Методы определения углеводов

Метод количественного определения углеводов выбирают в зависимости от принадлежности углеводов к одной из трех основных групп: простейшим сахарам (моно-, дии трисахариды), усвояемым полисахаридам (крахмал, декстрины, гликоген), неусвояемым полисахаридам (пектиновые вещества, гемицеллюлозы, клетчатка). Методы определения этих групп сильно различаются.

В основе многих химических методов количественного определения углеводов в пищевых продуктах лежат редуцирующие свойства сахаров. Поэтому нередуцирующие полисахариды предварительно подвергают гидролизу, дальнейший анализ основан на определении количества редуцирующих сахаров (например, глюкозы, фруктозы или мальтозы) любым титримегрическим или спектрофотометрическим методом.

Простейшие сахара

Сахара извлекают из пищевых продуктов 80%-ным этиловым спиртом при температуре 75−80 °С на водяной бане. При анализе сильнокислотных продуктов (виноград, яблоки, томаты, лимоны и т. д.) во избежание гидролиза полисахаридов спирт, используемый для экстракции, нейтрализуют мелом. Спиртовые экстракты объединяют, спирт упаривают под вакуумом при температуре не выше 40 °C, разбавляют горячей водой и фильтруют. При анализе продуктов, относительно богатых белками и фенольными веществами (виноград, лук, листовые овощи, свекла), фильтрат дополнительно обрабатывают нейтральным раствором ацетата свинца, избыток которого удаляют сульфатом натрия, оксалатом натрия или фосфатом натрия. Выпавший осадок отфильтровывают и в фильтрате определяют редуцирующие сахара одним из химических методов. Наиболее распространенными являются такие методы, как йодометрический, феррицианидный, глюкозооксидазный и др.

Йодометрический метод — это титриметрический метод, основанный на способности йода в щелочной среде окислять альдосахара в соответствующие уроновые кислоты:

Избыток йода оттитровывают раствором тиосульфата натрия, предварительно нейтрализовав щелочь раствором кислоты.

Содержание альдосахара (X) вычисляют по формуле.

где V! и V₂ — объемы раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование холостого и исследуемого раствора соответственно, см³; W_Na s 0 — нормальная концентрация раствора тиосульфата натрия, н; Л/_{экв (Х)}— эквивалентная молярная масса определяемого углевода; К₀/К_а] — коэффициент, учитывающий разбавление.

Феррицианидный метод основан на реакции окисления глюкозы (и других углеводов) гексацианоферратом (III) калия в слабощелочной среде при определенных условиях, которые должны каждый раз точно соблюдаться для получения воспроизводимых результатов:

Глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, гексацианоферрат (III) калия восстанавливается до гексацианоферрата (II). Избыток добавленного гексациоиоферрата (III) калия определяют йодометрически в кислой среде:

Вследствие обратимости этой реакции гексацианоферрат (II) калия переводят в нерастворимую соль K₂Zn₃[Fe (CN)₆]₂ действием сульфата цинка.

Образовавшийся в результате реакции свободный йод оттитровывают тиосульфатом натрия. Содержание альдосахара вычисляют по формуле, приведенной в йодометрическом методе.

Глюкозооксидазный метод — это спектрофотометрический метод, основанный на способности фермента глюкозооксидазы окислять Р-?)-глюкозу до глюконовой кислоты. Ферментный препарат глюкозооксидаза представляет собой флавопротеин, обладающий высокой специфичностью по отношению к Р-?)-глюкозе.

Ферментативная реакция протекает с образованием лактона глюконовой кислоты и восстановлением простетической группы флавинадениндинуклеотида (ФАД). Образовавшийся лактон спонтанно гидролизуется до глюконовой кислоты:

Далее восстановленная форма флавинадениндинуклеотида — ФАДН₂ передает протоны на кислород с образованием пероксида водорода в количестве, эквимолярном количеству окисленной глюкозы:

Присутствующая в ферментном препарате пероксидаза катализирует окисление гексацианоферрата (II) пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения гексацианоферрата (III):

В результате реакции раствор приобретает лимонно-желтый цвет. Интенсивность его окраски пропорциональна количеству образовавшейся глюкозы. Поглощение раствора определяют при длине волны 510 нм. Окраска раствора устойчива в течение 1 часа после окончания инкубации.

Содержание глюкозы (т, г) определяют методом стандартов и рассчитывают по формуле.

где А_х и Л_СТ — оптические плотности исследуемой пробы и стандарта соответственно; с_ст — содержание глюкозы в калибровочной пробе, мг/см³; V — объем анализируемого гидролизата, см³; V_al V_al — коэффициент, учитывающий разбавление гидролизата.