Биочипы. 
Основы биотехнологии. В 2 ч. Часть 2 -

Успехи в области развития молекулярной биологии и микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосенсоров к новым решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарную технологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытий и т. д.) для изготовления биочипа, объединяющего сенсорную систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор с целью измерения аналитического сигнала и расчета результатов анализа.

Прообразом современных биочипов послужил Саузернблотт, изготовленный в 1975 г. Э. Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке. В России ученые начали активно разрабатывать биочипы только в конце 1980;х гг. в Институте молекулярной биологии РАН под руководством А. Д. Мирзабекова.

Технология микрочипов — это принципиально новый уровень лабораторных исследований, который позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещают на пластинки для создания соответственно ДНК-чипов или белковых чипов. Эти миниатюрные приборы используют для анализа специфических взаимодействий биологических макромолекул. Зондами в таких чипах могут служить олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, рецепторы, лиганды и др.

За короткое время биочипы выделились в самостоятельную область анализа с приложениями — исследования фундаментальных проблем молекулярной биологии и молекулярной эволюции до практического применения в медицине, фармакологии, экологии, судебно-медицинской экспертизе и др.

Биочип и принцип его работы.

Существует несколько разновидностей биочипов — матричные (с иммобилизованной ДНК), микрофлюидные (капиллярные) и биочипы с использованием микросфер с цветовой кодировкой.

У современных микрочипов размеры ячеек лежат в пределах 50—200 микрон; характерные объемы, относящиеся к отдельной ячейке, составляют примерно от 1 нл до 1 мкл; значения концентраций анализируемых макромолекул находятся обычно в пределах до 10 мкМ. Общее число ячеек на чипе составляет 10³—10⁵, а его линейные размеры составляют приблизительно 1 см.

Микрозонды, которые должны взаимодействовать с образцом, наносят на подложку размером не больше почтовой марки. Каждый микрозонд имеет форму капельки, составляющей около 100 микрон в поперечнике. Все ячейки одного микрозонда одинаковы по размеру и располагаются с плотностью 10—30 «капелек» на 1 мм². Чипы, на которых проходит ферментативная реакция, имеют более редкое расположение ячеек, чем чипы, на которых идет ДНК-реакция. Такая технология позволяет на одном биочипе разместить анализатор фактически всего генома человека — от 30 до 100 тыс. генов. При этом детектируется наличие участков ДНК длиной от шести до нескольких тысяч нуклеотидов — в зависимости от поставленной задачи.

Чаще всего для изготовления чипов служат пластинки из стекла, пластика, полупроводника или металла, на которые наносят биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

Во всех многопараметрических биочипах используют какой-либо механизм химического взаимодействия. Молекулы исследуемого образца соединяются со своей «парой» (микрозондом), помещенной в одну из нескольких тысяч ячеек на чипе. Например, нити ДНК соединяются со своей комплементарной парой, антиген — со своим антителом, субстрат — со своим ферментом. Наличие того или иного вещества или гена в образце определяют по люминесцентному свечению на прореагировавшем чипе. Флуоресценция является основным, но далеко не единственным методом изучения гибридизации. В частности, данные о характере гибридизации можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

В зависимости от того, какие макромолекулы используются, выделяют различные виды биочипов, ориентированные на разные цели. В настоящее время преобладает производство ДНК-чипов (94%), т. е. матриц, несущих молекулы ДНК. Оставшиеся 6% составляют белковые чипы.

В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между прямой и комплементарной ДНК по правилу Уотсона — Крика (А/Т или G/С). Гибридизуемая ДНК обычно заранее нарабатывается в достаточных количествах с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Далее в ходе реакции на чипе происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК: одна из них с известной последовательностью нуклеотидов зафиксирована на пластине, а другая одноцепочечная ДНК-мишень, меченная флуоресцентной меткой, наносится на ДНК-чип.

Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность через игольчатые растры (пины) механического робота или с помощью технологии типа струйного принтера. Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флуоресцентной или радиактивной метки. Свойства флуоресцентного красителя не должны сильно зависеть от состава ДНК (А/Т или G/С) и температуры.

При взаимодействии биочипа с исследуемым образцом, предварительно обработанным светящимся (флуоресцентным) красителем, в соответствующих ячейках происходит химическая реакция, и тогда эти ячейки начинают светиться — тем сильнее, чем интенсивнее процесс. Анализ прореагировавших чипов производится автоматически с помощью анализатора (чип-детектора), который представляет собой широкопольный микроскоп, соединенный с видеокамерой и компьютером. По сути, именно в выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора — анализатора биочипов. Так определяются различные характеристики образца, например присутствие в организме тех или иных возбудителей инфекций или наличие в геноме каких-либо измененных генов.

В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10—20 микрон, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Иммобилизация осуществляется за счет образования ковалентных связей с помощью фотореакции при облучении ультрафиолетовым излучением. В гелевых биочипах взаимодействие между молекулами ДНК примерно такое же, как и в растворе. Кроме того, благодаря трехмерной конфигурации ячейки, в таких биочипах общее число иммобилизуемых молекул ДНК существенно выше, чем в поверхностных микрочипах, что приводит, соответственно, к более сильному сигналу флуоресценции из ячейки.

Особенностью российских гелевых биочипов является то, что такие гели удерживают большее количество пробы, нежели двухмерные, и потому чувствительность отечественных биочипов выше, а следовательно, ниже требования к регистрирующей аппаратуре. Немаловажно и то, что реакции в объемном геле протекают так же, как и в жидкостях, т. е. как в живом организме. Это позволяет получить результат, максимально приближенный к реальности.

На Западе исследователи пошли по другому пути и разработали для создания ДНК-чипов процесс фотолитографии, аналогичный процессу производства кремниевых процессоров. Например, Affimetrix (США) создал СепеСЫртехнологию, основанную на высокоплотных чипах, содержащих ДНК-последовательности.

ДНК-микрочипы применяют с целью практического использования информации, полученной в результате секвенирования геномов человека и других живых организмов, а именно для:

• — идентификации мутаций в генах, связанных с различными заболеваниями;
• — наблюдений за активностью генов;
• — диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода терапии;
• — идентификации генов, важных для продуктивности сельскохозяйственных культур;
• — скрининга микроорганизмов, как патогенных, так и полезных, например используемых для восстановления зараженных органическими отходами почв.

Чтобы использовать известные последовательности генов и геномных карт, необходимо определить функции входящих в их состав генов. Без белковых микрочипов эта работа очень трудоемка.

Белковые биочипы, несущие молекулы, «чувствительные» к различным низкомолекулярным соединениям, уже в скором будущем позволят определять наличие широкого спектра лекарственных веществ, гормонов, наркотиков, ядов, пестицидов практически в любом анализируемом материале (кровь, вода, пища или образец почвы), а также множество различных аллергенов, онкогенов, биологически активных веществ и даже генетических дефектов. Технология белковых биочипов заменит целые иммунологические лаборатории и даст возможность увеличить производительность большинства диагностических методов в тысячи раз, резко снизив себестоимость анализов.

Белковые микрочипы предполагается использовать для:

• — обнаружения белковых биомаркеров, характерных для различных заболеваний и даже разных их стадий;
• — оценки потенциальной эффективности и токсичности препаратов в доклинических испытаниях;
• — измерения различий в синтезе белков отдельными типами клеток; клетками, находящимися на разных стадиях развития; здоровыми и патологически измененными клетками;
• — изучения взаимосвязи между структурой и функциями белков;
• — оценки экспрессии белков с целью выявления мишеней для новых лекарственных препаратов;
• — изучения взаимодействий между белками и другими молекулами.

Фундаментальный принцип, положенный в основу технологии микрочипов, вдохновил исследователей на создание большого числа устройств для решения широкого спектра научных задач и создания новых продуктов. Это тканевые и клеточные микрочипы, микрочипы на основе малых молекул.