Активность фермента и факторы, ее определяющие

Активность фермента — это количественная характеристика способности фермента выполнять его функцию — увеличивать скорость определенной биохимической реакции в клетке. Она определяется количеством субстрата, которое может переработать определенное количество фермента за определенное время, или количеством продуктов реакции, образующихся при действии определенного количества фермента в определенный промежуток времени.

Активность фермента измеряется в различных единицах. Во-первых, в единицах активности. Единица активности (Е или U) — количество фермента, например, число его молекул в 1 мл раствора или в 1 мг сухого вещества, которое в стандартных условиях, то есть при температуре 25 °C, pH — оптимальном для данного фермента, то есть при максимуме насыщения фермента субстратом, катализирует превращение одного мкмоля субстрата за 1 мин. Во-вторых, мерой активности фермента может быть его молекулярная активность — это число молекул субстрата, превращенных в 1 мин. одной молекулой фермента. В-третьих, единицей измерения активности ферментов является катал (кат) — количество фермента, необходимое для превращения одного моля субстрата за 1 с (1Е = 16,67 нкат). Если у фермента несколько активных центров, то его активность выражают через активность одного активного центра.

Активность ферментов в клетке регулируется за счет действия в клетке механизмов саморегуляции. Величина активности ферментов изменяется в зависимости от режима функционирования клетки ткани, в которой находится эта клетка, от состояния среды, в которой действует фермент. Регуляция активности ферментов — это основа саморегуляции живых систем на клеточном уровне их организации.

Так как активность фермента определяется количеством «переработанного» субстрата, или количеством продуктов реакции, катализируемой данным ферментом за определенный промежуток времени, то понятие активность фермента в клетке характеризует итог действия в клетке всех молекул данного фермента.

Активность фермента зависит от каталитической эффективности фермента, количества его молекул в клетке и от количества субстрата реакции. Количество фермента в клетке зависит от интенсивности биосинтеза этого фермента в клетке или его деградации. Количество субстрата, в свою очередь, зависит от интенсивности его образования в клетке или интенсивности его транспорта через биологическую мембрану. При изменении величины любой из этих характеристик активность фермента изменяется.

Каталитическая эффективность фермента — это активность фермента при постоянном количестве молекул данного фермента. Каталитическая эффективность фермента зависит от состояния его активного центра. Все факторы, влияющие на конформацию фермента,

а следовательно, и на конформацию его активного центра, влияют на каталитическую эффективность фермента. На конформацию фермента, а значит, и на его способность выполнять каталитическую функцию, влияют следующие физико-химические и химические факторы.

Во-первых, это температура. От температуры зависит количество и состояние водородных связей в молекуле белков, а также способность отдельных атомов (или групп) молекулы к образованию между ними более прочных, например, ковалентных связей. Все ферменты обладают термолабильностью, т. е. их активность зависит от температуры. У теплокровных животных ферменты активны в диапазоне температур от 20 до 60 °C. Более высокие температуры приводят к труднообратимым изменениям конформации. Они обусловлены, главным образом, изменением числа и места водородных связей, образованием ковалентных связей, как это происходит при денатурации молекул некоторых белков. Понижение температуры стойко инактивирует фермент. Его активность может восстанавливаться при повышении температуры до оптимальных значений.

Во-вторых, каталитическая эффективность зависит от реакции среды, т. е. от рн в клетке. Реакция среды влияет на состояние ионизируемых групп в молекуле фермента, т. е. свободных, не участвующих в образовании пептидных связей карбоксильных (-СООН~) и амино (-ГПН₃+) групп. От состояния этих групп зависит заряд молекулы белков. Заряд молекулы, в свою очередь, является одним из факторов, влияющих на конформацию молекулы, а также на наличие у нее гидратной оболочки.

Для каждого фермента известно значение pH, при котором суммарный заряд его молекулы равен нулю, то есть белок находится в изоэлектрическом состоянии (ИЭС). Значение pH, при котором белок переходит в иэс, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ ферменты, как правило, не активны. Вместе с тем для большинства ферментов максимум их активности наблюдается вблизи их ИЭТ.

Поэтому изменение в клетке, межклеточной жидкости или крови реакции среды, например, смещение ее в кислую сторону, приводит к изменениям функциональных способностей ферментов и других белков клетки: каналоформеров, рецепторов, шаперонов и т. д. Итогом этого может явиться изменение уровня метаболической активности клетки вплоть до ее гибели. Так, например, происходит при голодании или при сахарном диабете, когда интенсивно образуются так называемые кетоновые тела, большинство из которых является карбоновыми кислотами. Повышение их содержания в крови приводит к ацидозу, т. е. смещению pH крови в кислую сторону. Следствием изменения pH крови и межклеточной жидкости является изменение активности ферментов крови, что приводит к ухудшению функционального состояния клеток организма. Кроме того, повышенный уровень глюкозы приводит к ее присоединению к белкам крови — к их гликелированию, в том числе и белков-ферментов, что отрицательно влияет на их функциональные способности.

В-третьих, каталитическая эффективность ферментов зависит от действия эффекторов — веществ, присоединение которых к молекуле фермента в его определенном участке, как правило, в активном или аллостерическом центре, изменяет активность фермента. Вещества, увеличивающие активность ферментов, называются активаторы, а уменьшающие ее — ингибиторы. Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению конформации активного центра. Соединение его с активным центром, как правило, ингибирует фермент, блокирует активный центр, препятствуя соединению с ним субстрата.

Одни эффекторы могут отсоединяться от аллостерического или активного центра, они обратимо изменяют активность ферментов. Другие необратимо изменяют структуру активного центра фермента или блокируют его, т. е. необратимо ингибируют фермент. Примером необратимых ингибиторов являются ионы тяжелых металлов.

Различают неконкурентное и конкурентное ингибирование. Конкурентное ингибирование осуществляется веществами, сходными по строению с субстратом. Конкурентные ингибиторы имеют участок молекулы или функциональные группы, сходные с участком молекулы субстрата, взаимодействующим с активным центром фермента. Вследствие этого ингибитор способен связываться с активным центром и препятствовать попаданию на него субстрата. Происходит «конкуренция» за место в активном центре между субстратом и ингибитором. Вследствие теплового движения атомов и молекул возможность соединения субстрата или конкурентного ингибитора с активным центром имеет вероятностный характер. Вероятность взаимодействия с активным центром субстрата или ингибитора зависит от их концентрации, увеличение концентрации субстрата устраняет конкурентное ингибирование (уменьшает его выраженность), так как увеличивается вероятность его соединения с активным центром.

Неконкурентное ингибирование может осуществляться как через аллостерический, так и через активный центр. Оно не устраняется добавкой субстрата. Неконкурентными ингибиторами являются, как правило, низкомолекулярные соединения или ионы металлов. Присоединение неконкурентного ингибитора к аллостерическому центру обычно обратимо уменьшает активность фермента, и при попадании его в активный центр фермент необратимо ингибируется.

Нередко активность фермента в клетке регулируется по принципу отрицательной обратной связи, и вещества, образующиеся в клетке (метаболиты), являются элементом этой обратной связи. Так, продукты реакции, катализируемой каким-либо ферментом, или фермент, катализирующий последнюю из нескольких реакций процесса, ингибируют первую реакцию этого процесса.

Встречаются случаи ингибирования фермента, как неконкурентного, так и конкурентного, участвующего в каком-либо процессе, продуктами, образующимися в другом процессе. Например, в митохондриях малоновая кислота (малонат), как продукт метаболизма жирных кислот, может ингибировать фермент сукцинатдегидрогеназу. Этот фермент катализирует одну из реакций цикла Кребса: превращение его субстрата — сукцината (янтарной кислоты) в фумарат (фумаровую кислоту). Активный центр данного фермента связывается с двумя карбоксильными группами субстрата. Обе кислоты (малат и сукцинат) имеют по две карбоксильные группы, только у малата они соединены с одним атомом углерода, а у сукцината — с соседними атомами углерода. Вследствие этого малоновая кислота — это конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы, так как она сходна по строению с субстратом этого фермента. При соединении малоновой килоты с активным центром сукцинатдегидрогеназы этот фермент некоторое время не активен.

Еще один способ увеличения каталитической эффективности фермента — это его активация, т. е. превращение из неактивной формы фермента в активную. Многие ферменты, в частности, из тех, которые действуют вне клетки, где они были синтезированы, например, в пищеварительном тракте или в крови, секретируются в неактивной форме, то есть в виде проферментов (зимогенов). Профермент (зимоген) — это неактивная форма фермента. Активация проферментов происходит, например, путем удаления участка молекулы профермента, препятствующего взаимодействию субстрата с активным центром, с помощью другого фермента. Например, клетки поджелудочной железы выделяют в 12-перстную кишку неактивный профермент трипсиноген. Фермент кишечника энтеропептидаза, «отрезая» от трипсиногена концевой фрагмент его молекулы, закрывающий активный центр, превращает его в активный фермент трипсин, гидролизующий пептиды. Процесс свертывания крови при механическом повреждении сосудов (гемостаз) обеспечивается каскадом превращений неактивных факторов свертывания крови — белков протеаз — в активные ферменты. Причем активная форма каждого предыдущего фактора активирует проферментную (зимогенную) форму последующего фактора свертывания крови. Известен вариант активации профермента путем изменения его конформации без изменения первичной структуры. Например, соляная кислота в желудке создает сильнокислую среду. Это обеспечивает превращение пепсиногена, то есть неактивного зимогена, секретируемого клетками желудка, в активный фермент пепсин, гидролизирующий белки.

Другой способ увеличения каталитической эффективности ферментов в клетках организма — это фосфорилирование, то есть присоединение к ферменту остатка фосфорной кислоты. Такая активация ферментов осуществляется протеинкиназами — ферментами, «специализированными» на фосфорилировании белков. Протеинкиназы, в свою очередь, активируются с помощью циклических нуклеозидмонофосфатов (ц-АМФ, ц-ГТФ) или ионов кальция. Протеинкиназы являются элементом различных систем посредников, действующих в клетке при ее взаимодействии с различными веществами-регуляторами, синтезированными, как правило, в других клетках организма.

Некоторые ферменты присутствуют в организме в виде множественных форм одного и того же фермента — изоферментов. Они катализируют одну и ту же реакцию, т. е. имеют сходное строение активного центра, но отличаются по количеству и набору субъединиц белка, по активности и по их отношению к активаторам и ингибиторам. Как правило, в различных тканях наиболее активна одна из изоферментных форм. Изоферменты «согласуют» скорость и направленность катализируемой ими реакции с особенностями метаболизма в ткани, в которой происходит процесс, включающий в себя эту реакцию. Действие той или иной изоферментной формы определяет интенсивность протекания процесса и дальнейшую направленность метаболизма.

Например, известно 5 изоферментных форм лактатдегидрогиназы — одного из ферментов гликолиза, катализирующего реакцию взаимопревращения пировиноградной и молочной кислот. Все формы состоят из двух типов субъединиц — Н и М. Причем в состав каждой из изоформ входят 4 субъединицы. Они могут быть все одинаковыми (ЛДГ-1}: НННН; ЛДГ-1₅: ММММ) или отличаться (ЛДГ-1₂: НННМ, ЛДГ-1₃: ННММ ЛДГ-1₄: НМММ). В различных тканях и органах наиболее активна одна из форм этого фермента, например, в скелетных мышцах — ЛДГ-1₅, а в миокарде — ЛДГ-1₅. Соотношение изоферментных форм в сыворотке крови имеет диагностическое значение. Известно, что у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, содержание ЛДГ-1₂ выше, а ЛДГ-1₃ и ЛДГ-1₄ ниже, чем у здоровых людей, а при заболеваниях печени повышено содержание ЛДГ-1₅.

Количество молекул ферментов и количество субстрата в клетке как факторы, влияющие на активность фермента, зависят от интенсивности биосинтеза этих ферментов так же, как и других белков

клетки — каналоформеров, переносчиков. Вследствие этого индукторы — вещества, влияющие на интенсивность транскрипции генов, кодирующих информацию об этих белках, а следовательно, и на интенсивность их биосинтеза, влияют на активность ферментов. Индукторами транскрипции могут быть некоторые экзогенные вещества, например, жирорастворимый витамин Д, а также вещества, образующиеся в клетке в ходе метаболизма. Вместе с тем, как правило, индукторами биосинтеза различных белков клетки, в том числе ферментов, переносчиков, каналоформеров являются некоторые из веществ-посредников, каскад взаимодействий между которыми «запускают» вещества-регуляторы.

Таким образом, вещества-регуляторы как продукты метаболизма одних клеток организма взаимодействуют с другими клетками организма и влияют на активность определенных ферментов в этих клетках. Результатом взаимодействия с клеткой веществ-регуляторов может быть, во-первых, изменение каталитической эффективности определенных ферментов этой клетки. Во-вторых, это увеличение числа молекул ферментов, или изменение количества субстрата реакции, так как вещества-регуляторы влияют на интенсивность биосинтеза различных белков клетки, ферментов, переносчиков и каналоформеров.

Следовательно, активность ферментов — это объект регуляции системы саморегуляции организма. Активность ферментов в клетке, в том числе и их набор (пул) регулируется как веществами, вырабатываемыми в той же клетке, где действуют эти ферменты (метаболитами, другими ферментами), так и веществами, вырабатываемыми в других клетках организма. В данной работе вещества, взаимодействующие с белками-рецепторами их клеток-мишеней и выполняющие регуляторную функцию, в частности, изменяющие активность ферментов и интенсивность их биосинтеза, называются веществамирегуляторами. При изменении активности определенных ферментов изменяется уровень функциональной активности отдельных клеток и соответственно уровень функционирования отдельных органов и всего организма в целом.