Это приводит к уменьшению силы тонического сокращения гладких мышц.
Единственный предполагаемый механизм прямой активации фосфатазы РЛЦ миозина связывают с фосфорилированием белка KRP/телокина. Ген этого белка входит в состав гена киназы легких цепей миозина КЛЦМ и имеет ту же рамку считывания [10], что и отражено в двух его названиях — KRP (Kinase Related Protein) и телокин (telos of the kinase, т. е. «хвост» киназы). KRP экспрессируется независимо благодаря наличию собственного промотора в одном из интронов гена КЛЦМ. Он вызывает расслабление скинированных гладкомышечных волокон, которое становится более выраженным в присутствии протеинкиназы G [7].
Показано, что протеинкиназы, А и G фосфорилируют остаток Ser13 KRP/телокина при расслаблении интактных гладких мышц, а искусственная замена Ser13 на аланин отменяет фосфорилирование KRP/телокина и усиливающий эффект протеинкиназы G на расслабление скинированных гладких мышц [7]. Однако, несмотря на кажущуюся изящность, прямые доказательства функционирования этого механизма in vivo пока отсутствуют. Эксперименты, в которых сравнивали способность KRP/телокина и его фосфорилированного по Ser13 варианта расслаблять скинированные гладкомышечные волокна, не выявили различий [1]. Более того, пока не показано ни влияния KRP/телокина на активность фосфатазы РЛЦ миозина, ни прямого взаимодействия этих белков [F. Brozovich, личное сообщение]. В отсутствие положительных ответов на эти вопросы, роль KRP/телокина в активации фосфатазы миозина под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ остается пока спорной.
Таким образом, представляется наиболее вероятным, что роль циклических нуклеотидов и активируемых ими протеинкиназ в подавлении тонического сокращения реализуется путем нейтрализации передачи сигнала от рецепторов к сократительному аппарату клетки на уровне фосфорилирования MYPT и/или Rho белка.
2.5 Регуляция доступности РЛЦ миозина для киназ и фосфатазы.
Результаты последних исследований указывают на наличие еще одного механизма регуляции фосфорилирования миозина, связанного с изменением доступности Ser19 РЛЦ миозина для модифицирующих его ферментов. Основными известными пока регуляторами являются KRP/телокин, который препятствует фосфорилированию РЛЦ миозина, и белок M-RIP (Myosin phosphatase-Rho Interacting Protein), который связывает фосфатазу РЛЦ миозина с сократительным аппаратом и способствует дефосфорилированию миозина.
Первые же функциональные эксперименты показали, что KRP представляет собой миозин-связывающий домен КЛЦМ и конкурирует с ней за связывание с миозином, замедляя фосфорилирование РЛЦ миозина in vitro [6]. Была выдвинута гипотеза о том, что в гладких мышцах KRP действует как специфический антагонист КЛЦМ и снижает общий уровень фосфорилирования РЛЦ миозина, тормозит развитие сокращения и способствует расслаблению [3]. Однако выяснилось, что KRP/телокин лишь незначительно ингибирует развитие первой стадии Са2±зависимого сокращения под действием высокоактивной КЛЦМ [7], но подавляет Са2±независимое фосфорилирование миозина и тоническое сокращение скинированных волокон (рис. 2). Вместе с тем, связывание с миозином действительно необходимо для проявления эффектов KRP, поскольку KRP, лишенный С-концевой миозин-связывающей последовательности не способен ингибировать сокращение (рис.
2). По-видимому, молекулярный механизм действия KRP/телокина связан с экранированием фосфорилируемого Ser19 на РЛЦ миозина не только под действием КЛЦМ, но и других киназ [11]. Чтобы считать этот механизм физиологически значимым, необходимо еще подтвердить его с использованием животных, нокаутированных по KRP/телокину. Такие животные были недавно получены, они имеют повышенный уровень фосфорилирования РЛЦ миозина, нарушения расслабления гладких мышц и общий сократительный фенотип, согласующийся с предполагаемой функцией KRP/телокина [4]. Дальнейшие эксперименты прояснят молекулярные детали этого механизма. M-RIP функционирует как каркасный белок и важный регулятор миозиновой фосфатазы.
Он одновременно взаимодействует с MYPT, белком Rho, Rho-киназой, миозином и, возможно, актином, обеспечивая совместную локализацию этих белков в сократительном аппарате клетки [13]. Молекулярный механизм действия M-RIP пока недостаточно понятен, но ясно, что он не влияет на каталитическую активность PP1c, а улучшает дефосфорилирование миозина, повышая доступность РЛЦ для фосфатазного комплекса. Подавление экспрессии M-RIP в культивируемых гладкомышечных клетках ведет к нарушению Rho-зависимой передачи сигнала к фосфатазе миозина, снижению ее активности и повышению уровня фосфорилирования миозина [7].
Весьма возможно, что KRP/телокин и M-RIP являются не единственными регуляторами, контролирующими доступность РЛЦ миозина для модифицирующих ферментов. Несмотря на скудность информации о малой субъединице фосфатазного комплекса М20, ее также можно рассматривать как потенциального представителя этой группы белков. Считается, что М20 играет роль в закреплении MYPT на миозине, что должно повышать доступность РЛЦ для каталитической субъединицы фосфатазы PP1c [3]. Интересно, что N-концевые последовательности М20, KRP/телокина и белка CPI-17 имеют определенную гомологию и сходное расположение фосфорилируемых регуляторных остатков. Более того, высказано предположение о том, что гены М20 и MYPT имеют тот же принцип организации, что и в случае KRP/телокина и КЛЦМ, т. е. ген М20 расположен внутри гена MYPT, но эти белки экспрессируются назависимо [11]. Дальнейшие исследования должны выявить функциональную значимость такого структурного сходства.
Вопрос о регуляции взаимодействия KRP и M-RIP с миозином в настоящее время остается открытым. Фосфорилирование N-концевых остатков KRP/телокина не влияет на его связывание с миозином, которое опосредует С-концевой домен KRP [5]. Ничего пока не известно и о том, как регулируется связывание M-RIP или М20. Вполне возможно, что регуляторный вклад каждого из этих белков определяется уровнем его экспрессии. Так, содержание KRP/телокина максимально в фазных гладких мышцах и очень низкое в тонических, способных поддерживать сокращенное состояние при низких значениях [Са2+]i и общего уровня фосфорилирования РЛЦ миозина [12]. Есть основания считать, что это совпадение не случайно и физиологические отличия этих мышц, по крайней мере отчасти, связаны с разным содержанием KRP/телокина. Уровень экспрессии М20 также существенно различается в разных тканях [3], но для M-RIP такие данные пока отсутствуют.
Заключение
.
Ближайшие перспективы лекарственной терапии при патологиях, связанных с нарушениями сократимости гладких мышц, связаны с разработкой фармакологических препаратов нового поколения, действие которых направлено на внутриклеточные мишени. Считается, что преимущество такого подхода по сравнению с ранее и сейчас используемыми блокаторам ионных каналов и антагонистами мембранных рецепторов состоит в избирательности воздействия и минимизации побочных влияний на гомеостаз клетки и сопряженные рецепторактивируемые процессы. Многочисленные данные, полученные на клеточных моделях и в экспериментах на животных, а также результаты первых клинических испытаний показывают, что Rho/Rho-киназный каскад играет критическую роль в нарушениях тонического сокращения гладких мышц. Rho-киназа рассматривается в настоящее время как наиболее перспективная мишень для фармакологической терапии гиперсократимости гладких мышц. Этому способствует тот факт, что существуют по крайней мере два высокоселективных ингибитора Rho-киназы, Y-27 632 и фасудил, причем последний уже применяется в клинической практике [7].
В некоторых тканях не менее важную роль могут играть каскады с участием ZIP-киназы и ILK, однако их организация в клетке и индивидуальный вклад в регуляцию сократимости пока не совсем ясны. Возможно использование ингибиторов тех компонентов рецептор-зависмых каскадов, которые функционируют в начале сигнальной цепочки, но оно может быть связано с риском побочных эффектов. Так, специфические ингибиторы МАР-киназ существуют давно, но до сих пор не используются в качестве лекарственных препаратов. Аналогичная ситуация складывается с ингибиторами протеинкиназы С и белка Rho. Их применение может быть связано с нарушением широкого спектра внутриклеточных регуляторных процессов [1].
1. Воротников А. В., Крымский М. А., Ширинский В. П. Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц. Биохимия 67: 1587−1610. 2002.
2. Воротников A.В., Крымский М. А., Хапчаев А. Ю., Серебряная Д. В. Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц. Рос. физиол. журнал им. И. М. Сеченова 90: 705−518. 2004.
3. Хапчаев A.Ю., Крымский M.A., Сидорова M.В., Беспалова Ж. Д., Ванг Ч.-Л.A., Ширинский В. П., Воротников A.В. Новые фосфоспецифические антитела для анализа фосфорилирования белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина. Биохимия 69: 968−980. 2004.
4. Berridge M.J. Smooth muscle cell calcium activation mechanisms. J Physiol 586: 5047−61. 2008.
5. Cohen P.T. Protein phosphatase 1—targeted in many directions. J Cell Sci 115: 241−56. 2002.
6. Deng J.T., Van Lierop J.E., Sutherland C., Walsh M.P. Ca2±independent smooth muscle contraction. a novel function for integrin-linked kinase. J Biol Chem 276: 16 365−73. 2001.
7. Geeves M.A., Holmes K.C. The molecular mechanism of muscle contraction. Adv Protein Chem 71: 161−93. 2005.
8. Kawano Y., Fukata Y., Oshiro N., Amano M., Nakamura T., Ito M., Matsumura F., Inagaki M., Kaibuchi K. Phosphorylation of myosin-binding subunit (MBS) of myosin phosphatase by Rhokinase in vivo. J Cell Biol 147: 1023−38. 1999.
9. Kitazawa T., Eto M., Woodsome T.P., Khalequzzaman M. Phosphorylation of the myosin phosphatase targeting subunit and CPI-17 during Ca2+ sensitization in rabbit smooth muscle. J Physiol 546: 879−89. 2003.
10. MacDonald J.A., Walker L.A., Nakamoto R.K., Gorenne I., Somlyo A.V., Somlyo A.P., Haystead T.A. Phosphorylation of telokin by cyclic nucleotide kinases and the identification of in vivo phosphorylation sites in smooth muscle. FEBS Lett 479: 83−8. 2000.
11. Shirinsky V.P., Vorotnikov A.V., Birukov K.G., Nanaev A.K., Collinge M., Lukas T.J., Sellers J.R., Watterson D.M. A kinase-related protein stabilizes unphosphorylated smooth muscle myosin minifilaments in the presence of ATP. J Biol Chem 268: 16 578−83. 1993.
12. Van Eyk J.E., Arrell D.K., Foster D.B., Strauss J.D., Heinonen T.Y., Furmaniak-Kazmierczak E., Cote G.P., Mak A.S. Different molecular mechanisms for Rho family GTPase-dependent, Ca2± independent contraction of smooth muscle. J Biol Chem 273: 23 433−9. 1998.
13. Wu X., Haystead T.A., Nakamoto R.K., Somlyo A.V., Somlyo A.P. Acceleration of myosin light chain dephosphorylation and relaxation of smooth muscle by telokin. Synergism with cyclic nucleotide-activated kinase. J Biol Chem 273: 11 362−9. 1998.
