаленный неврологический прогноз. У детей, перенесших желтушную форму ГБН, отмечают высокую инфекционную заболеваемость на 1-м году жизни.

Течение АВО-ГБН, как правило, более легкое, чем резус-ГБН: практически не встречается отечная форма, чаще бывает анемическая и легкой и средней тяжести желтушные формы. Однако при АВО-ГБН возможно развитие внутрисосудистого гемолиза с ДВС-синдромом, ядерной желтухи.

В раннем неонатальном периоде у детей с ГБН наиболее частым осложнением является гипогликемия, более редкими — отечный, геморрагический, кардиопатический синдромы и синдром сгущения желчи.

В возрасте 1—3 месяца у детей, которым проведено заменное переливание крови в связи с ГБН, может развиться нормохромная, гипоили норморегенераторная анемия. Патогенез ее связывают с временной недостаточной активностью эритропоэтической функции костного мозга, дефицитами витамина Е и железа.

1.7 Профилактика гемолитической болезни Включает определение у всех беременных группы крови и резус-фактора. Женщин с резус-отрицательной кровью ставят на учет в женской консультации. При этом выясняют, не производилось ли им ранее переливание крови, не рождались ли дети с данным заболеванием, выявляют случаи мертворождения и аборты. Если при первой беременности у предрасположенной женщины сделан аборт или же произошел самопроизвольный выкидыш, не позднее 72 часов (двух-трех суток) необходимо сделать инъекцию антирезусного иммуноглобулина.

Регулярно проводится исследование крови на резус-антитела, и при быстром нарастании их в крови беременных направляют на лечение с использованием анти-D-глобулина (антирезусного). Беременных с резус-отрицательной кровью госпитализируют и за две-три недели до предполагаемого срока производят искусственную стимуляцию родов, так как после 36-й недели активизируется переход антител от матери к плоду через плаценту. Этот метод желателен для предупреждения формирования тяжелой гемолитической болезни у новорожденного.

Глава 2. Материалы и методы исследования

Было проанализировано 30 медицинских карт стационарного больного детей, находившихся на стационарном лечении в ГОДКБ в 2008 году в отделении патологии новорожденных (27), отделении анестезиологии и реанимации (3) с гемолитической болезнью новорожденных. Учитывались следующие показатели: пол, место жительства, срок гестации, акушерско-гинекологический анамнез матери, вид изоиммунизации (АВО или Rh), срок появления желтушности кожных покровов, неврологический статус, клиническая форма и степень тяжести заболевания, лабораторные данные, принципы лечения, длительность пребывания в стационаре.

Лабораторное исследование проводилось на базе клинико-диагностической лаборатории ГОДКБ. Проводилось определение уровня билирубина и гликемии сыворотки крови, анализ показателей периферической крови с подсчетом ретикулоцитов и тромбоцитов, исследование групп крови и резус — принадлежности.

2.1 Определение билирубина в сыворотке крови Преданалитический этап:

— липемия и гемолиз сыворотки искажают результаты исследования. Липемия приводит к ошибочно завышенному результату, а гемолиз — к заниженному;

— материалы нельзя держать на свету. Воздействие прямого солнечного света уже к исходу первого часа может снижать на 50% уровень БР (на этом основана фототерапия новорожденных);

— проба должна анализироваться в течение 2 часов с момента взятия при хранении при комнатной температуре в темноте или 12 часов в холодильнике в темноте;

— выражена интерференция лекарств — на общий БР — левомицетин, тетрациклин, аспирин, акрихин; на конъюгированный БР — препараты, вызывающие холестаз, никотиновая кислота, пенициллин, эритромицин и др.

2.1.1 Определение содержания БР и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом по Иендрашику.

Принцип метода: при взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным БР сыворотки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный БР переходит в растворимое диссоциированное состояние и также вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности последнего фотометрически определяют концентрацию общего БР. По разнице между содержанием общего и связанного БР определяют количество свободного.