Ядерный магнитный резонанс 13С (ЯМР 13С)

Как уже говорилось, ядро ¹²С не имеет магнитного момента и, следовательно, не может быть обнаружено с помощью метода ЯМР. Впрочем, обычные органические препараты всегда содержат изотоп ¹³С, имеющий спин J *½ и магнитный момент, который примерно в четыре раза меньше протонного магнитного момента. Если учесть, что интенсивность сигнала ЯМР пропорциональна кубу магнитного момента, а также то, что в природе содержание изотопа ^{, 3}С составляет 1,1% (остальные 98,9% приходятся на изотоп ¹²С), то оказывается, что сигнал ЯМР ^{, 3}С соединения, не обогащенного специально изотопом ^|3С, приблизительно в 6400 раз меньше сигнала ЯМР *Н (на моль атомов). В связи с этим возникают значительные трудности при регистрации очень слабых сигналов. Эти трудности удалось преодолеть только после создания в начале 70-х годов спектрометров ЯМР нового типа, основанных на использовании импульсной техники.

Остановимся кратко на технике регистрации спектров ЯМР малочувствительных ядер. Короткий радиочастотный импульс длительностью t_p © эквивалентен облучению образца не одной монохроматической частотой, а целым набором (пакетом) частот, группирующихся около основной (или несущей) частоты в диапазоне ±l/t_p (Гц). При малых t_p, например 100 мкс (т. е. 10-'* с), ширина этого пакета достаточна для одновременного возбуждения всех ядер ¹³С (в данном примере диапазона 20 000 Гц вполне достаточно для возбуждения всех ядер ¹³С). Возникающие после наложения импульса сигналы ЯМР, представляющие собой отклики спиновой системы, даже после выключения импульса еще какое-то время существуют. Они представляют собой синусоидальные колебания вида A_t sin (2nv_tt), где v, — частота /то резонанса, A_i — его интенсивность. Со временем эти колебания постепенно затухают по экспоненциальному закону ехр (-</7'₂), где Т₂— постоянная времени спада (или релаксации).

Для того чтобы извлечь из этого сложного временного процесса информацию о частоте (v,) и интенсивности (Л,) отдельных резонансов, необходимо провести операцию перехода от временного вида сигнала F (t) к обычному частотному спектру g (v). Эта операция в математике известна как преобразование Фурье, а спектрометры, использующие анализ временных откликов спиновой системы на радиочастотный импульс, получили название импульсных спектрометров ЯМР с преобразованием Фуры" или сокращенно спектрометров ЯМР-ФП.

Важнейшая особенность импульсной спектроскопии ЯМР-ФП состоит в том. что весь эксперимент по регистрации спектра ЯМР должен длиться доли секунды, так как обычно постоянные времени Т₂ малы (порядка секунды), и спустя время Т₂ сигнал отклика фактически исчезает. Для того чтобы оперативно записать этот сигнал, используют электронные устройства (аналого-цифровые преобразователи), которые передают информацию о сигнале по точкам (как в телеграфе) в память компьютера. Компьютер, являющийся обязательным элементом спектрометров ЯМР-ФП, после записи сигнала F (t) проводит Фурье-преобразование, а затем выдает функцию ?(v), т. е. обычный спектр, на самописец или на телетайп.

Краткость единичного эксперимента (одного прохождения) позволяет проводить многократные эксперименты с накоплением слабых сигналов. При повторяющихся экспериментах полезный сигнал растет пропорционально числу прохождений п; шум также растет, но медленнее, пропорционально Jn, таким образом, эффективное отношение сигнал/шум растет пропорционально Jn. Иными словами, чтобы усилить сигнал в 100 раз, необходимо 10 000 прохождений, и если одно прохождение занимает 0,2 с, то полное время эксперимента составит около 2 ч.

Именно то обстоятельство, что стало возможно накапливать слабые сигналы за сравнительно небольшие отрезки времени (1—3 ч), и создало технические предпосылки для широкого использования спектров ЯМР ^{, 3}С в практике.

Спектроскопия ЯМР ^{, 3}С обладает рядом особенностей, но сравнению со спектроскопией ПМР. Прежде всего диапазон химических сдвигов ядер ¹³С составляет 200—230 м. д. что более чем на порядок превышает диапазон химических сдвигов протонов (около 10 м. д.). Поэтому спектры ЯМР ^{, 3}С сильнее отзываются на какие-либо возмущения электронной структуры соединения, чем спектры ПМР, т. е. спектры ЯМР ¹³С улавливают более тонкие химические эффекты. Кроме того, спектры ЯМР ^{, 3}С позволяют наблюдать основной углеродный скелет молекулы, а также некоторые функциональные группы, не содержащие протонов (например, С=0, C=N, C=S, COO ит.д.).

Имеется одно принципиальное обстоятельство, существенно влияющее на способ записи спектров ЯМР ^{, 3}С. Дело в том, что ядро ^{, 3}С обнаруживает спин-спиновые взаимодействия с протонами. Константы этого взаимодействия, обозначаемые как J (^{, 3}С—Н) или «/_гн, могут сильно различаться по величине. Для ядер ^{, 3}С и *Н, непосредственно связанных между собой о-связью (в этом случае константы называются прямыми и обозначаются как ^_Сц), они достигают 120—250 Гц. Остальные константы (геминальные при п — 2, вицинальные при п = 3 и др.^[1]) обычно не превышают 10 Гц. Так как данное ядро ^|3С может быть одновременно «связано» со многими протонами (например, в молекуле пропана ядро ^|3С метильной группы «связано» сразу с восемью протонами), то это приводит к очень сложной картине мультиплетных расщеплений. Из-за больших расщеплений *"/_сн мультиплеты отдельных ядер могут перекрываться и расшифровка такого спектра становится очень сложной.

Поэтому спектры ЯМР ^|3С, как правило, регистрируют в режиме двойного резонанса, при котором наряду с возбуждением ядер ^{, 3}С одновременно происходит облучение протонов сильным радиочастотным полем на резонансной частоте протонов. При этом протоны начинают быстро реориентироваться, т. е. менять направление ориентации по полю и против поля, что приводит к исчезновению спин-спиновой связи протонов с ядром ^{, 3}С (спин-развязка). Техника широкополосной развязки позволяет подавлять спин-спиновое взаимодействие одновременно всех протонов. В результате спектры ЯМР ¹³С, называемые спектрами с полным подавлением спиновой связи с протонами, выглядят как ряд синглетов, где каждому химически неэквивалентному атому углерода соответствует единственный сигнал спектра. Заметим, что при развязке мультиплеты сливаются, в результате интенсивность существенно возрастает.

Впрочем, при подобном упрощении спектра теряется информация о константах J_CH и возникает проблема отнесения линий, так как часто бывает неясным, какой из синглетов относится к интересующему нас атому углерода. Для того чтобы частично обойти эту трудность, съемку спектров с полной развязкой от протонов дополняют съемкой спектров с частичной и неполной развязкой от протонов, которую осуществляют либо путем уменьшения амплитуды поля, облучающего протоны, либо смещением частоты второго поля от положения резонанса протонов. Получаемый при этом спектр сохраняет константы */_Сц, но не истинные, а уменьшенные примерно на порядок. Дальние константы (^[2]«/_сн, ^SJ_C» и др.) при этом становятся ненаблюдаемыми, а прямые константы J_c" дают мультиплсты, вид которых (число компонент) позволяет судить о том, сколько протонов находится у данного атома углерода.

Существенным недостатком спектроскопии ЯМР ¹³С с полным подавлением связи с протонами является искажение интенсивностей сигналов. Дело в том, что при развязке от протонов возникает некоторый эффективный избыток населенности ядер ¹³С на нижнем уровне (этот эффект называют ядерным эффектом Оверхауэера. сокращенно ЯЭО). Это приводит к росту интенсивности сигнала ^|3С, что, вообще говоря, можно считать еще одним достоинством спин-развязки. Но разные ядра ¹³С характеризуются различными величинами ЯЭО (максимально сигнал растет в три раза, но может вообще не меняться, например, для четвертичных атомов углерода). В результате разные сигналы усиливаются в разной степени, что приводит к несоблюдению условия пропорциональности между интенсивностями и числом резонирующих ядер. А это условие составляет основу одного из важнейших приложений спектроскопии ЯМР, связанного с количественным анализом продуктов и смесей.

Рассмотрим в качестве примера спектры ЯМР ^{, 3}С пиридина. На рис. 45, в приведен спектр ЯМР ¹³С, записанный при полной развязке от.

Рис. 45. Спектр ЯМР ^{, 3}С пиридина без двойного резонанса: а — при использовании импульсного ЯМI* ФП-спектрометра; б — полученный на спектрометре стационарного типа при том же общем времени эксперимента; в — с полной развязкой от протонов; г — с неполной развязкой от протонов.

• 5 — 9286 Граилбсрг
• 129

протонов. Как и следовало ожидать по симметрии молекулы пиридина, в этом спектре наблюдается три линии с не соответствующим структуре соотношением интенсивностей. При записи спектра без облучения протонов (и при том же числе прохождений!) в результате возникновения мультиплетов и из-за отсутствия ЯЭО интенсивность сигналов резко падает и спектр практически не виден (рис. 45, б). Полный спектр со всеми константами J_C}1 (эти спектры называют протонно-связанными) удается получить только при увеличении числа прохождений почти в 10 раз (рис. 45, а). Наконец, спектр с неполной развязкой от протонов (рис. 45, г) состоит из трех дублетов, что доказывает принадлежность всех углеродов к ==СН-типу.

В большинстве случаев отнесение сигналов в спектре ЯМР ¹³С можно провести с помощью таблиц или шкал характеристических диапазонов химических сдвигов ¹³С. Некоторые (самые простые) сведения о химических сдвигах ¹³С приведены в таблице (на втором форзаце книги).

Рассмотрим теперь пример расшифровки спектров ЯМР ¹³С. На рис. 46 приведен спектр ЯМР ¹³С органического соединения с бруттоформулой С₄Н_б0₂. Из спектра с полной развязкой от протонов (рис. 46, а) видно, что все атомы углерода молекулы неэквивалентны (обратите внимание на сильные искажения интенсивностей сигналов, ведь каждому сигналу отвечает одинаковое количество ядер ^{, 3}С). Сигнал в самых слабых полях при 169 м. д., судя по величине химического сдвига, относится к группе С=0, более точно — к группе СОО. Этот сигнал и остается синглетом в спектре с неполной развязкой от протонов. Сигналы при 143 и 99 м. д. могут быть отнесены к олефиновым углеродам, причем один из этих сигналов соответствует группе =СН₂ (триплет в спектре с неполной развязкой), а другой — группе =СН—. Сигнал в самых сильных полях относится к метильной группе (квартет в спектре с неполной развязкой). Теперь нетрудно видеть, что найденные фрагменты и группы можно объ.

еме. 46. Спектр ЯМР ^{, 3}С винилацетата: а — при полной развязке от протонов; б — при неполном подавлении спин-спинового взаимодействия с протонами единить только в форму единственной структуры, а именно винилацетата О.

II.

Н₂С=СН—о—с—сн₃.

Наиболее важной областью применения спектроскопии ЯМР ^{, 3}С является исследование с ее помощью сложных природных соединений и биополимеров (использование спектроскопии ПМР в этих случаях чаще всего оказывается мало информативным). Так, например, для моносахаридов удается полностью отнести сигналы для аи [3-форм. Для холестерина, содержащего 27 неэквивалентных атомов углерода, удалось получить полностью разрешенный спектр с отнесением всех сигналов.

Спектроскопия ЯМР ^{, 3}С оказалась весьма перспективной для изучения мест внедрения биосинтетической метки. При использовании для этих целей радиоактивного изотопа ^МС необходимо перед анализом проводить химическую деструкцию, далеко не всегда однозначно идущую. В случае использования изотопа ^{, 3}С просто сравниваются спектры природного соединения и соединения, биогенетически обогащенного добавкой изотопсодержащего низкомолекулярного компонента (¹³С0₂, ¹³СН₃СООН, СН₃^{, 3}СООН и т. п.). Место внедрения изотопа ^{, 3}С после этого ясно видно по возросшей интенсивности соответствующего сигнала в спектре.

• [1] п — число простых связей, разделяющих взаимодействующие («свя
• [2] занные») атомы.