Хроматографические методы. 
Практические работы и семинарские занятия по органической химии

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Тонкослойная хроматография — эффективный метод анализа сложных смесей веществ различных классов — углеводородов, спиртов, кислот, белков, стероидов и т. д. Она заключается в следующем. На одну сторону небольшой стеклянной пластинки с помощью специального валика наносят тонкий слой сорбента. На стартовую линию слоя сорбента наносят пробы веществ и их смесей; край пластинки ниже стартовой линии погружают в систему растворителей, налитую в широкий сосуд с пришлифованной крышкой. За счет капиллярных сил растворитель продвигается по пластинке. По мере продвижения жидкости по пластинке смесь веществ разделяется. Границу подъема жидкости, или линию фронта, отмечают, пластинку сушат и проявляют. Отмечают, как указано на рис. 77, положение пятен, соответствующих исследуемым веществам и находящихся между линией старта и линией фронта жидкости. Для этого измеряют расстояние от центра пятна до стартовой линии (отрезок а). Далее определяют расстояние от линии фронта жидкости до стартовой точки (отрезок Ь). Отношение отрезка а к отрезку b обозначают через константу R_fy характеризующую положение веществ на хроматограмме.

Таким образом, величина R_f = а: b характерна для данного соединения на данном сорбенте и в данной системе растворителей, но зависит от ряда условий: качества и активности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количества.

Рис. 77. Схема распределения смеси веществ на пластинке с тонким слоем сорбента (А, В — индивидуальные вещества, А + В — смесь веществ).

нанесенного вещества, длины пробега растворителей, положения стартовой линии и температуры. Для более надежной идентификации веществ, определяя R_f, часто применяют вещества-свидетели. На пластинке рядом с разделяемой смесью веществ хроматографируют известное вещество (?свидетель") и сравнивают положение пятен на хроматограмме.

Для разделения смесей веществ в тонком слое применяют как адсорбционную, так и распределительную и ионообменную хроматографии.

Приготовление пластинок с тонким слоем сорбента. Готовя тонкий слой сорбента, для аналитических целей используют стеклянные пластинки длиной 15—20 см и шириной 4—20 см. Для препаративного разделения смеси веществ берут стекла шириной 30— 40 см и длиной 40—50 см.

При хроматографировании применяют закрепленный и незакрепленный слои сорбента. Для получения закрепленного слоя сорбент закрепляют на стекле одним из фиксаторов: гипсом, крахмалом. На поверхность пластинки наносят сорбционную массу в виде суспензии из сорбента, фиксатора и воды, выравнивают ее на поверхности пластинки. Затем сушат пластинки на воздухе при комнатной температуре 15—20 мин и активируют, нагревая в сушильном шкафу или выдерживая 24 ч на воздухе при 20 °C.

В настоящее время выпускают готовые хроматографические пластинки с закрепленным слоем, например «Силуфол» (Чехия), очень удобные в работе.

Метод получения незакрепленного слоя более прост. Сорбент нужной активности насыпают на стекло, лучше матовое, и разравнивают стальным валиком, на концах которого имеются утолщения 0,5—1 мм, или стеклянной трубкой, на концы которой надеты резиновые кольца (см. рис. 90, с. 111).

Нанесение проб испытуемых веществ на пластинку. Объем пробы играет существенную роль при разделении веществ с помощью хроматографии. Если нанести очень много вещества, то получатся чересчур большие и плохой формы пятна, которые сливаются с пятнами соединений, имеющих близкое значение R_f. Пробы испытуемых веществ (обычно от 0,1 до 50 мкг) наносят на пластинку в виде растворов в эфире, хлороформе или другом подходящем растворителе точечными каплями при помощи стеклянного капилляра или пипетки вместимостью 0,1 мл. Для препаративного разделения смесей веществ пробы наносят в виде сплошной линии. Расстояние между отдельными пробами при стандартной величине пластинки должно быть не менее 2 см.

Разделение веществ на пластинке. Хроматография называется восходящей, если растворитель поступает на пластинку снизу вверх под действием капиллярных сил. Для этого в стеклянный сосуд с плоским дном и пришлифованной крышкой (камера для хроматографирования) наливают растворитель в таком количестве, чтобы пластинка с нанесенным веществом погружалась в растворитель на 5 мм. Пластинки с закрепленным слоем сорбента устанавливают в камере вертикально, а с незакрепленным слоем — наклонно, под углом 15—20°.

Если растворитель поступает на пластинку сверху вниз, то хроматография называется нисходящей. Приборы для такого вида хроматографии построены по типу приборов для бумажной нисходящей хроматографии, рассматриваемой ниже.

Обнаружение веществ на хроматограмме (проявление пятен). Многие вещества способны флуоресцировать в УФ-свете. Получаемые при УФ-облучении пятна имеют различный оттенок. Чтобы обнаружить вещества, поглощающие в УФ-области спектра, часто применяют слои сорбента с флуоресцирующим веществом или опрыскивают хроматограмму после разделения смеси раствором флуоресцирующего вещества. При УФ-облучении пластинки вещества, поглощающие в этой области спектра, обнаруживаются в виде темных пятен. Если хроматограмму невозможно проявить оптическими методами, применяют химические, чаще всего проявление парами иода. Высушенную пластинку помещают в эксикатор с кристаллами иода и несколькими миллилитрами воды. Через 10—15 мин пластинку вынимают и оставляют на воздухе до испарения избытка иода. На светлом фоне образуются окрашенные пятна веществ. Проявлять пятна можно, опрыскивая из пульверизатора реагентами, дающими цветные реакции с разделенными веществами. После опрыскивания иногда приходится нагревать пластинку до 80—100 °С и выше.

Препаративное разделение смеси веществ в тонком слое сорбента. На тонком слое оксида алюминия или силикагеля удобно проводить препаративное разделение смеси веществ от 0,1 до 0,5 г и даже более. При слое толщиной около 1,5 мм наносят на 1 см длины стартовой линии примерно 20—25 мг смеси веществ в виде сплошной линии; подвижной фазой служит подходящая система растворителей. Соединения, флуоресцирующие или поглощающие УФ-излучение, обнаруживают УФ-светом. Некоторые вещества обнаруживают парами иода. Для этой цели в нижнюю часть воронки с пористым фильтром помещают кристаллы иода. Осторожно продувая через воронку наружу воздух, проводят верхним концом воронки над слоем с двух сторон пластинки. Окрашенные участки отмечают с обеих сторон пластинки, а ограничивающие зоны соединяют друге другом.

Сорбент с веществом снимают с пластинки, вещество вымывают из сорбента подходящим растворителем, после чего растворитель упаривают.

Колоночная хроматография. Наиболее распространенные типы колонок для хроматографического анализа представлены на рис. 78. Ими пользуются как для адсорбционной, так и для распределительной и ионообменной хроматографии.

Чаще всего применяют колонки диаметром 0,5—10 см и высотой 10—150 см.

Заполнение колонок адсорбентом или носителем и регулирование потока жидкости. Адсорбент помещают в колонку так, чтобы он образовал столбик равномерной плотности. Тяжелые сыпучие адсорбенты просто насыпают в колонку, уплотняя постукиванием по колонке стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

Оксид алюминия рекомендуется загружать непосредственно в колонку, наполненную растворителем. Адсорбент можно загружать в колонку и в виде суспензии в растворителе. Столбик адсорбента удерживается в колонке с помощью тампона из стеклянной ваты или пористой пластинки, расположенных в нижней части колонки.

Для распределительной хроматографии твердый носитель растирают с растворителем, являющимся неподвижной фазой, затем суспендируют во втором растворителе (подвижная фаза). Полученную жидкую кашицу равномерно вводят в колонку. Поверхность слоя носителя должна быть все время покрыта растворителем. Если растворитель очень медленно проходит.

Рис. 78. Хроматографические колонки: а — с приспособлением для автоматической подачи растворителя; б — для работы под давлением; в — для работы при пониженном давлении; г — колонка с проявленными зонами; 1 — колба для автоматической подачи растворителя; 2 — растворитель; 3 — столбик сорбента; 4 — стеклянная вата;

5 — шлиф; 6 — маностат; 7 — колба Бунзена; 8 — зоны компонентов смеси.

через колонку с адсорбентом, лучше работать под давлением, которое создают специальным насосом или прибором для создания повышенного давления (не более 1 атм) (рис. 78, б). Можно также создавать некоторое разрежение в колонке с помощью водоструйного насоса (рис. 78, в). Но так, ускоряя прохождение растворителя через колонку, можно удалить и растворитель из нижней части колонки.

Скорость потока растворителя регулируют с помощью крана на выходе из колонки или уменьшая скорость поступления жидкости на колонку.