Клонирование ДНК in vivo

Чтобы клонировать ДНК in vivo, создают банк генов (библиотеку ДНК), т. е. коллекцию клонов ДНК, включающих все фрагменты генома данного вида. Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека. Первую геномную библиотеку создал Т. Маниатис с сотрудниками в 1978 г. Они использовали ДНК из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках Е. coli. Для создания банка генов выделяют всю геномную ДНК, разрезают ее с помощью рестриктаз или методом «дробовика» (ультразвуком) на отдельные фрагменты, присоединяют к плазмидным или вирусным векторам и вводят в реципиентные бактерии для их последующего клонирования.

Многие плазмиды-вектора несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то трансформированные клетки (колонии) легко выявлять, выращивая их на среде с антибиотиком. Каждая такая колония представляет собой клон, или потомство, одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид, несущих разные участки генома, можно назвать библиотекой геномной ДНК. В таком виде банк можно сохранить.

Недостаток геномных библиотек в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержит полноразмерные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В ней содержится вся наследственная информация организма. Банк генов — это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функций белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов.

Клоповая библиотека генов (кДНК). Помимо геномных, существуют библиотеки кДНК — молекул ДНК, которые являются комплементарными копиями зрелых мРНК, прошедших процессинг; они не содержат интронов. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с «тупыми» концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Существенные преимущества библиотеки кДНК заключаются в том, что она представляет собой библиотеку транскрибируемых генов, которая ничем не прерывается, тогда как в геномной библиотеке не обязательно присутствуют только дискретные гены (рестриктазы могут разрезать ДНК и внутри гена).

Кроме того, гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную. Этот процесс называется сплайсингом (созревание — удаление последовательностей, не кодирующих белковые продукты). После чего следует сращивание. Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуется цель получения белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК. Библиотека к ДНК отражает спектр генетической активности в клетках, из которых она была выделена. Создание таких библиотек полезно для сравнения генетической активности в клетках разных тканей.

Поиск нужных генов в геномной библиотеке. Одним из методов поиска нужных генов в банке является гибридизация, включающая блоттинг (от англ, blotting — промокание). Блоттинг — это метод перенесения фрагментов нуклеиновых кислот на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) эти молекулы.

Саузерн-блоттинг (назван по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят в такой последовательности:

• — выделенную ДНК разделяют в агарозном геле, где происходит электрофоретическое разделение ее фрагментов по массе и заряду;
• — после разделения фрагментов ДНК в агарозном геле его обрабатывают растворами, денатурирующими ДНК (происходит образование одноцепочечных ДНК). Далее гель помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором;
• — на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, на который происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК;
• — поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т. е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой;
• — фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 °C, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле;
• — ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК-зондом, в котором происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде темных полос на рентгеновской пленке, т. е. на радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра.

Для анализа РНК применяют Нозерн-блот-гибридизацию, во многом похожую на Саузерн-блоттинг. В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда. В этом методе в качестве зонда обычно используют фрагменты ДНК.