Возрастные распределения микроорганизмов

Во всех рассмотренных нами выше моделях биомасса микроорганизмов предполагалась однородной. Однако очевидно, что большую роль в процессах размножения микробной популяции имеет возрастная структура. Действительно, на протяжении жизни клетки способность усваивать питательный субстрат и чувствительность к ингибиторам меняется. Это влияет на прирост биомассы отдельных клеток. Собственно делиться, т. е. увеличивать численность популяции, обычно способны лишь клетки определенного возраста или клетки, достигшие определенных размеров. Формализовать влияние возраста на продукционную способность клетки чрезвычайно сложно. Как всегда, моделирование идет здесь, но пути идеализации и упрощения.

Простейшая двухвозрастная модель клеточной популяции исследована Н. В. Степановой (см.: Романовский и др., 1985). Популяция разбита на две группы: «молодые» и «старые». Первая группа содержит клетки, которые интенсивно растут, но еще не достигли физиологической зрелости и не могут делиться; члены второй группы способны к делению, но процесс деления может быть задержан при помощи различных ингибиторов.

Уравнения записываются для численностей молодых Ni и No старых клеток:

Здесь Т — среднее время «созревания» молодой клетки, Т-2 — среднее время пребывания старой клетки в репродуктивном периоде, а удельная скорость деления клеток u) = Т₂, D — скорость протока, множитель 2 в первом уравнении отражает тот факт, что одна старая клетка делится на две молодые.

При отсутствии лимитирования субстратом продолжительность первой фазы Т постоянна. Продолжительность второй фазы Гг зависит от взаимного влияния клеток, которое осуществляется с помощью метаболитов (кейлонов), выделяемых клеткой в среду. Если скорость выделения и распада кейлонов много больше скорости протока и скорости деления клеток, концентрация кейлонов пропорциональна числу клеток, их выделяющих.

Обозначим концентрацию ингибирующего метаболита (кейлоиа) /. Ингибирующее свойство I на удельную скорость роста клеток можно записать в виде:

Здесь п — порядок ингибирования, к — константа ингибирования.

Н. В. Степанова рассмотрела три ситуации: 1) ингибиторы выделяются только молодыми клетками, 2) ингибиторы выделяются только старыми клетками и 3) независимо от возраста. Исследование соответствующих систем уравнений показало, что в рамках модели типа (6.4.1) только предположение о выделении ингибиторов старыми клетками дает возможность описать колебательные режимы в системе. Два других предположения приводят к моделям, имеющим при любых параметрах устойчивое стационарное состояние типа «устойчивый узел».

Рассмотрим модель, в которой ингибиторы выделяются старыми клетками и скорость деления зависит от Nг:

Безразмерная система имеет вид:

Здесь х = N/Nq, у = N₂/N₀, т = t/T, 6 = DT.

Кроме тривиальной нулевой система (6.4.4) имеет еще одну особую точку, определяемую из системы алгебраических уравнений.

Точка (G.4.5) лежит в положительном квадранте, если параметры удовлетворяют условиям:

При а < сг в системе устанавливается режим вымывания.

Рис. 6.9. Области неустойчивости стационарного ненулевого решения при п = 2 (двойная штриховка) и п = 3 (одинарная штриховка): пунктир <�х (<$) = а (Степанова, цит.: Романовский и др., 1985).

Рис. 6.10. Фазовый портрет системы (6.4.4): 1,2 — особые точки. Жирная замкнутая кривая — предельный цикл (Степанова, цит.: Романовский и др., 1985).

Ширина области неустойчивости стационарного ненулевого решения определяется порядком ингибирования: чем больше 77, тем она шире (см. рис. 6.9). Фазовый портрет системы в области неустойчивости содержит предельный цикл (рис. 6.10). Динамика переменных изображена на рис. 6.11.

Отметим, что колебательные режимы в системе удалось описать в результате учета двух факторов: запаздывания — клетки должны.

Рис. 6.11. Колебания численности молодых клеток я, старых у и всей популяции (я + у) при п = 3, 6 = 0,5: а — а — 1; б — <�т = 20 (Степанова, цит.: Романовский и др., 1985).

пройти фазу молодых, прежде чем произвести потомство, и саморегуляции популяции зрелых клеток — отрицательная обратная связь по численности старых клеток.

Понятие «молодые» и «старые» клетки может быть расшифровано применительно к разным видам микроорганизмов по-разному, в зависимости от структуры их жизненного цикла. Обычно рассматривают 4 последовательные фазы развития: предсинтетическая фаза Gi, период синтеза ДНК — фаза 5, постсинтетическая фаза G2 и фаза митоза М, во время которой клетки делятся. Вновь образовавшиеся клетки находятся сначала в фазе G, а затем повторяют тот же цикл. Иногда вводят в рассмотрение фазу Go, предшествующую G. В клетках эукариотов молодыми можно считать клетки в Gi-фазе, в которой в основном синтезируется белок, а старыми — все остальные, начиная с 5-фазы. Известно, что именно на этих поздних стадиях существуют ингибирующие кейлоны, угнетающе действующие на определенную фазу.

Для прокариотов (бактерий, синезеленых водорослей) процессы синтеза ДНК и деления способны к автономной цикличности. Модель (6.4.4) здесь описывает регуляцию именно процесса деления, в то время как редупликация ДНК в этих клетках практически не зависит от условий внешней среды.

Рис. 6.12. Изменение сухого веса непрерывно культивируемой популяции S. certvisiae при ступенчатом изменении концентрации глюкозы на входе в реактор (Regan et al., 1971).

Разделение культуры на дочерние и материнские клетки может легко объяснить и другие эффекты, возникающие при культивировании, например, дрожжевых клеток. Эти клетки размножаются почкованием. После отделения почки на материнской клетке остается шрам, и поэтому число шрамов на дрожжевой клетке соответствует числу произведенных ею потомков. Если концентрация субстрата на входе культиватора изменяется, наблюдаемый в эксперименте переходный процесс носит волнообразный характер. На рис. 6.12 представлено изменение сухого веса культуры дрожжей S. cerevisiae при ступенчатом изменении концентрации глюкозы на входе реактора с 0,46г/л-ч до 2,21г/л-ч при скорости разбавления v = 0,1ч^-1. Стрелками отмечены первая и вторая волны почкования. Разбиение культуры на дочерние и материнские клетки объясняет волнообразный переходный процесс частичной синхронизацией культуры в результате возникновения волны деления.

Если чувствительность к субстрату молодых клеток больше, чем старых, т. е. величина 5 в реакторе такова, что д (5) для молодых клеток находится на линейном участке изменения, а /х (5) для старых кле;

ток близка к насыщению, резкое увеличение S ведет к тому, что большинство клеток переходит в репродуктивную фазу, после чего происходит ванна делений.

Рассмотрим модель динамики численности непрерывно культивируемой популяции клеток, имеющих конечное число фаз развития. Обозначим через т число фаз развития клеток. Численный состав популяции зададим вектором X = (а?*, …, х_ш), где — численность клеток г-й файл развития. Пусть S_p — концентрация субстрата на входе ферментера, 5 концентрация лимитирующего субстрата в ферментере, v — скорость протока. В условиях идеального перемешивания скорость оттока приросших клеток равна сХ.

Пусть величина fa (5) задает скорость, с которой одна клетка j-й фазы переходит в г-ю фазу в процессе старения или путем размножения. Тогда fij (S) = q_tj/Ti, где T_t — средняя для клеток данной популяции продолжительность г-й фазы, a q, j — среднее число потомков г-го типа, оставляемых клеткой при завершении j-й фазы развития. Как правило, число qij генетически наследуемо и не зависит от условий культивирования, например, тканевые клетки делятся на две в последней стадии развития, т. е. q_m = 2. Отметим, что число q обозначает среднее число потомков для клеток данной популяции, поэтому оно может быть не обязательно целым. Например, в популяции хлореллы, где клетки могут давать 2, 4. 8 потомков, величина q зависит от соотношения клеток данной плодовитости. Концентрация лимитирующего субстрата (S) определяет лишь продолжительность фаз развития клеток Ti = Ti (S).

Для решения задач о динамике популяций с возрастной структурой обычно используют матричный аппарат, в основном разобранный нами в гл. 2. В математической микробиологии часто вводят в рассмотрение квадратные матрицы с неотрицательными недиагональными элементами F (5) = А = и диагональную матрицу Р (5) = diag{P,(S)}™ _1? где P_t{S) = 1 /Ti (S) — скорость прохождения клеткой г-й фазы развития. Здесь F (S) = АР (5).

Если считать, что одна клетка г-й фазы развития потребляет лимитирующий субстрат со скоростью yiPi (S), где </* — эмпирический коэффициент утилизации, динамика процесса биосинтеза задается системой где вектор G* = (д, …, д_т) —

В случае, когда клетки в течение жизненного цикла проходят т фаз развития, а на последней фазе делятся на q дочерних, матрица, А имеет вид:

Для популяции почкующихся клеток (дрожжей) матрица принимает вид:

В следующем разделе мы рассмотрим задачу управления структурированной, но возрастам культурой микроорганизмов.

Здесь же остановимся еще на одном способе математического описания возрастной структуры популяции — непрерывном описании (см. Степанова: Романовский и др., 1975).

Непрерывные модели возрастной структуры оперируют не с численностями отдельных групп, а с непрерывной функцией распределения организмов по возрастам. Уравнение для плотности функции распределения было впервые получено Мак-Кендриком в 1926 г., а затем «переоткрьгго» фон Ферстером в 1959 г. и носит его имя. Это уравнение представляет собой дифференциальную форму закона сохранения числа особей. В уравнении две независимые переменные: время t и возраст т, который отсчитывается с момента рождения особи. n (t, r) dr — количество особей, имеющих возраст в интервале [т, т + */т]. Общее число особей всех возрастов в момент времени t определяется интегралом.

Уравнение Ферстера имеет вид.

с начальным условием.

В уравнении (6.4.10) слева стоит полная производная dn/dt, при этом учтено, что dr/dt = 1. В правой части — члены, которые описывают процессы, приводящие к изменению числа клеток данного возраста. Убыль клеток может быть вызвана разными причинами: смертностью, миграцией. Для проточной культуры микроорганизмов всеми этими процессами можно пренебречь по сравнению с протоком клеток через культиватор. Скорость протока D (t) не зависит от возраста клеток, но может зависеть от времени.

Член — r)u (t_y т) описывает убыль клеток из данного интервала возрастов при делении на дочерние со скоростью и>. Прирост численности в результате размножения происходит в нулевой возраст и войдет в граничное условие при т = 0:

Здесь к — число потомков в одном акте размножения, W (t, r’Jrfr' — вероятность размножения родительского организма в возрасте [т', т + + dr¹], равная удельной скорости размножения:

Если родительские клетки остаются в популяции после размножения (дрожжи), то W (t_yr) — плотность безусловной вероятности деления в возрасте г (функция распределения возрастов деления). Если же клетки выбывают из своего возраста после деления (водоросли, бактерии), то W (t, r) — плотность условной вероятности разделится в возрасте т, если клетка дожила до этого возраста, не разделившись.

В интегродифференциальном виде уравнение Ферстера для общего числа клеток в случае, когда каждая клетка делится на к дочерних, имеет вид:

Если родительские особи не выбывают из популяции, это уравнение справедливо для случая, когда одновременно образуется (к — 1) дочерних клеток.

Решение уравнений (6.4.10)-(6.4.13) — достаточно сложная задача. Наиболее хорошо изучены стационарные возрастные распределения числа клеток. При этом установлено, что стационарные распределения возможны лишь при определенных соотношениях между характеристиками популяции (законом распределения возрастов деления) и внешними условиями. Для моноциклической популяции (все особи делятся только в определенном возрасте) соотношение между возрастом деления и скоростью протока имеет вид (Степанова, 1985):

Подобное соотношение существует и при более реалистических предположениях о законе размножения, например когда период репродукции распределен случайно около некоторого среднего значения. Однозначная взаимосвязь характеристик возрастной структуры с характеристиками среды подтверждает важную регуляторную и адаптивную роль возрастных распределений популяции.

Имеются модели, описывающие распределение клеток по размерам и массам. Их легче сопоставлять с экспериментальными данными, так как имеются экспериментальные методы определения размеров клеток. В настоящее время активно разрабатываются методы микроизмерений. позволяющие определять и другие параметры отдельных клеток (например, фотосинтетическую активность и содержание хлорофилла в водорослях). Также все большее распространение получают методы автоматизации эксперимента, дающие возможность изучать характеристики сотен и тысяч отдельных микроорганизмов и строить соответствующие распределения признаков отдельных особей. Информация об эволюции этих распределений предоставит новые оценки состояний микробных популяций, как искусственно культивируемых, так и природных. Примером могут служить оценки состояний популяций планктона в морях и океанах или почвенных микроорганизмов. Несомненно, метод «изучения эволюции распределений» может здесь быть весьма эффективным. Однако предстоит еще большая работа по решению чисто математических и методических вопросов.