Культуры in vitro — продуценты вторичных соединений

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей в условиях in vitro, позволяют использовать их для практического применения. Особый интерес представляет способность изолированных клеток, тканей и органов синтезировать вещества вторичного метаболизма, которые широко используются в медицине, защите растений, ветеринарии, кормопроизводстве, пищевой промышленности, парфюмерии и др.

Такой интерес исследователей к этому направлению работ неслучаен, так как клеточная биотехнология для получения физиологически активных веществ имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием традиционного растительного сырья:

• 1) получение биомассы клеток не зависит от сезона, климатических и почвенных условий;
• 2) возможность оптимизировать условия культивирования суспензии клеток, позволяющих синтезировать в необходимом количестве нужные вещества;
• 3) автоматизация процесса.

Использование клеточных культур растений важно и в тех случаях, когда:

• — невозможно выращивание растения в природе;
• — имеются трудности в его сборе;
• — содержание вторичных соединений в культурах in vitro высокое или высокая его цена на мировом рынке;
• — хороший рост клеточных культур растений на сравнительно простых по составу питательных средах;
• — вторичное соединение (или соединения) выделяются клетками в питательную среду;
• — возможно получение высокопродуктивных растительных культур.

Основным условием для этих работ является тот факт, что культуры.

in vitro, так же как и интактные растения, синтезируют вторичные метаболиты.

Первые данные, касающиеся синтеза вторичных соединений в клеточных культурах растений появились в литературе в 1940 г., когда Дж. Боннер сообщил об образовании каучука клетками гваюлы. Первыми лекарственными растениями, исследованными в культуре ткани, были барвинок розовый и белена черная. Исследования Телле и Готре доказали способность культуры ткани белены к синтезу алкалоидов. Позднее появились и другие сообщения о получении культур тканей различных лекарственных растений, способных синтезировать многие уникальные соединения вторичного метаболизма. Это культура ткани табака, накапливающая большие количества никотина (0,7%), диоскореи — 1,6% диосгенина и другие.

В отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН (Москва) собрана большая коллекция, используемых в промышленности клеточных культур растений, синтезирующих вторичные метаболиты. Это культуры женьшеня дальневосточного (источник алкалоида диосгенина), диоскореи дельтовидной (источник стероидных гликозидов), раувольфии змеиной (продуцент антиаритмического алкалоида аймалина), стевии (источник заменителя сахара — стевиозида) и др. В последние годы большое внимание в мире уделяется культивированию клеток тиса ягодного, синтезирующего уникальное вещество терпеноидной природы — таксол, которое является противораковым препаратом.

Использование культур in vitro для получения вторичных соединений связано с их высокой продуктивностью. Экспериментально доказано, что прирост клеточной биомассы в условиях in vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Например, за год прирост корня женьшеня в тайге составляет 1 г, на плантации — 3 г, а при выращивании клеток корневого происхождения на агаре (in vitro) можно получать 0,4 г сухой массы на литр среды в день. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при выращивании в 50—литровом ферментере увеличивается до 2 г в литре среды за сутки, что в 1000 раз больше, чем при выращивании на плантации. Учитывая высокую стоимость женьшеня, (килограмм плантационного корня стоит 100—150 долл. США; цена дикорастущего корня может доходить до нескольких тысяч долларов США), с экономической точки зрения биотехнологический способ получения биомассы культуры клеток женьшеня весьма перспективен.

Вещества вторичного синтеза, как правило, получают из суспензионной культуры, которую выращивают в биореакторах или ферментерах. И в этом случае, важной характеристикой клеток популяции является ее стабильность в отношении синтеза метаболитов. Она может сохраняться в течение всего времени существования популяции, постепенно снижаться за счет медленного увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов или быть нестабильной — в случае быстрой потери способности клеток синтезировать вторичные метаболиты.

Технология выращивания культур клеток в биореакторах является масштабным процессом. Специалисты немецкой фирмы DIVERSA (ныне — FYTON) осуществили выращивание ряда культур в биореакторах объемом до 75 000 л. В России на Омутминском биохимическом заводе в биореакторах объемом до 2,5 м³ в промышленном масштабе получили биомассу женьшеня, В ТОО «Тэмбр» (г. Ярославль) осуществлено проточное культивирование клеток женьшеня в промышленных биореакторах объемом 7,5 м³. В Институте физиологии растений (Москва) оптимизированы режимы культивирования целого ряда различных культур клеток высших растений в биореакторах объемом 630 л: женьшеня настоящего, полисциаса и других аралиевых, диоскореи дельтовидной, маральего корня и др.

Российские ученые разработали технологию, в прямом смысле слова жизненно важную для десятков тысяч пациентов. Она в принципе позволяет получать практически любое требуемое количество паклитаксела — основы одного из самых эффективных, но и самых дорогих препаратов для лечения некоторых видов онкологических заболеваний, в том числе рака легких, яичников и молочной железы. Субстанция, полученная по новой технологии, по структуре ничем не отличается от обычной, но стоить будет, по мнению авторов, существенно дешевле. Дело в том, что высокая цена паклитаксела — это не прихоть фармацевтов, а следствие огромных затрат на его производство. В природе он есть только в коре очень редкого и очень медленно растущего дерева — тихоокеанского тиса. Чтобы выделить количество, которое необходимо для лечения только одного пациента, нужно собрать кору с 10—12 взрослых деревьев. Понятно, что такое лекарство дешевым просто не может быть. Разумеется, обнаружив удивительные свойства паклигаксела, ученые не перестают искать «обходные пути» — способы более дешевого его получения. Были разработаны и методы химического синтеза, и способ получения полупродукта из хвои тиса с последующей его переработкой в паклитаксель. Но, увы — оказалось, что синтетический аналог существенно дороже вещества, выделенного из природного сырья.

Метод, который предлагают использовать специалисты ОАО «БИОХИММАШ», правильнее отнести к области биотехнологии. Это ценное лекарство ученые научились выделять из природного сырья. Но не из деревьев, а из культуры клеток тиса, выращенных в ферментере и способных эффективнее прочих вырабатывать искомую субстанцию.

Продуктивность клеточных культур высших растений в отношении синтеза вторичных веществ зависит также от состава питательной среды, используемой для их выращивания.

Углеводы являются обязательными компонентами питательных сред. Клеточные культуры могут расти на различных углеводах (испытано более 30 различных соединений), но в большинстве случаев их лучший рост отмечается при добавлении в среду двух сахаров — глюкозы или сахарозы. В то же время высокий уровень синтеза свойствен культурам, растущим на сахарозе, а на средах с глюкозой синтез часто сильно ослаблен. Причины этого явления неясны. Повышенные концентрации сахарозы (5%) в среде эффективны для роста культуры диоскореи, а пониженные концентрации (1,5%) — для продуктивности диосгенина.

Минеральный состав сред также оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений, при этом наиболее важно содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ослаблению синтеза вторичных метаболитов. Это отмечалось для синтеза никотина в культуре клеток табака, антоцианов — в культивируемых клетках моркови, катехинов — в каллусах чая. Накопление вторичных веществ в культурах in vitro обычно начинается после полного использования фосфора, входящего в состав питательной среды.

Имеются данные о том, что повышение концентрации фосфора в среде увеличивало содержание алкалоидов в культуре барвинка розового и антрахинонов в культуре клеток Galium sp.

Показано, что как для роста, так и для синтеза вторичных соединений необходимы минеральные формы азота. При этом органические формы (пептон, дрожжевой экстракт и др.) тормозят и рост, и синтез. Очень важно соотношение аммонийного и нитратного азота. Можно проследить определенную тенденцию — повышение доли нитратного азота способствует увеличению синтеза вторичных веществ, в частности диосгенина в культуре клеток диоскореи.

Фитогормоны — это компоненты среды привлекающие наибольшее внимание исследователей. Однако влияние гормонов на синтез вторичных соединений в культуре клеток неоднозначно и может изменяться в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и др.

Наиболее интенсивно изучались ауксины и цитокинины, так как они, как правило, являются необходимыми компонентами сред. Имеется большое число примеров, когда ауксины стимулировали синтез вторичных соединений, а когда — подавляли. Ауксины стимулировали синтез антоцианов в культурах моркови и тополя, антрахинонов в Cassia fistula и Cassia torra, сапогенинов в тригонелле; уменьшали и исключали синтез антрахиионов и шиконина в воробейнике, скополамина — в гиосциамусе, хлорогеновой кислоты — в табаке.

Достаточно часто влияние ауксинов на синтез вторичных метаболитов зависит от природы ауксина. Так, синтез никотина в табаке стимулируется НУК и ИУК, но тормозится 2,4-Д; синтез антоцианов и нафтахинонов в клетках культуры Plumbago zeylanica, наоборот, стимулируется повышенными концентрациями 2,4-Д и тормозится ИУК и НУК. В целом 2,4-Д чаще, чем ИУК и НУК, отрицательно влияет на синтез вторичных соединений.

Результатов по влиянию цитокининов на синтез вторичных соединений существенно меньше, что не позволяет уловить какие-либо закономерности. Например, бензиламинопурин стимулировал синтез стероидных сапогенинов в культуре паслена, а кинетин также стимулировал синтез алкалоидов в клетках скополии, но полностью ингибировал синтез никотина в культуре клеток табака. Результаты по другим классам фитогормонов весьма фрагментарны и противоречивы.

Влиянию предшественников синтеза вторичных метаболитов на продуктивность клеточных культур посвящено большое число работ. В большинстве случаев, добавление их к питательной среде для роста клеток не приводит к существенному увеличению продуктивности. Так, добавление в среду культивирования диоскореи холестерина (концентрация 100 мг/л) вызывало в лучшем случае включение в диосгенин менее 1% внесенного сгерина. Добавление в культуру барвинка розового триптамина также привело лишь к незначительному увеличению выхода алкалоидов. По всей видимости, для синтеза вторичных соединений в культуре определяющим фактором концентрация предшественников не является.

Все это свидетельствует о том, что, используя различные комбинации питательных сред, можно повысить продуктивность клеточных культур высших растений и их эффективность в отношении синтеза вторичных веществ.

Контрольные вопросы и задания

• 1. Какие соединения относятся к первичным и вторичным метаболитам?
• 2. Расскажите о терпенах, их структуре и функциях.
• 3. Перечислите основные классы фенольных соединений.
• 4. Какие соединения являются алкалоидами?
• 5. Перечислите основные группы алкалоидов.
• 6. Расскажите о цианогенных гликозидах.
• 7. Какие преимущества при получении вторичных метаболитов имеют клеточные культуры по сравнению с растениями? Перечислите их.
• 8. Какие компоненты питательных сред способствуют повышению образования вторичных метаболитов в клеточных культурах растений?
• 9. Что известно о действии предшественников на синтез вторичных метаболитов?