Изучение воздействия электромагнитного поля на водные растворы белков и ДНК

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

" Кубанский государственный университет"

(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Физико-технический факультет Кафедра радиофизики и нанотехнологий Допустить к защите в ГАК Заведующий кафедрой д-р физ.-мат. наук, профессор Г. Ф. Копытов Выпускная квалификационная работа бакалавра Изучение воздействия электромагнитного поля на водные растворы белков и ДНК Работу выполнил Хачатрян Андраник Шотаевич Научный руководитель канд. хим. наук, доцент Е. Е. Текуцкая Нормоконтролер канд. хим. наук М. Е. Соколов Краснодар 2014

Реферат Дипломная работа: 49 с., 17 рисунка, 6 таблиц, 26 источников.

Нуклеиновые кислоты, низкочастотное электромагнитное излучение, хемилюминисценция, флюоресценция.

Объектом исследования данной работы являются водные растворы нуклеиновых кислот и белков, выделенных из биологического материала.

Целью данной работы являлось изучение действия низкочастотного электромагнитного излучения на водные растворы нуклеиновых кислот и белков.

В процессе выполнения работы были получены ДНК из цельной крови и белок из сыворотки крови. Было изучено влияние отклика электромагнитного поля на нуклеиновые и белковые структуры, а так же были изучены релаксационные частоты спектров. Намечены пути дальнейшего применения биологических структур для создания нанотехнологичных устройств, а именно устройств, для хранения и шифрования информации.

Содержание белок нуклеиновый хемилюминесценция электромагнитный

• Обозначения и сокращения
• Введение
• 1. Литературный обзор
• 1.1 Электромагнитное излучение. Радиоволны
• 1.2 Дизоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)
• 1.2.1Физико-химические свойства ДНК
• 1.2.2 Репликация и трансляция
• 1.2.3 Репарация
• 1.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• 1.2.5 Белковые структуры
• 1.3 Методы люминесценцентного анализа
• 1.3.1 Флуоресценция
• 1.3.2 Теоретические основы флуоресценции
• 1.3.3 Хемилюминесценция
• 1.3.4 Фотоэлектронный умножитель
• 1.4 Механизмы биологических эффектов электромагнитных полей
• 1.4.1 Комбинированное действие слабых постоянного и переменного НЧ магнитных полей на ионные токи в водных растворах аминокислот
• 1.4.2 Инициирующее действие слабых магнитных полей на образование межмолекулярных связей в водных растворах аминокислот
• 1.4.3 Воздействие низкочастотного миллиметрового ЭМИ на стабильность молекул ДНК в растворе
• 1.4.4 Влияние слабых магнитных полей на свойства ряда белков и полиаминокислот образовывать комплексы с ДНК
• 2. Экспериментальная часть
• 2.1 Выделение ДНК из различного биологического материала
• 2.2 Проведение ПЦР с целью получения коротких ампликонов
• 2.3 Схема и режим установки для облучения образцов
• 2.3.1 Устройство хемилюминометра
• 2.4 Обработка водных растворов нуклеиновых кислот и их ампликонов ЭМИ. Обработка белковой структуры (альбумина) ЭМИ
• 2.4.1 Снятие спектров хемилюминесценции модельных растворов нуклеиновых кислот
• 2.4.2 Регистрация спектров хемилюминесценции раствора белка
• 2.5 Предполагаемое создание полимерной матрицы и осаждение на нее ДНК-структур
• Заключение
• Список использованных источников

Обозначения и сокращения ЭМП — электромагнитное поле НЧ — низкая частота ФЭУ — фотоэлектронный умножитель ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ПЦР — полимеразная цепная реакция ВКО — внутренний контрольный образец ОКО — отрицательный контрольный образец

Введение

В настоящее время накопилось достаточно большое количество достоверных экспериментальных данных о нетепловых эффектах электромагнитных полей низкой частоты (ЭМП НЧ), а также о чрезвычайно высокой чувствительности к электромагнитным полям живых организмов самых различных классов — от одноклеточных до человека. Особый интерес привлекают биополимеры на основе нуклеиновых кислот. Многочисленными экспериментами установлено, что в молекуле ДНК возможен перенос заряда на большие расстояния, а также возможно испускание фотонов при возбуждении или после возбуждения молекулы ДНК. Кроме того в работах указывается, что некоторые вирусные ДНК-последовательности могут индуцировать низкочастотные электромагнитные волны в водных растворах высокой степени разведения.

В серии работ была показана возможность регуляции (активации и ингибирования) функциональных метаболических свойств биосистем различных типов с помощью ЭМП НЧ. Низкочастотное электромагнитное поле использовалось для изменения скорости протекания ряда важных биопроцессов: репарации отдельных участков ДНК с выявленными соматическими мутациями; генерации активных форм кислорода нейтрофилами; изменение уровня содержания цитокинов и др.

На сегодняшний день, во многих исследовательских институтах зарубежья и России ведутся активные исследовательские работы над биополимерами на основе нуклеиновых кислот и белков. В частности их облучение низкочастотным электромагнитным полем и их способностью откликаться потоком фотонов теплового спектра. Эти факты открывают перспективы в бионанотехнологии и наноэлектронике.

Актуальность данной работы связана с возможностью использования молекул ДНК в качестве переносчика информации и создания новых типов наноструктурных устройств для регистрации электромагнитного излучения.

Целью данной работы являлось изучение воздействия ЭМП НЧ на ДНК и белки растворы методом хемилюминесценции.

Задачи работы:

1 Выделение ДНК из различного биологического материала.

2 Проведение ПЦР с целью получения коротких ампликонов.

3 Обработка водных растворов нуклеиновых кислот и их ампликонов ЭМП НЧ.

4 Изучение зависимости интенсивности хемилюминесценции модельных растворов нуклеиновых кислот и водных растворов белков (альбумина) от различных параметров ЭМП НЧ.

5 Определение степени влияния ЭМП низких частот на водные модельные растворы ДНК.

6 Теоретические объяснения эффектов флуоресценции растворов сложных органических молекул.

7 Описание возможных применений полученных результатов для создания нанотехнологичных устройств шифрования информации.

1. Литературный обзор

1.1 Электромагнитное излучение. Радиоволны Электромагнитное излучение — возмущение электромагнитного поля, распространяющееся в пространстве. Среди электромагнитных полей вообще, порожденных электрическими зарядами и их движением, принято относить собственно к излучению ту часть переменных электромагнитных полей, которая способна распространяться наиболее далеко от своих источников — движущихся зарядов, затухая наиболее медленно с расстоянием (таблица 1).

Таблица 1- Спектр электромагнитных частот Радиоволны — электромагнитные волны с частотами определенного спектра, от до Гц.

В данной работе используются электромагнитные колебания крайне низкой частоты (КНЧ). КНЧ — это диапазон частот от 3−30 Гц. Энергия фотонов такого излучения колеблется от 12,4−124 фэВ.

Резонанс Шумана — явление образования стоячих электромагнитных волн низких и сверхнизких частот между поверхностью Земли и ионосферой (рис. 1).

Рисунок 1 — Типичный спектр электромагнитных колебаний сверхнизкой частоты с резонансами Шумана. Пик на 50 Гц обусловлен частотой переменного тока в промышленной электросети.

Частота резонанса Шумана составляет 7,83 Гц. Из-за волновых процессов плазмы внутри Земли наиболее чётко наблюдаются пики на частотах примерно 8, 14, 20, 26, 32 Гц. Для основной, самой низкой частоты, возможны вариации в пределах 7—11 Гц, но большей частью в течение суток разброс резонансных частот обычно лежит в пределах ±(0,1—0,2) Гц. Спектральная плотность колебаний составляет 0,1 мВ/м.

1.2 Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — молекула наследственности. ДНК — очень длинная нитевидная молекула, состоящая из большого числа рибонуклеотидов.

Пуриновые и пиримидиновые основания ДНК несут генетическую информацию, тогда как сахарные и фосфатные группы выполняют структурную роль. (Рис. 2) ДНК содержит четыре типа основания: два пуриновых основания — аденин и гуанин; два пиримидиновых основания — тимин и цитозин.

Рисунок 2 — Водородные связи в структуре ДНК (а-аденин-тимин, б-гуанин-цитозин) Для обеспечения основных характеристик клеток и организмов данной популяции необходимо точное хранение структуры и стабильности функций генетического материала на протяжении тысяч и миллионов лет, несмотря на действие различных мутагенных факторов. Для поддержания стабильной функции ДНК существует несколько механизмов. Во-первых, это высокая химическая стабильность самой молекулы ДНК, а во-вторых, — наличие специальных механизмов самокоррекции и репарации возникающих изменений. Генетическая информация может надежно храниться в нуклеотидных последовательностях ДНК только том, что широкий набор различных репликационный ферментов осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК и удаляет из нее повреждённые нуклеотиды.

1.2.1 Физико-химические свойства ДНК Изучение межнуклеотидных связей в ДНК показало строгую их однотипность. Во всех случаях связь между дезоксирибонуклеотидными остатками в цепи главных валентностей ДНК осуществляется за счет образования фосфатного мостика между третьим и пятым гидроксилами дезоксирибозных компонентов двух соседних дезоксирибонуклеотидных остатков (Рисунок 3).

Никаких разветвлений в цепи ДНК нет. Все природные ДНК представляют собой частицы с очень большим молекулярным весом (4−16 млн., а в случае ДНК из фагов до 150 млн.) и состоят из десятков тысяч нуклеотидов.

ДНК хорошо растворяются в воде, в слабых и крепких водносолевых растворах, образуя вязкую жидкость; осаждается 2−3 объемами 96%-ого этанола, образуя студнеобразный или волокнистый осадок. ДНК денатурирует при нагревании водных растворов до 100?, при их подкислении (до pH 1−2) или подщелачивании (до pH 10−12). При кислотном гидролизе происходит отщепление пуринов и частичный гидролиз эфирных связей в молекуле ДНК; при мягком кислотном гидролизе ДНК удается получить апуриновую ДНК.

Рисунок 3 — Модели ДНК. Спираль Уотсона — Крика При нагревании с гидразином расщепляется пиримидиновые основания — образуется апиримидиновая ДНК. При действии на ДНК дизоксирибонуклеазы происходит гидролиз основных фосфоэфирных связей ДНК. Изучение природных ДНК из различных организмов показало, что они неодинаковы как биологически, там и химически, и каждый вид организмов характеризуется, по-видимому, своей специфической ДНК.

1.2.2 Репликация и трансляция Репликация — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение.

Трансляция — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК осуществляемый рибосомой. Принцип комплементарности используется в синтезе ДНК. Это строгое соответствие соединения азотистых оснований, соединёнными водородными связями, в котором аденин соединяется с тимином, а гуанин с цитозном. Это фундаментальное значение для молекулярной биологии. На нем построен механизм самоудвоения ДНК — редупликации, обеспечивающий передачу наследственно информации в момент деления клеток. На протяжении жизни клетки используют этот принцип при считывании с отдельных фрагментов ДНК копий в виде информационных РНК (и-РНК) — в процессе транскрипции. В этом процессе матрицей служит лишь одна из цепей ДНК.

Под действием физических и химических агентов, а также при нормальном биосинтезе ДНК в ней могут возникать повреждения. Оказалось, что клетки имеют механизмы исправление повреждений в нитях ДНК. Способность клеток к исправлению повреждений в молекулах ДНК получила название репарации.

1.2.3 Репарация Процесс репарации ДНК состоит в том, что генетическая информация представлена в ДНК двумя копиями — по одной в каждом из двух цепей двойной спирали ДНК. Благодаря этому случайное повреждение, в одной из цепей может быть удалено репликационный ферментом и поврежденный участок цепи возвращается в свой нормальный вид за счет информации, содержащейся в неповрежденной цепи. По времени осуществления в клеточном цикле различают дорепликативную, репликативную и пострепликативную репарацию.

Дорепликативная репарация — это процесс восстановления поврежденной ДНК к ее удвоению. В простейших случаях разрывы могут быть восстановлены ферментом лигазы. В других случаях используется полная ферментативная система репарации.

Репликативная репарация — это совокупность процессов восстановления ДНК в ходе репликации. При этом поврежденный участок удаляется на протяжении репликации в зоне роста цепи. В обеспечении высокой точности репликации значительная роль принадлежит механизму самокоррекции, который осуществляется ДНК-полимеразой или тесно связанным с ней ферментом эндонуклеазой. Этот процесс связан с определением ошибки включенного в цепь нуклеотида, отщеплением его и заменой на соответствующий. В результате этого частота ошибок снижается в 10 раз. Пострепликативная репарация и ее механизм точно не изучен. При пострепликативной репарации происходит вырезание поврежденного участка и сшивания концов. При этом клетка может сохранять жизнеспособность и передавать дефектную ДНК дочерним клеткам. Допускают возможность разных вариантов синтеза ДНК на поврежденной матрице.

По механизмам развития репарации различают: эксцизионную, неэксцизионную и рекомбинативную репарацию. При эксцизионной репарации устраняются повреждения, появившиеся под воздействием ионизирующей радиации, химических веществ и других факторов. Это основной тип репарации, обнаружен как у прокариот, так и в клетках эукариот. Эксцизионная репарация ДНК отличается тем, что не только разрезаются димеры (как при световой), но и вырезаются большие участки молекулы ДНК (до нескольких сотен нуклеотидов). Очевидно, могут удаляться цепи генов, после чего происходит комплементарный матричный синтез с помощью фермента ДНК-полимеразы.

На основе одной из предложенных моделей установлены пять последовательных этапов эксцизионной репарации:

1 «Распознавания» повреждения ДНК эндо-нуклеаз.

2 Разрезание эндонуклеазы одного из цепей молекулы ДНК вблизи повреждения.

3 «Вырезание» поврежденного участка и его расширение экзонуклеазами.

4 Матричный синтез новой цепи ДНК-полимеры (репаративная репликация).

5 Повторное соединение участков с нитью ДНК под влиянием фермента ДНК-лигазы.

Способность к репарации была обнаружена у бактерий, подвергались воздействию ультрафиолетовых лучей. В результате облучения целостность молекул ДНК нарушается, потому что у них возникают димеры, т. е. сцеплены между собой соседние пиримидиновые основания. Димеры могут формироваться между двумя тиминами, тимин и цитозин, двумя цитозинами, тимином и урацилом, двумя урацилами. Однако облученные клетки на свете выживают гораздо лучше, чем в темноте. После тщательного анализа причин этого явления установлено, что в поврежденных клетках на светлые происходит репарация ДНК (фоторепарация). Она осуществляется специальным ферментом ДНК-фотолигазою, которая активируется квантами видимого света. Фермент соединяется с поврежденной ДНК, разъединяет связи в димерах и восстанавливает целостность нити ДНК. ДНК-фотолигаза фотореактивизируется и не может является видоспецифичной к ним, то есть действует на различные виды ДНК. В нем есть циано — кобаламин (витамин В12), поглощающий кванты видимого света и передает энергию молекуле фермента. На ранних стадиях эволюции живых организмов, когда отсутствовал озоновый экран, который задерживает большую часть потока губительных для организмов солнечных ультрафиолетовых лучей, фоторепарация играла особенно важную роль.

Если, например, димеры тимина не устранены до рекомбинации, то это приводит к изменению структуры дочерних ДНК. Такие нарушения могут присутствовать непосредственно в процессе кроссинговера. Но при этом не происходит устранение димера, он удаляется уже после репликации.

Способность клеток осуществлять эффективную репарацию генетического материала может иметь значение также в клеточных механизмах старения. Существуют наблюдения, что линии мышей-долгожителей отличаются более стабильными хромосомами, а у мышей с непродолжительным сроком жизни хромосомы характеризуются большим повреждением, возникновением структурных аберраций, которые являются следствием нарушения процессов репарации. Существуют наблюдения, свидетельствуют о снижении интенсивности процессов репарации ДНК с возрастом. Но трудно сказать, эти изменения — причина старения организма, или его следствие.

1.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Полимеразная цепная реакция — один из мощнейших инструментов исследования нуклеиновых кислот, не доступный ранее. ПЦР используют для анализа индивидуальных вариаций нуклеотидных последовательностей в определенных локусах, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции патогенных микроорганизмов и. т. п.

Другими словами это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале. Ход реакции:

1 Денатурация — двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись.

2 Отжиг — в момент расхождения цепей, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.

3 Элонгация — ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки [10, 11].

1.2.5 Белковые структуры Белки — это высокомолекулярные соединения, у которых сотни и даже тысячи остатков б-аминокислот соединены друг с другом кетоимидными (пептидными) связями (-CO-NH-), образуя длинные цепи главных валентностей — полипептидные цепи:

(1)

где R', R", R" ' … — боковые группы или боковые цепи у отдельных аминокислотных остатков. Пептидные связи образуются путем отщепления воды от карбоксильной группы одной аминокислоты и аминогруппы другой. В состав белков входят остатки более 20 различных аминокислот. Структура белков характеризуется не только химическим составом и порядком чередования различных аминокислотных остатков в полипептидной цепи, но так же и расположением этих цепей в пространстве, что обуславливает существование практически необозримого множества белков с разнообразными свойствами. В белках различают четыре порядка морфологической организации или четыре структуры. Первый порядок, или первичная структура, — полипептидная цепь с определенной последовательностью чередования аминокислотных остатков. Второй порядок — та пространственная конфигурация, которую принимает сама полипептидная цепь. Вторичной структурой может быть, например б-спираль Полинга — Кори, имеющая 3,7 аминокислотных остатков в одном витке. Третий порядок — конфигурация, возникающая в результате складывания или закручивания структур, соответствующих второму порядку.

Рисунок 4 — Схемы первичной и вторичной белковой структуры Четвертый порядок — объединение нескольких частиц с третичной структурой в одну более крупную частицу [12, 13].

1.3 Методы люминесценцентного анализа Люминесценция представляет собой особый вид излучения, избыточное над тепловым и продолжающееся в течение времени, значительно превышающий период световых колебаний. Вообще говоря, люминесценцию следуют отличать от светового рассеяния и от светового отражения тем, что при ней в периоды между поглощением и испусканием, происходят процессы промежуточного характера, длительность которых превышает период световой волны. Люминесценцию часто называют холодным свечением.

Люминесценцию следует классифицировать по длительности, механизму преобразования и накапливания энергии, а так же по временным характеристикам излучения. А именно:

1 Фотолюминесценцию — возбуждение светом.

2 Радиолюминесценцию — возбуждение радиационным проникающим излучением.

3 Электролюминесценцию — возбуждение электрическим полем.

4 Триболюминесценцию — возбуждение при механических воздействиях.

5 Хемилюминесценцию — возбуждение, протекающее в химических реакциях.

По длительности свечения различают как флуоресценцию (быстро затухающая люминесценция) и фосфоресценция (длительная люминесценция). По механизму процессов различают как спонтанную, резонансную, вынужденную и рекомбинационную люминесценцию.

В данной работе рассматривается возбуждение, протекающее в химических реакциях, т. е. хемилюминесценция. Так как в данной работе используется метод хемилюминесценции, то следует рассмотреть основные особенности флуоресценции и хемилюминесценции, принцип работы хемилюминометра, а так же работу фотоэлектронного умножителя как один из основных элементов хемилюминометра.

1.3.1 Флуоресценция Флуоресценция — люминесценция, затухающая в течение короткого времени. Разделение люминесценции на флуоресценцию и фосфоресценцию устарело, приобрело условный смысл качественной характеристики её длительности. По механизму преобразования энергии возбуждения флуоресценция, как правило, является спонтанной люминесценцией, поэтому её длительность определяется временем жизни на возбуждённом уровне энергии (в случае запрещённых переходов флуоресценции в этом смысле может иметь значительную длительность).

Флуоресценция наблюдается в атомных и молекулярных газах. Многие органические вещества обладают флуоресценцией в жидких и твердых растворах, а также в кристаллическом состоянии. Спектры флуоресценции, её поляризация и кинетика связаны со структурой и симметрией центров люминесценции или молекул, характером их взаимодействия, зависят от концентрации растворов, вида возбуждения и т. д. Поэтому с помощью флуоресценция изучают структуру вещества и физические процессы, происходящие в них. Флуоресценцию используют в люминесцентном анализе, сцинтилляционных счётчиках, дефектоскопии, микробиологии, медицине, биофизике и т. д.

1.3.2 Теоретические основы флуоресценции Флуоресценция — физический процесс, разновидность люминесценции. Флуоресценцией обычно называют излучательный переход возбужденного состояния с самого нижнего синглетного колебательного уровня S1 в основное состояние S0. В общем случае флуоресценцией называют разрешенный по спину излучательный переход между двумя состояниями одинаковой мультиплетности: между синглетными уровнями или триплетными. Типичное время жизни такого возбужденного состояния составляет 10?11?10?6 с. Флуоресценцию следует отличать от фосфоресценции — запрещенного по спину излучательного перехода между двумя состояниями разной мультиплетности.

Согласно представлениям квантовой химии, электроны в атомах расположены на энергетических уровнях. Расстояние между энергетическими уровнями в молекуле зависит от её строения. При облучении вещества светом возможен переход электронов между различными энергетическими уровнями (Рисунок 5).

После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в результате релаксации. Часть же может быть испущена в виде фотона определённой энергии. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света соотносятся между собой уравнением (III постулат Бора):

(2)

где и — энергия перехода

hн — общая энергия фотона Рисунок 5 — Схема энергетических переходов в молекуле при возникновении люминесценции.

Квантовый выход флуоресценции показывает, с какой эффективностью проходит данный процесс. Он определяется как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов.

Квантовый выход флуоресценции может быть рассчитан по формуле:

(3)

где — количество испускаемых в результате флуоресценции фотонов

— общее количество поглощаемых фотонов.

Ф — квантовый выход флуоресценции.

1.3.3 Хемилюминесценция Хемилюминесценция — сверхравновесное излучение, яркость которого превышает яркость температурного излучения. При прохождении химической реакции и происходит отступление от равновесия. Хемилюминесценция является частным случаем люминесценции (Рисунок 6).

Рисунок 6 — Энергетика процесса хемилюминесценции для реакции A+B+AB …реакция…->Р+hн Процесс хемилюминесценции в общем случае принято делить на две стадии:

1 Стадия возбуждения — образование при прохождении химической реакции с достаточной энергией продукта реакции (Р) в возбужденном состоянии (Р*) в котором излучательный переход возможен:

A+B+ …реакция…->Р* +К+М+… (другие продукты) (4)

2 Стадия люминесценции: Р* -> люминесценция -> P +

Интенсивность излучения и скорость реакции связаны соотношением:

г; (5)

где число молекул продукта, образующееся в единицу времени в единицу объема;

— квантовый выход возбуждения, это отношение числа возбужденных молекул к общему числу образующихся молекул;

квантовый выход люминесценции отношение числа молекул Р*, отдавших энергию в виде излучения, к общему числу возбужденных молекул; интенсивность самой хемилюминесценции

число фотонов излучаемых из единицы объема реагирующей смеси за единицу времени.

Хемилюминесценция возникает при многих химических реакциях — например, при рекомбинации свободных радикалов или в реакциях окисления (при свободнорадикальном окислении паров белого фосфора в газовой фазе, окислении люминола в водном растворе и т. п.). В этом случае, как и в реакциях биолюминесценции, выделяющаяся энергия не рассеивается в виде тепла, как это происходит в ходе большинства экзотермических химических реакций, а расходуется на образование одного из продуктов реакции в возбуждённом электронном состоянии. Для излучения света в ходе хемилюминесцентной реакции необходимо выполнение, как минимум, двух условий: во-первых, энергия, выделяющаяся в ходе реакции должна превышать ~41−71,5 ккал/моль и, во-вторых, разница энергий основного и возбуждённого состояния продукта реакции должна быть ниже энтальпии химической реакции.

При соблюдении этих условий возможно образование с достаточно высоким выходом окисленной формы люциферина в возбуждённом состоянии и дальнейший переход в основное состояние с испусканием фотона видимого спектрального диапазона. Отношение числа излученных фотонов к общему числу элементарных актов реакции называется квантовым выходом реакции, квантовые выходы биолюминесценции, в отличие от большинства хемилюминесцентных реакций, очень высоки и достигают значений 0,1−1. Такие квантовые выходы для реакций, протекающих в водных растворах при нейтральных значениях pH необычны для хемилюминесцентных процессов и обусловлены специфичной ферментативной природой окислительных реакций биолюминесценции, катализируемых люциферазными комплексами [17, 18].

1.3.4 Фотоэлектронный умножитель Фотоэлектронный умножитель — прибор для преобразования слабых световых сигналов в электрические, основанный на фотоэлектронной и вторичной электронных эмиссиях. Состоит из фотокатода и нескольких электродов (динодов) с высоким коэффициентом вторичной электронной эмиссией и коллектора. Напряжение на каждом диноде относительно фотокатода на 50—100 вольт выше, чем у предыдущего. Свет, падающий на фотокатод, вырывает электронами которые, попадая на диноды, «размножаются», за счёт вторичной электронной эмиссии. Коэффициент усиления электронного тока:

К= n (6)

где n — число динодов Число динодов достигает 109—1011, так что даже отдельные фотоэлектроны создают на выходе ФЭУ импульсы тока большой амплитуды.

а — с корытообразными динодами, б — коробчатого типа, в — жалюзийного типа; 1 — фотокатод, 2 — экран, 3—11 — диноды, Л — световой поток, А — анод, Э — траектория электронов, R — нагрузка.

Рисунок 7 — Фотоэлектронные умножители разных типов

1.4 Механизмы биологических эффектов электромагнитных полей Микроволновое электромагнитное поле может изменять ориентацию углового момента (спина) неспаренного электрона радикала, однако химическая реакционная способность радикала не зависит от ориентации его спина и поэтому индивидуальные радикалы не могут обеспечить ни магнитно-полевых, ни электромагнитных биологических эффектов.

Такие эффекты могут появляться только в условиях, когда имеются пары радикалов или ион — радикалов. Спиновые состояния таких пар — синглетные (с полным электронным спином нуль) или триплетные (со спинов нуль) — сильно различаются по реакционной способности, обнаруживая высокую спиновую селективность. Микроволновое поле может индуцировать спиновые триплет-синглетные переходы в таких парах (спин — селективные нанореакторы), изменять их спиновое состояние и их реакционную способность. Именно эта физически ясная и экспериментально обоснованная концепция лежит в основе микроволновой спиновой химии. Она уже привела к открытию микроволнового изотопного эффекта.

После открытия магнитного изотопного эффекта магния в реакция фосфорилирования: было показано, что в реакциях фосфорилирования в митохондриях оба фосфорилирующих фермента (креатинкиназа и АТФаза) производят аденозинтрифосфат — главный энергоноситель в живых организмах — с высокой скоростью, если в активном центре фермента находится ион магния с магнитным ядром магния 25. Ферменты с этим магнитным изотопом работают почти на порядок активнее, чем с немагнитными изотопами магний 24 и магний 26. Фактический магнитный изотоп магния 25 (спин ядра S = 5/2, естественное содержание 11%) является спиновым катализатором биохимической реакции. Это открытие является прямым и надежным доказательством того, что ключевые биохимические реакции синтеза энергоносителей в организме происходят в спин — селективных нанореакторах. Эти реакции зависят от магнитного момента ядер, а также неизбежно должны зависеть и от магнитного поля, и от резонансного микроволнового поля.

1.4.1 Комбинированное действие слабых постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей на ионные токи в водных растворах аминокислот Исследовалось влияние совместного действия постоянного и переменного магнитных полей на ионный ток через водный раствор аминокислоты. Обследовались аспарагин, глутаминовая кислота, аргинин и тирозин. На кривой зависимости тока от частоты переменного поля, параллельного постоянному, наблюдались отчетливые (30−50% от фонового тока) узкополосные пики на частотах, близких к циклотронной частоте ионизированной молекулы соответствующей аминокислоты. Других пиков не отмечалось. Воспроизводилось эффекта — 100%. При перпендикулярных полях, также как и при отсутствии постоянного поля эффекта нет. Эффект наблюдается только при очень слабом (0,05 мкТл) переменном поле (рисунок 8). С увеличением амплитуды переменного поля эффект исчезает. Концентрация аминокислоты, фоновый катодный ток на порядке наноамперов.

Рисунок 8 — Зависимость силы ионного тока через водный раствор аминокислоты от частоты переменного поля, а — при = 0,05 мкТл, = 25 мкТл, б — при = 0,05 мкТл и = 0 мкТ

1.4.2 Инициирующее действие слабых магнитных полей на образование межмолекулярных связей в водных растворах аминокислот Комбинированное воздействие слабым параллельным постоянным и переменным магнитными полями на раствор глутаминовой кислоты влияет на ионный ток через раствор аминокислоты на определенной частоте переменного тока, соответствующей частоте циклотронного резонанса ионизированной формы молекулы глутаминовой кислоты. Реакция тока на воздействие имеет тонкую структуру, содержащую колебательные компоненты, характеризуется определенными особенностями динамики и ограниченным временем жизни. Суммарная амплитуда эффекта составляет до 30% от уровня фонового тока. При управляемом снижении температуры раствора в процессе воздействия полями происходит формирование устойчивых молекулярных комплексов глутаминовой кислоты, отличающихся по ряду физико-химических характеристик от свободных молекул.

Эксперимент, проведенный авторами заключался в следующем: Кювета находилась в системе, состоящей из двух магнитных катушек, расположенных одна в другой. Оси катушек совпадали. Электродная система в кювете была ориентирована так, чтобы вектор напряженности электростатического поля между электродами был перпендикулярен оси катушек. Катушки располагались в защищенной от внешних магнитных полей зоне в двуслойной камере из пермаллоя с коэффициентом экранирования 58 по постоянному полю. Через одну катушку пропускали постоянный ток, который создавал магнитное поле B в зоне кюветы с неоднородностью менее 1%. Исследования проводились при индукции В = 30 мкТл.

На вторую катушку подавался положительный синусоидальный сигнал, содержащий постоянную составляющую, равную амплитуде переменной составляющей, который формировал в кювете однородное переменное магнитное поле, параллельное постоянному. Проводилось автоматическое сканирование частоты переменного тока от 1 до 10 Гц со скоростью 0,01 Гц/с. Амплитуда индукции переменного магнитного поля B составляла 25 нТл. Ионный ток измеряли с помощью измерительного блока полярографического анализатора до воздействия переменного поля и во время воздействия при частотном сканировании.

1.4.3 Воздействие низкоэнергетического миллиметрового электромагнитного излучения на стабильность молекул ДНК в растворе Исследовано влияние миллиметровых электромагнитных волн слабой мощности на водно-солевой раствор ДНК, выделенной из печени здоровых крыс и крыс с саркомой 45. Полученные данные представлены в табл.2. Из кривых плавления необлученной и облученной ДНК определяли характеристические параметры температуру и интервал плавления. В зависимости от длительности облучения интервал плавления практически не меняется, а термостабильность ДНК увеличивается; при облучении до 90 мин температура плавления ДНК из опухоли увеличивается на ~1,5°С. Предположено, что увеличение термостабильности ДНК обусловлено дегидратацией присутствующих в растворе ионов Na+, вследствие чего повышается эффективность стабилизации двойной спирали.

Таблица 2 — Температура плавления и интервал плавления ДНК, выделенных из печени здоровых крыс и саркомы 45

1.4.4 Влияние слабых магнитных полей на свойство ряда белков и полиаминокислот образовывать комплексы с ДНК Белок — нуклеиновые взаимодействия, играют ключевую роль в экспрессии генетической информации в клетке. Связь гистонов и негистоновых белков с хроматином не только определяет нативную конформацию ДНК, но и степень экспрессии тех или иных генов. Поэтому исследование взаимодействий структурных белков ядер с ДНК важно для понимания ее матричной функции в клетке.

Показано, что в предварительная обработка слабыми комбинированными постоянным (42 мкТл) и низкочастотным переменным (3,5−5 Гц; 0,06 мкТл) магнитными полями, формально настроенными на циклотронный резонанс ионов заряженных в естественных условиях аминокислот, белкового компонента комплекса ДНК-белок приводит к существенному изменению комплексообразования и формированию комплексов ионного типа, чем в отсутствии этой обработки [25, 26].

2. Экспериментальная часть

2.1 Выделение ДНК из различного биологического материала Объектом исследования в данной работе были нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) цельной крови человека и белки. Ампликоны получили из контрольной панели, длина ампликона составляла примерно 410 нуклеотидных пар.

Проведение анализа: Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 прогрели до температуры 65 до полного растворения кристаллов. Отобрали необходимое количество одноразовых пробирок. Внесли в каждую пробирку по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО) и по 300 мл лизирующего раствора. Затем в пробирки с лизирующим раствором и ВКО внесли 100 мкл проб, используя наконечники с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного контроля выделения внесли 100 мкл ОКО. В пробирку положительного контроля выделения внесли 90 мкл ОКО и 10 мкл положительный контрольный образец (ПКО). Пробы тщательно перемешали на вортексе и прогрели до 5 минут при температуре 65.

Процентрифугировали 5 секунд при 5 тыс. об/мин на микроцетрифуге и использовали для выделения ДНК насадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку. Тщательно ресуспендировали сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавили по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешали на вортексе, поставив в штатив на 2 минуты, еще раз перемешали и оставили в штативе на 5 минут. Осадили сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс./об в течение 30 сек. Удалили насадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Повторяя процедуру отмывки, удалили насадочную жидкость полностью. Пробирки поместили в термостат при температуре 65 на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе. Процентрифугировали пробирки при 12 тыс. об/мин в течение 1 минуты на микроцентрифуге. Насадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Данный метод выделения позволяет получить концентрацию ДНК в конечном растворе до 30 мкг/мл. ДНК из биопроб выделяли с помощью коммерческих наборов АмплиСенс — «ДНК-сорб-В», состав которого приведен в таблице 3.

Таблица 3 — Состав набора для выделения ДНК

2.2 Проведение ПЦР с целью получения коротких ампликонов Для проведения ПЦР использовали амплификатор роторного типа «Rotor Gene». Программа амплификации, которая задавалась на приборе, включала в себя следующее (таблица 4):

Таблица 4 — Параметры проведения ПЦР с помощью Rotor Gene

На первом этапе происходит расплетение вторичной структуры ДНК (плавление) в течение 30 минут. На втором этапе к определенным участкам ДНК присоединяются праймеры (отжиг праймеров). На заключительном этапе с помощью находящейся в растворе полимеразы происходит накопление участков ДНК, ограниченных праймерами.

2.3 Схема установки и режим облучения образцов Для обработки ДНК раствора и раствора белка ЭМП низких частот, было использовано специальное оборудование, блок-схема которой представлена на рисунке 9. Она состоит из генератора ГЗ-118, катушки индуктивности, имеющей 1200 витков и экранированной камеры. Вектор магнитной индукции ЭМП, создаваемого катушкой, составляет 30 млТл, удельное сопротивление катушки 320 Ом, и напряжение на катушке равно 14 В.

1 — генератор ГЗ-118, 2 — экранированная камера, 3 — катушка индуктивности, 4 — исследуемый образец.

Рисунок 9 — Блок-схема установки для воздействия ЭМП НЧ на ДНК и белки.

Нужная частота выставлялась на панели генератора низкочастотных сигналов ГЗ-118, который передавал сигнал, с необходимыми характеристиками, на катушку. Экранированная камера была необходима для локализации магнитного поля, создаваемого катушкой внутри камеры, и ослабления его характеристик за пределами камеры. Эппендорфы с исследуемыми образцами (ДНК раствор, белковый раствор), помещались в экранированную камеру, в которой располагалась катушка индуктивности, и подвергались воздействию ЭМП НЧ. Температура, при которой производили облучение, составляла 23−25⁰С. По истечению данного времени содержимое эппендорфа моментально было перемещено в кювету хемилюминометра для регистрации воздействия электромагнитного поля данной частоты, вызвавшего стимуляцию к протеканию экзотермических реакций окисления с выделением энергии в виде потока фотонов, что и представляет из себя явление хемилюминесценции.

2.3.1 Устройство хемилюминометра Хемилюминометр — аппаратно-программный комплекс, предназначенный для регистрации и анализа сверхслабых световых потоков, сопровождающих химические и биологические процессы, протекавшие с образованием свободных радикалов. Блок-схема приведена на рисунке 10.

Рисунок 10 — Блок-схема основных функциональных элементов хемилюминометра Lum-5773

Хемилюминометр состоит из следующих функциональных блоков:

1 Кюветное отделение — предназначенное для размещения в приборе исследуемых образцов.

2 Миксер — выполняет функцию светоизоляции исследуемых образцов от внешней среды, а так же перемешивание исследуемых образцов с помощью встроенного электромотора.

3 Термостат — предназначен для поддержания постоянной температуры исследуемых образцов.

4 Фотоэлектронный умножитель — предназначен для измерения интенсивности свечения исследуемых образцов.

5 Блок электроники — предназначен для управления всеми компонентами прибора и передачи результатов измерений на компьютер.

2.4 Обработка водных растворов нуклеиновых кислот и их ампликонов ЭМИ. Обработка белковой структуры (альбумина) ЭМИ После полимеразной цепной реакции, водный раствор нуклеиновых кислот их ампликонов белков низкочастотным электромагнитным излучением.

Облучение проводили в специальном стеклянном сосуде при комнатной температуре. Время облучения составляло 8−10 минут. Обработка водных растворов нуклеиновых кислот и их ампликонов осуществлялась низкочастотным излучением на частотах от 7.5−8.5 Гц с шагом 0,1 Гц, от 9−15 Гц с шагом 1 Гц и от 15,5−16,5 с шагом 0,2 Гц. Обработка водных растворов белков осуществлялась на частотах 7,4 — 8,5 Гц с шагом 0,1−0,2 Гц. Толщина облученного образца ~ 2 мм; Напряженность поля в месте нахождения образца — 30 мкТл.

2.4.1 Снятие спектров хемилюминесценции модельных растворов нуклеиновых кислот Полученные зависимости напряжения фотоэлектронного умножителя от времени для необлученного образца раствора ДНК представлены на рисунке 11.

Рисунок 11— Регистрация световых потоков необлученного раствора ДНК (калибровка)

Обнаружено в ходе проведенного эксперимента, что наибольшее влияние на растворы ДНК оказывает частота ЭМП 9 Гц. Именно при этой частоте наблюдается максимальная величина интенсивности хемилюминесценции.

Эта частота является резонансной, а интенсивность хемилюминесценции образцов ДНК, полученная при этой частоте, гладко убывающей, что подтверждает ее верность относительно условных погрешностей и аппаратных флуктуаций хемилюминометра.

Из рисунка 11 видно, что раствор без источника возбуждения, не имеет фотонного отклика, а среднее значение напряжения ФЭУ достаточно мало. На рисунке 12 фотонный отклик заметно увеличивается, вероятно, потому что частота облучения близка к Шумановской резонансной частоте.

Интенсивность хемилюминесценции образца с более высоким импульсом колебаний относительно остальных частот приведен на рисунке 12, а образца с самым высоким колебательным спектром — на рисунке 13.

Рисунок 12 — Регистрация световых потоков после облучения раствора ДНК при частоте 7,8 Гц Рисунок 13 — Регистрация световых потоков после облучения раствора ДНК при частоте 9 Гц

Довольно высокие импульсы получились при облучении раствора частотой 9 Гц. Тот факт, что произошел резонансный отклик именно на этой частоте, подтверждает эксперимент.

В виду чрезвычайно малой частоты колебаний генератора, допускается так же некоторая погрешность генератора ЭМИ. Поэтому вполне возможно, что определить абсолютно точно частоту, вызвавшую резонанс, сложно.

Для наглядности общего эксперимента по облучению ДНК, целесообразно представить общий усредняющий график зависимости интенсивности хемилюминесценции водных растворов ДНК от частоты ЭМП НЧ при различных частотах воздействия (рисунок 14).

Рисунок 14 — График зависимости интенсивности хемилюминесценции водных растворов ДНК от частоты ЭМП НЧ при различных частотах воздействия.

Для анализа полученных результатов в таблицу 5 сведены значения максимумов интенсивности хемилюминесценции водных растворов ДНК для каждой применяемой частоты ЭМП (таблица 5). Этот график наглядно показывает пики резонансных частот ЭМП, которые использовались для обработки растворов ДНК.

Таблица 5 — Значения максимумумов напряжения хемилюминесценции в зависимости от частоты облучения ДНК.

2.4.2 Регистрация спектров хемилюминесценции растворов белка В отличие от ДНК, белок при облучении не имел ярко выраженного импульса при 9 Гц (Рисунок 15). Это скорее всего связано с тем, что молекулярная структура белка не имеет четко выраженной спиралевидной, правильной формы, такой как у ДНК. Отсюда следует, что форма молекулы является очень важным признаком проявления резонансного эффекта. Возможно так же, что помимо ДНК, другие сложные полимерные молекулы, имеющие спиральную форму, имеют свою собственную резонансную частоту отклика на воздействие ЭМП.

Рисунок 15 — Регистрация световых потоков после облучения раствора белка при частоте 9 Гц При частоте 7,5 Гц раствор белка имел более высокие средние показания напряжения на ФЭУ, чем раствор белка, облученный при 9 Гц (Рисунок 16).

Рисунок 16 — Регистрация световых потоков после облучения раствора белка при частоте 7,5 Гц.

В целом белок в виду своей конформационной сложности и неправильной геометрии, сильно уступает ДНК по величине резонансного отклика на излучение.

График максимальных значений релаксационных частот для растворов белка с концентрацией 40,9 г/л альбумина сывороточного вследствие этого отличается короткими пиками, не превышающие 0,060 В как это видно на рисунке 17.

Рисунок 17 — График релаксационных частот максимальных значений напряжения ФЭУ для раствора сывороточного альбумина с концентрацией 40,9 г/л.

В таблицу 6 сведены значения максимумов интенсивности хемилюминесценции водных растворов ДНК для каждой применяемой частоты ЭМП.

Таблица 6 — Значения максимумумов напряжения хемилюминесценции в зависимости от частоты облучения водных растворов сывороточного альбумина с концентрацией 40,9 г/л.

2.5 Предполагаемое создание полимерной матрицы и осаждение на нее ДНК-структур Как уже упоминалось, ДНК является спиралевидной, близкой к правильной симметрии молекулой. Есть предположение, что резонансный эффект возникает за счет изменения собственной энергии молекулы, потому маловероятным является то, что выброс энергии происходит за счет поглощения фотонов столь малой энергии.

Полагаю, что молекула ДНК испытывает искривление под воздействием резонансного излучения, при этом очень важную роль играет вода. Без нее резонансный эффект не возможен. Возможно, искривление происходит за счет спинового изменения знака атомов в молекуле ДНК. Поэтому, на молекулу действует только магнитное поле, а не электромагнитное поле в целом.

Искривление структуры происходит в промежуток времени, когда через воду проникает излучение. Когда оно кончается, начинается возврат формы ДНК в стабильное состояние и при этом меняется состояние химических соединений в ДНК, которое и провоцирует излучение.

Возможности эксперимента предусматривают создание некоторых устройств для прикладного использования этого эффекта.

Оказалось актуальным осаждение ДНК молекул на положительно заряженную полимерную матрицу для создания датчика отклика тепловых фотонов. В таком датчике можно было бы количественно менять сумму фотонов излучаемое ДНК, за счет изменения площади облучения самой полимерной матрицы.

Структуры ДНК нужно наносить из капель рабочего раствора (раствора буфера, водно-спиртовой среды и т. п.) на поверхность слюды, модифицированной ионами двух (и более) валентных металлов. Эти ионы, служат связующими мостиками между отрицательно заряженной слюдой (в водных растворах) и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК. Модификация слюды может предшествовать процессу адсорбции макромолекул — в этом случае свежесколотую слюду помещают для предварительной обработки на некоторое время в раствор, содержащий катионы металлов, затем промывают и высушивают. После этого на модифицированную поверхность наносят рабочий раствор с исследуемыми структурами.

После того как рабочий раствор нанесен, полимерную матрицу нужно поместить в небольшой слой воды и изолировать тонкой и твердой оболочкой. Затем данную подложку необходимо подобрать резонансное ЭМИ НЧ и попытаться зарегистрировать импульсы электро-магнитного излучения с подложки. Достоинство данного метода будет в том, что можно будет работать с поверхностью и при этом достаточно точно предсказать то резонансное излучение, которое будет поступать.

Заключение

В ходе выполнения дипломной работы были сделаны следующие результаты:

1 Количественно выделено ДНК из различного биологического материала и проведение ПЦР с целью получения коротких ампликонов.

2 Проведена обработка водных растворов нуклеиновых кислот, их ампликонов и растворов белка ЭМП НЧ.

3 Изучены зависимости интенсивностей хемилюминесценции модельных растворов нуклеиновых кислот и водных растворов белков (альбумина) от различных параметров ЭМП НЧ.

4 Определены степени влияния ЭМП низких частот на водные модельные растворы ДНК.

5 Теоретические обоснованы эффекты флуоресценции растворов сложных органических молекул.

6 Предложены пути возможного применения полученных результатов для создания нанотехнологичных устройств шифрования информации.

Связывание ОН — группы после обработки ЭМП НЧ вызывает изменение рН растворов ампликонов ДНК, что может приводить к разрывам водородных связей в макромолекулах ДНК, нарушению стейкинга ее оснований, в целом к изменению конформации спирали. При переходе системы (водного раствора ампликонов ДНК) в первоначальное состояние происходит испускание энергии, которое и фиксируется на спектрах хемилюминесценции.

Кроме того, свойства воды в гидратационном слое заметно отличаются от свойств обычной воды. Среднее время жизни водородных связей в гидратационном слое в 5−10 раз больше, чем в воде. Время жизни водородных связей между полярными группами макромолекулы (ампликонов ДНК) и поверхностными молекулами воды также заметно больше, чем время жизни водородных связей между двумя молекулами воды в чистой воде. Флуктуация плотности, а также такие свойства воды, как трансляционная диффузия или ориентационная релаксация значительно замедлены в гидратационном слое.

Мы полагаем, что изменение гидратационной оболочки ДНК под действием низкочастотного электромагнитного поля, возможно, также приводит к восстановлению водородных связей, образованию сшивок и в целом к репарации ДНК, что согласуется с мнением ряда авторов.