Методы определения ПАУ

Наиболее часто для определения ПАУ в пищевых продуктах проводят жидкостно-жидкостную экстракцию гексаном, циклогексаном или изооктаном с последующей очисткой экстракта на колонке, заполненной оксидом алюминия или силикагелем. Основной недостаток жидкостно-жидкостной экстракции — это расход большого количества дорогостоящих чистых растворителей и серьезные временные затраты. Для идентификации и количественного определения полициклических углеводородов используют ВЭЖХ с флуориметрическим и фотометрическим детектированием или спектрофлуориметрию с предварительным разделением на пластинке со слоем ацетилированной целлюлозы.

Альтернативой является газовая хроматография с пламенноионизационным или масс-спектрометрическим детектированием. Но и газовая хроматография имеет ряд недостатков: необходимость тщательной очистки пробы и высокая стоимость оборудования.

Методы определения массовой доли бенз (а)гшрена устанавливает ГОСТ Р 51 650 «Продукты пищевые. Методы определения массовой доли бенз (а)пирена», который распространяется на продовольственное сырье, пищевые продукты, пищевые и вкусовые добавки.

Отбор проб

Отбор и подготовку лабораторной пробы к испытаниям проводят в соответствии с нормативным документом на испытуемый вид продукции. Из объединенной лабораторной пробы для испытания отбирают две параллельные навески. Перед отбором навески пробы гомогенизируют.

Пробоподготовка

Углеводороды, в том числе бенз (а)пирен, экстрагируют /(-гексаном из продукта, предварительно обработанного спиртовым раствором гидроксида калия. Необходимость проведения щелочного гидролиза обусловлена тем, что ПАУ, обладая липофильными свойствами, накапливаются в основном в жировой ткани продуктов питания. В связи с тем, что //-гексаном экстрагируется и неомыляемая часть липидов, далее проводят выделение бенз (а) пирена из полученного экстракта.

Разделение экстракта при дальнейшем определении бенз (а)пирена методом низкотемпературной флуориметрии проводят хроматографически в тонком слое оксида алюминия. На пластинку наносят равномерной сплошной полосой полученный экстракт, а также раствор-«свидетель», которым является раствор бенз (а)пирена в петролейном эфире. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, заполненную петролейным эфиром, под небольшим углом (20−25 °). После того как фронт растворителя дойдет до верхнего края пластины, ее, не высушивая, облучают УФ-светом и по светящейся полосе «свидетеля» определяют место нахождения бенз (а)пирена в исследуемой пробе. Отмечают границы полосы бенз (а)пирена на хроматограмме исследуемой пробы. Пластину высушивают на воздухе в вытяжном шкафу. Отмеченную на хроматограмме исследуемой пробы полоску оксида алюминия снимают с пластины и элюируют бенз (а)пирен с А1₂0₃ бензолом. Бензол упаривают досуха и остаток растворяют в //-октане.

При определении методом ВЭЖХ или спсктрофлуориметрисй при комнатной температуре проводят реэкстракцию полученного экстракта смесью Ы, П-диметилформамид — вода с последующим экстрагированием «-гексаном, который упаривают, а остаток растворяют в этиловом спирте. Полученный раствор пропускают через колонку, заполненную сефадексом LH-20 (декстрановый эпоксимодифицированный адсорбент, обладающий липофильногирофильными свойствами). Элюирование из колонки полициклических ароматических соединений, в том числе бенз (а)пирена, проводят этиловым спиртом.

Дополнительную очистку пробы в тонком слое ацетилированной целлюлозы проводят при определении бенз (а)пирена методом спектрофлуориметрии. Хроматографирование полученной фракции осуществляют, используя в качестве подвижной фазы смесь этилового спирта, ацетона и воды. После хроматографического разделения и высушивания зону бенз (а)пирена, проявленную УФ-облучением, удаляют с пластины и элюируют бенз (а)пирен бензолом с последующим упариванием растворителя.

Определение и обработка результатов

1. Метод низкотемпературной флуориметрии

В полученном растворе (экстракте) определяют содержание бенз (а)пирена методом низкотемпературной спектрофлуориметрии. Аналитическая линия флуоресценции бенз (а)пиреиа равна 403 нм при длине волны возбуждающего света 367 нм. Измерения осуществляют при температуре жидкого азота (-196 °С). Определение содержания проводят методом внутреннего стандарта, заключающегося в том, что к анализируемому и стандартным растворам бенз (а)пирена добавляют раствор внутреннего стандарта — 1,12-бензперилена в таком количестве, чтобы в спектре пробы интенсивность 1,12-бензперилена была в 3−5 раз больше интенсивности линии бенз (а)пирена. Измеряя высоты пиков в максимумах характеристических линий этих соединений, рассчитывают коэффициент отношения (К) интенсивности линии бенз (а)пирена (Я,) к интенсивности линии 1,12-бензперилена (Я₂), К = Н/Н₂. Далее определяют этот коэффициент для стандартных растворов бснз (а)пирсна (К^).

Массовую концентрацию бенз (а)пирена в анализируемом растворе (с, мкг/см³) вычисляют по формуле.

где с_ст — концентрация бенз (а)пирена в стандартном растворе, мкг/см³; К — коэффициент отношения, найденный по спектрограмме анализируемого раствора с добавкой 1,12-бензперилена; К_С1 — коэффициент, найденный по спектрограмме стандартного раствора бенз (а)пирена с добавкой 1,12-бензперилена.

2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Фракцию, содержащую бенз (а)пирен, анализируют с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны излучения 418 нм и длине волны возбуждающего света 300 нм. Неподвижной фазой является сорбент с привитой обращенной фазой (например, supelcosil LC-PAN, хромосил С18), подвижной — смесь ацетонитрила и воды.

Определение содержания бенз (а)пирена проводят методом добавок или методом внутреннего стандарта. Внутренний стандарт — бенз (в)хризен. Время удерживания бенз (а)гшрена — 5 мин, бенз (в)хризена— 13 мин.

Метод ВЭЖХ является одним из лучших для определения ПАУ, но применение одного детектора — флуориметрического недостаточно для полной уверенности в надежной идентификации целевого соединения. В этом случае лучше использовать тандем детекторов для ВЭЖХ (флуориметрический и УФ детекторы) или амперометрический детектор, хотя достоверная идентификация возможна лишь при применении спектральных детекторов — масс-спектрометрического или ИК-Фурье-спектрометра.

3. Спектрофлуориметрия при комнатной температуре

Количественное определение содержания бенз (а)пирена в продуктах питания проводят методом стандартов. Флуоресценцию пробы продукта и пробы контрольного опыта с добавкой бснз (а)пирсна измеряют при длине волны флуоресценции 406 нм и длине волны возбуждения 386 нм.