Тест с нитрозолевым синим (нст-тест)

Оценку состояния Т-системы иммунитета проводили с помощью реакции спонтанного розеткообразования (Е-РОК). Эта реакция характеризует одну из важнейших функций Т-лимфоцитов — их способность к адгезии, первому этапу, с которого начинается взаимодействие клетки с антигеном, а также к кооперации клеток в иммунном ответе.

Оценку состояния В-системы иммунитета проводили с помощью реакции ЕАС — розеткообразован ия — метод количественной оценки клеток, несущих поверхностные рецепторы к компонентам комплемента. Число лимфоцитов с поверхностными рецепторами для СЗ-компонента комплемента в основном соответствует числу В-лимфоцитов в периферической крови человека.

Оценка клеточных биохимических показателей проводилась с использованием следующих методов:

• 1. Определение пероксидазы.
• 2. Определение содержания гликогена в лейкоцитах.

Определение щелочной фосфатазы в лейкоцитах. В основе лежит метод азосочетаний — расщепление щелочной фосфатазой альфа-нафтил фосфата с освобождением альфанафтола, образующего с солями диазония нерастворимый окрашенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.

Определение кислой фосфатазы в лейкоцитах. Кислая фосфатаза включает ряд изоферментов, обладающих общим свойством — способностью освобождать фосфат из спиртовых или фенольных фосфомоноэфиров в кислой среде. Цитохимическое выявление кислой фосфатазы в световом микроскопе основано на образовании нерастворимого окрашенного преципитата в местах, где происходит гидролиз субстрата, который катализирует кислая фосфатаза.

Активность кислой фосфатазы выявляется в виде гранул ярко-красного цвета в цитоплазме лимфоцитов и диффузногранулярного окрашивания в моноцитах и гранулоцитах. Т-лимфоциты содержат единичные крупные гранулы кислой фосфатазы, в не Т-лимфоцитах реакция отрицательная либо мелкогранулярная.

Для гистологического исследования образцы отбирались следующим образом: отбор проб проводился один раз в день, отбиралось по три пробы. В обработку отправлялось среднее значение по результатам обсчета трех проб, взятых в один день. Полученные результаты показывают, что у всех исследованных животных в молозиве имелось различное количество клеток. Обнаруженные особенности скорее всего являются видовыми и сохраняются в известных пределах для всех особей одного вида (см. табл. 14−17).

После изучения цитограммы молозива проведено исследование проникающей способности лейкоцитов молозива. Для этого было проведено микроскопическое исследование лейкоцитарной взвеси, приготовленной из органов детенышей. При детальном исследовании были обнаружены искомые лейкоциты.

Та блица 14

Результаты подсчета клеток молозива (метод Хилькевича) для собак, кошек крупного рогатого скота.

Таблица 15

Цитограмма молозива коров (черно-пестрая порода), %.

Примечание. Здесь и далее В— базофилы, Э— эозинофилы, Me — миелобласты, Ю — юные, П — палочкоядерные, С — сегментоядерные лейкоциты, Л — лимфоциты, М — моноциты, ЭПК — эпителиальные клетки.

Таблица 16

Цитограмма молозива собак, %

Таблица 17

Цитограмма молозива кошек, */•

Как видно из приведенных выше таблиц, у всех исследовавшихся животных наблюдалась сходная динамика в изменении состава клеток молозива. Подобный эффект наблюдали и раньше. Причины и назначение подобных изменениий вызывают большие разногласия среди исследователей.

Несомненно, что лейкоциты молозива имеют важное значение в создании местного и общего иммунитета у новорожденных животных. В литературе описан факт, что после приема молозива число лейкоцитов в крови новорожденных животных увеличивается преимущественно за счет лимфоцитов тимусного происхождения. Также указывается, что особенно много в молозиве содержится лимфоцитов и их количество закономерно увеличивается к концу лактации.

Действительно, при исследовании молозива коров и свиней имеет место факт изменения клеточного профиля секрета. Этот же процесс зафиксирован и у других животных.

Таблица 18

Лейкограмма некоторых животных (Карпуть И. М., 1986).

Однако состав клеток не у всех животных меняется одинаково. Так, в частности у собак зафиксировано увеличение количества нейтрофилов в молозиве при одновременном снижении количества эпителиальных клеток и незначительном снижении количества лимфоцитов. Сходный процесс происходит и у кошек. Если на эти изменения смотреть с учетом лейкоцитарного профиля крови исследуемого животного, то создается впечатление, что цитограмма молозива стремится к выравниванию своего клеточного профиля относительно профиля белой крови. Скорее всего эти изменения связаны с тем, что на стадии подготовки к лактации происходит накопление лейкоцитов в молочной железе. Это, на наш взгляд, вполне естественно, так как в процессе подготовки к лактации участие иммунной системы весьма значительно (табл. 18).

Так, по результатам наших ранее проводимых исследований (Чекиров Т. Ч., Скопичев В. Г., 1988), в первичном молочном секрете, полученном от овец за 5−12-е сутки до окота, содержалось значительно больше иммунологических факторов (Т-, В-лимфоцитов, иммуноглобулинов; лизоцима, естественных антител), чем в молозиве, взятом от животных сразу после ягнения. Имеются сведения о важной роли клеточных и неклеточных элементов внутридольковой соединительной ткани в период дифференцировки и инволюции молочной железы у лабораторных животных. Отмечено, что подавление деятельности регионарного лимфатического узла (источника лимфоидных клеток) существенно нарушает морфологические процессы и подготавливает развитие структуры альвеолы.

Таким образом, показано, что лимфоидные клетки полости альвеол наряду с образованием иммунологических факторов молозива, вероятно, участвуют и в формировании альвеолярного комплекса, и в дифференцировке секреторных клеток молочной железы. Включение в процесс дифференцировки индуцирующих влияний мезенхимы и аутоиммунных процессов дополняется специфическими изменениями в структуре секреторных клеток и их мембран, приуроченными к периоду становления лактационной функции. В процессе формирования альвеолярного комплекса в молочной железе накапливается значительное число иммунокомпетентных клеток, которые участвуют в деструкции внутриальвеолярного клеточного материала, что объясняет лимфоцитарную инфильтрацию молочной железы в период, предшествующий началу лактации. Также указывалось, что дегенерирующие клетки в силу изменения своей антигенной структуры становятся мишенью для различных лимфоидных клеток, интенсивно мигрирующих в полость альвеолы (Скопичев В. Г., 1993). Понижение содержания клеток в секрете и стабилизация численности их и состава связаны с дальнейшим их заносом из кровеносного русла в молочную железу и выделением с секретом.

На основании ранее проводимых исследований было сделано предположение, что молозивные лимфоидные клетки могут по своим биохимическим и иммунным свойствам заметно отличаться от своих собратьев в кровяном русле. Кроме того, обнаружение молозивных лимфоцитов за пределами кишечника детеныша предполагает их нахождение в активном состоянии и, возможно, наличие какой-либо специфической сенсибилизации, так как согласно литературным данным лимфоциты, взятые из кровеносного русла, способностью проникать сквозь кишечную стенку не обладают. Поэтому основной задачей было изучение морфологии и биохимических свойств лейкоцитов молозива.

Клеточный состав молозива представлен следующими клетками: лимфоциты, нейтрофилы, моноциты, плазматические клетки, эпителиальные клетки, миоэпителиальные клетки, перстневидные клетки, ядерные тельца округлой формы. Большинство клеток имело достаточно необычную форму.

Моноциты по своему строению напоминали тканевые гистиоциты (макрофаги), имели округлую форму. В их цитоплазме обнаруживалось значительное количество включений. При окраске по Паппенгейму цитоплазма окрашивалась в голубой цвет. Объем цитоплазмы превосходил объем ядра. В цитоплазме наблюдались вакуоли различного размера. Обнаруживались включения разнообразного материала (жировые шарики, ядерный материал). Ядро определяется четко, иногда в ядре обнаруживается от 1 до 3 ядрышек.

Плазматические клетки зачастую были крупнее лимфоцита, ядро располагалось компактно, в ряде случаев имело глыбчатую структуру. При окраске по Паппенгейму цитоплазма базофильна, объем цитоплазмы намного превосходит объем ядра. Часто в цитоплазме обнаруживаются вакуоли.

Плазмобласты встречаются в молозиве сравнительно редко. Ядро обычно расположено в центре клетки, иногда бывает незначительно смещено. Ядерно-цитоплазматический индекс сравнительно высокий. Ядро крупное, иногда обнаруживаются несколько ядрышек в центре ядра. Вокруг ядра обнаруживается перинуклеарная зона просветления. Цитоплазма достаточно широко окружает ядро, цвет синий или темно-синий, зернистость не наблюдалась.

Лимфоциты в молозиве представлены в основном небольшими клетками. Глыбки хроматина уплотнены. Цитоплазма слегка базофильна. Диаметр клеток составляет в среднем в молозиве коров 7−13 мкм, в молозиве собак — 8−11 мкм, кошки 7−10 мкм. При исследовании мазков в молозиве коров были обнаружены митозы клеток. В молозиве собак и кошек ничего подобного обнаружено не было.

Нейтрофилы в молозиве представлены клетками среднего диаметра, размеры клеток колеблются для коров от 10 до 14 мкм, у собак встречаются клетки диаметром от 10 до 17 мкм, у кошек от 9 до 14 мкм.

Базофилы чаще встречаются в молозиве первых порций, средние по размеру клетки, у коров их диаметр колеблется в пределах 10−13 мкм. У собак эти клетки в молозиве практически не встречаются. У единичных клеток цитоплазма синевато-сиреневая, имеется большое количество темно-синих гранул, диаметр их у собак 9−15 мкм, в молозиве кошек встречаются чуть чаще, размеры от 11 до 16 мкм.

Эозинофилы в молозиве встречаются крайне редко, у коров можно встретить клетки диаметром от 12 до 15 мкм, в молозиве собак встречаются нечасто, гранулы бывают разного размера, цитоплазма светло-синяя.

Эпителиальные клетки в молозиве встречаются двух типов. Они заметно различаются, первый тип (условно назван группой А) имеет округлую форму. Ядро у этих клеток располагается обычно в центре, имеет мелкозернистую структуру хроматина. Окрашивается в фиолетовый цвет. Встречается как в молозиве коров, так и собак, и кошек, у последних довольно часто. Цитоплазма окрашивалась в синеватые тона. В цитоплазме большое количество вакуолей. Диаметр этих клеток составлял у коров 12−16 мкм, у собак — 11−14 мкм, у кошек — 10−13 мкм.

В молозиве всех вышеперечисленных животных имеются также эпителиальные клетки другого вида (условно названа группой Б). Они отличаются от группы, А более крупными размерами, пенистой цитоплазмой, большим количеством в ней вакуолей. Размеры этих клеток составляют у коров 16- 30 мкм, у собак — 14−25 мкм и у кошек — 14−23 мкм.

Миоэпителиальные клетки ни в молозиве коров, ни в молозиве собак или кошек нами встречены не были. Из литературных источников известно, что они встречаются в молозиве свиней (Карпуть И. М., 1986).

Перстневидные клетки — округлые тельца с элементами ядерного материала, расположенного полумесяцем у одного из краев, и имеющие с другого края узкую полоску базофильной цитоплазмы. При малом увеличении это образование имеет вид «перстня». Происхождение этих образований спорно, скорее всего, это остатки клеток при секреции молока.

Ядерные тельца очень похожи на перстневидные клетки, но без пояска цитоплазмы. Происхождение этих телец спорно, скорее всего, это остатки клеток при секреции молока.

В этом же опыте изучалась активность ферментов лейкоцитов молозива (см. табл. 19). Активность ферментов лейкоцитов молозива оказалась повышенной по сравнению с лейкоцитами крови.

Таблица 19

Активность пероксидазы лейкоцитов молозива собак.

Таблица 20

Активность и индекс окрашивания щелочной фосфатазы лейкоцитов молозива собак.

Примечание. ИО — индекс окрашивания.

Таблица 21

Содержание гликогена в лейкоцитах молозива собак.

Примечание. Гликоген Л — гликоген лимфоцитов, гликоген Н — гли коген нейтрофилов.

Как видно из полученных результатов (табл. 19−24), активность лейкоцитарных ферментов неодинакова и изменяется в процессе лактации. Также имеется достоверное отличие активности ферментов между видами животных. Активность ферментных систем у кошек оказывается выше, чем у собак, что, возможно, связано с особенностями протекания у них перекисных реакций и функционированием системы окисляющих и антиокисляющих ферментов. Некоторое снижение ферментативной активности клеток к концу молозивного периода, очевидно, связано с затуханием предлактационных иммунных процессов и созданием более стабильного состояния периода молокоотделения.

Размеры клеток, обнаруженных в молозиве, различаются между видами животных. Усиленная вакуолизация связана с наличием большого количества жира и его поглощением.

Таблица 24

Содержание гликогена в лейкоцитах молозива кошек.

Таблица 22

Активность пероксидазы лейкоцитов в молозиве кошек.

Таблица 23

Активность и индекс окрашивания щелочной фосфатазы лейкоцитов молозива кошек.

клетками, с дальнейшим вымыванием в процессе фиксации мазков.

Выводы. В молоке, полученном при нормальных условиях от здорового животного, содержится около 100 ферментов различного происхождения, из которых исследователями выделено и идентифицировано более 20 истинных, или нативных, ферментов следующих классов — оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Одни из них (лактозосинтаза, щелочная фосфатаза, ксантиноксидаза, лизоцим и др.) синтезируются непосредственно в секреторных клетках молочной железы, другие (каталаза, плазмин, липопротеидлипаза, рибонуклеаза, альдолаза и др.) поступают в молоко из крови животного.

Большая часть нативных ферментов молока всех млекопитающих являются нормальными компонентами секреторных клеток, которые участвуют в клеточном метаболизме и синтезе составных частей молока и затем переходят в молоко при повреждении клеток во время процесса секреции. Возможно, некоторые гидролитические ферменты (протеиназы, липазы и др.) специально секретируются клетками молочной железы для оказания помощи новорожденному в усвоении питательных веществ молозива и молока, так как последние обладают несовершенной пищеварительной системой. Кроме нативных ферментов в молоке и молозиве присутствуют многочисленные внеклеточные и внутриклеточные ферменты. Они вырабатываются содержащимися в молоке бактериями и лейкоцитами.

В этом случае использование методов оценки общей ферментативной активности представляется неэффективным. Поэтому особое значение следует придать гистохимическим методам, как позволяющим оценить именно исключительно клеточную активность. В ходе исследования были выявлены некоторые закономерности в изменении ферментативной активности клеток. Так, например, имеются различия между активностью ферментных систем различных видов.

Размеры клеток молозива скорее зависят от вида животного, и достоверной корреляции между размерами клеток и сроком лактации обнаружить не удалось.