Радиоиммунный анализ. 
Ядерная медицина: физические и химические основы

Важным направлением изотопной диагностики является использование радионуклидов для медицинских целей, но вне тела человека. К таким методам относится радиоиммунный анализ.

Этот вид анализа не требует построения изображений. Он основан на иммунных реакциях с использованием меченых соединений и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

В лабораторных (in vitro) исследованиях радиоактивное вещество добавляют к образцам тканей, взятым из организма пациента. Активность образцов измеряются при помощи счётчиков радиоактивных излучений, специально предназначенных для исследования биологических проб: уи (3-радиометры с автоматической сменой проб для определения in vitro гормонов и других биологических веществ в средах организма и колодезные счётчики, наиболее часто применяемые для измерения объёма циркулирующей крови.

Радиоиммунный анализ (РИЛ) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами (обычно — со специфическими антителами).

Наличие или отсутствие некоторого радиоактивного материала легко детектировать, даже если он существует в очень небольшой концентрации. Радиоизотопами можно метить молекулы образцов in vitro (вне тела). Существуют сотни тестов для определения состава крови, сыворотки, мочи, гормонов, антигенов и многих лекарств посредством посредством конкурентной ассоциации радиоактивно меченых и соответствующих им немеченых соединений со специфическими к ним системами.

РИА был впервые разработан (i960) для определения уровня эндогенного инсулина в плазме крови человека. Метод основан на конкуренции определяемого вещества со своим меченым аналогом за ограниченное число мест связывания у высокоспецифичных антител. В тест-системе радиоактивный лиганд связывается с антителами, специфическими к немеченому лиганду, в результате чего образуется комплекс «меченый лиганд — антитело». Определяемый гормон (лиганд) плазмы крови конкурирует с меченым аналогом за связывающие места антитела и тем самым снижает взаимодействие последнего с меткой. Поэтому соотношение концентраций свободного и связанного с антителом лигандом уменьшается. Связанную и свободную формы меченого соединения разделяют одним из известных способов (адсорбция, фракционное осаждение, метод двойных антител и т. д.) Заключительными этапами РИА являются радиометрия одной из фракций, построение калибровочной кривой, отражающей динамику изменений радиоактивности связанного (или свободного) лиганда в зависимости от количества внесенного в пробирку немеченого аналога (стандарта). Концентрация целевого вещества (например, гормона) в анализируемом образце устанавливается сравнением скорости счета анализируемого образца со скоростью счета стандартного образца с последующим перенесением полученного значения на калибровочную кривую.

Рис. 1. Канальный гамма-радиометр для радиоимунного анализа in vitro.

К РИА относятся: проведение анализа без предварительного разведения анализируемых проб; высокая чувствительность — способность выявлять минимальные количества вещества; специфичность — измерение количества только одного строго определенного вещества; точность — определение истинного количества вещества; воспроизводимость результатов; возможность повторения результатов в одной пробе при анализе наборами из разных партий; простота выполнения анализа и значительная пропускная способность, дающая возможность проводить без особых трудностей большое количества проб; отсутствие лучевой нагрузки на больного.

Недостатками РИА считаются: недолговечность хранения меченого лиганда по причине физического распада метки, её отщепление от реактива и радиолиза носителя; разрушение лиганда при йодировании; необходимость высокой очистки лиганда; недостаточная чувствительность при низком содержании определяемого вещества в биологических жидкостях; низкая специфичность, обусловленная неселективным связыванием меченого соединения компонентами плазмы крови; необходимость предварительной экстракции определяемого лиганда в тех случаях, когда он связан с белками или липопротеидами плазмы, а также при наличии в крови веществ, обладающих перекрестной иммунореактивностью по отношению к определяемому лиганду. Несмотря на недостатки РИА в настоящее время является самым распространенным методом радиоизотопного анализа.

Радиоиммунный анализ предназначен для количественного определения in vitro биологически активных веществ (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов) в биологических жидкостях, основанное на конкурентном связывании таких веществ, находящихся в полученном от пациента биологическом материале, и аналогичных им меченных радионуклидом веществ, входящих в состав реактива (и те и другие чаще всего являются антигенами), со специфическими к ним антителами. Так как меченый антиген добавляют в определённом количестве, можно определить, какая часть его связалась с антителами и какая осталась несвязанной в результате конкуренции с определяемым неактивном антигеном.

В радиоиммунном анализе используют РФП на основе меченных радионуклидами (зН, ¹⁴С, згр, ззр, 131J, >23j, min и др.) антител или антигенов, но чаще всего применяют изотоп йода ^12r>J, который имеет период полураспада 6о дней и высокую удельную радиоактивность.

Антитела (иммуноглобулины) — растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры — антигены. Антитела исполызуются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов, например, бактерий и вирусов. Антитело — важный фактор специфического гуморального иммунитета, состоит из двух лёгких и двух тяжёлых цепей.

Антитела представляют собой белки глобулиновой фракции сыворотки крови, образующиеся в ответ на введение в организм человека или теплокровных животных бактерий, вирусов, белковых токсинов и других антигенов. Связываясь активными участками (центрами) с бактериями или вирусами, они препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества. Защитное действие антител, содержащихся в иммунных сыворотках, широко используется в терапии и профилактике инфекционных заболеваний.

Антиген («зачинщик выработки антител») — вещество, которое организм считает чужеродным или потенциально опасным. Против антигена организм начинает вырабатывать собственные антитела — этот процесс называется иммунным ответом (аллергическая реакция).

Антигены представляют собой высокомолекулярные вещества, которые при введении в организм человека вызывают образование специфических реагирующих с ними антител. Непременным условием антигенности является их отличие от веществ, имеющихся в норме в организме реципиента. К антигенам относятся чужеродные белки, некоторые полисахариды (большей частью бактериального происхождения), комплексы белков с разнообразными химическими соединениями.

Особая разновидность метода — иммунорадиометрический анализ (ИРМА), в котором используются меченые антитела, в отличие от РИА, где используются меченые антигены.

Для проведения РИА необходимо иметь специфическое к антигену антитело, меченный радионуклидом антиген, чистый немеченый антиген, используемый как стандарт, метод отделения комплекса радиомеченный антиген-антитело, счётчик радиоактивности.

Обычно меченный ^{, 2r}>J антиген с высокой удельной активностью приготавливают йодированием остатков тирозина в молекуще антигена и с последующим удалением свободного изотопа методом гель-фильтрации. Готовый к использованию меченый антиген с известной удельной активностью входит в состав продажных наборов для РИА.

Рис. 2. Конкурирующие реакции, протекающие в РИА.

В РИА выбор радиоактивной метки не ограничен, т. к. методы измерения активности, используемые in vitro весьма чувствительны. Большой период полураспада радионуклидов, используемых РФП удобен для применения. Используются изотопы биологически значимых элементов (железо или кобальт). Йод удобен, т.к. может быть легко встроен во многие органические молекулы. Энергия радиоактивного распада не должна быть слишком большой. Высвобождение большого количества энергии может разорвать химические связи и привести к снижению химической стабильности. Например, ¹²sj предпочтительнее, чем ЗД, а ззр предпочтительнее, чем згр.

Для радиоиммунного анализа выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества.

Радиоиммунный анализ широко используется в лабораторной диагностике. С помощью РИА, ИРМА (RIA/IRMA) в биологических жидкостях определяют количество биологически активных веществ (гормонов, факторов роста, ферментов, маркеров злокачественных новообразований).

Метод используют в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб, либо в динамике. Реакции с использованием меченых антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах.

РИА — чувствительный метод измерения ничтожных количеств гормонов, содержащихся, например, в крови или желудочном соке больного, т. е. измерение таких малых концентраций, которые нельзя определить другим методом. С помощью РИА легко и быстро диагностируют недостаток или избыток гормонов, причём можно определить уровень содержания гормонов в миллионных частях одной миллионной части грамма. РИА для определения антигена, присутствующего в организме при гепатите, стал методом отбора во время выявления инфицированной крови по линии Красного Креста или других станций переливания крови. С помощью РИА возможна ранняя диагностика развивающейся туберкулезной бактерии.

Радиоимунный анализ используется для определения объёма циркулирующей крови, при проведении дыхательного теста для выявления Helicobacter pylori, при исследовании продолжительности жизни эритроцитов, при диагностике желудочно-кишечного тракта, при ренографии, определении йодпоглотителыюй функции щитовидной железы, а также при изучении метаболизма витамина В12, железа, и др. Антигены, меченные ¹²5j, используются для определения гормонов Т₃ и Т₄, секретируемых щитовидной железой.

Радиоактивный йод используется в качестве метки для определения содержания в организме гормона инсулина. У больных, страдающих диабетом, этот гормон стимулирует образование специальных антиинсулиновых антител, которые соединяются с инсулином. После введения инсулинового индикатора кровь пациента подвергается анализу методами электрофореза или хроматографии, а компоненты присутствующих в крови антител обследуются на содержание в них радиоактивных веществ.

РИА активно используется в обнаружении наркотиков.