Молочнокислое брожение. 
Основы микробиологии

При молочнокислом брожении, вызываемом специфичной группой бактерий, происходит распад глюкозы до молочной кислоты. Среди побочных продуктов молочнокислого брожения отмечены ацетат, диоксид углерода, иногда и этанол.

Известны три типа брожения, вызываемого молочнокислыми бактериями:

• гомоферментативное молочнокислое брожение, при котором из глюкозы образуется только молочная кислота:

• гетероферментативное молочнокислое брожение, когда из глюкозы кроме молочной кислоты получаются этанол и диоксид углерода:

• брожение, вызываемое бифидобактериями, — бифидоброжение, при котором из глюкозы образуются ацетат и лактат:

В основе гомоферментного молочнокислого брожения лежат реакции гликолиза (пути Эмбдена — Мейергофа — Парнаса). Образующийся в результате пируват, однако, не подвергается декарбоксилированию до ацетальдегида, как при спиртовом брожении, а восстанавливается до лактата водородом, отщепляющимся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата:

Образование D (-)-, L (+) — или DL-форм молочной кислоты определяется наличием у молочнокислых бактерий стереоспецифичных D-, Lили DL-лактатдегидрогеназ. Незначительная часть пирувата подвергается декарбоксилированию, что приводит к образованию ацетата, этанола и С0₂, а также ацетоина.

У гетероферментативных молочнокислых бактерий отсутствуют главные ферменты гликолиза — фруктозобисфосфатальдолаза и триозофосфатизомераза. Поэтому начальное превращение глюкозы идет у данных бактерий исключительно по пентозофосфатному пути до образования рибулозо-5-фосфата. Последний под действием фермента эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, а затем в результате реакции, катализируемой пентозофосфаткетолазой, расщепляется на глицеральдегид-3-фосфат и ацетилфосфат. В дальнейшем глицеральдегид-3-фосфат превращается в пируват, а затем в лактат, как и при гомоферментативном молочнокислом брожении, а из ацетилфосфата образуются ацетат и этанол.

Бифидоброжение осуществляется по пентозофосфатному пути или по пути Энтнера — Дудорова с конечными продуктами в виде ацетата и лактата.

Нередко в сбраживаемых молочнокислыми бактериями (Streptococcus cremoris и Leuconostoc cremoris) средах накапливаются небольшие количества ацетоина и диацетила — веществ, обладающих своеобразным приятным ароматом. Последний передается продуктам, в которых развиваются указанные бактерии.

Кроме глюкозы, молочнокислые бактерии сбраживают большое количество сахаров: фруктозу, галактозу, маннозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и пентозы. При сбраживании перечисленных соединений наблюдаются некоторые отклонения от обычных схем брожения. Например, при брожении фруктозы образуются лактат, ацетат, С0₂ и маннитол.

По форме клетки молочнокислые бактерии представляют собой палочки (длинные и короткие) и кокки; они могут образовывать парные или цепочковидные скопления. Это неподвижные, не образующие спор (за исключением Sporolactobacillus inulinus) грамположительные организмы. Молочнокислые бактерии — анаэробы, но они аэротолерантны, т. е. могут расти при доступе кислорода.

Молочнокислые бактерии обладают высокой бродильной способностью и отличаются отсутствием большинства биосинтетических путей. Это обусловливает высокую требовательность рассматриваемых бактерий к источникам питания, которая удовлетворяется лишь на таких средах, как ткани растений, молоко, содержимое желудочно-кишечного тракта животных. Источником энергии для этих бактерий служат главным образом монои дисахариды (полисахариды сбраживают только отдельные виды). Некоторые молочнокислые бактерии способны ассимилировать органические кислоты, например лимонную.

Молочнокислые бактерии требовательны к источникам азотного питания — они используют органические формы азота. Многие молочнокислые бактерии могут ассимилировать белки, хотя лучше развиваются на аминокислотах, пептидах и полипептидах. Продукты распада белковой молекулы прекрасно усваиваются этими бактериями. Прежде считали, что молочнокислые бактерии не усваивают солей аммония. Сейчас описаны отдельные возбудители молочнокислого брожения, способные расти на минеральном азоте, но в природе они встречаются редко.

Кроме веществ, содержащих углерод и азот, молочнокислым бактериям необходимы фосфор, калий, кальций и другие элементы, которые обычно поступают в среду с различными минеральными соединениями. Большинство молочнокислых бактерий нуждается и в ростовых веществах. Отдельным бактериям для развития требуется рибофлавин. При этом результатом их собственного обмена веществ может быть другое ростовое вещество, например витамин 1^.

Молочнокислые бактерии развиваются в довольно широком диапазоне температур. Для большинства видов предпочтительны температуры от 7 до 42 °C при оптимуме 30—40 °С. Однако в природе встречаются формы, способные размножаться в зоне более низких (минимум 3 °С) или более высоких (максимум 57 °С) температур. Молочнокислые бактерии не образуют спор, поэтому при повышении температуры выше указанного предела быстро погибают.

Многие молочнокислые бактерии растут в диапазоне pH 5,5—8,8, однако лучше размножаются при нейтральной реакции среды. В результате жизнедеятельности они значительно подкисляют питательную среду, поэтому приспособились к существованию в зоне довольно высокой кислотности среды. Палочковидные формы выносят более низкие значения реакции среды, чем кокковидные. Это кислотолюбивые организмы, оптимум для них обычно составляет pH 5,5—5,8 и менее, как правило, они растут при pH 5, некоторые при pH 2,9—3,2.

Кратко остановимся на характерных особенностях, свойственных отдельным представителям молочнокислых бактерий (поданным Е. И. Квасникова, О. А. Нестеренко).

Кокковые формы молочнокислых бактерий, осуществляющих гомоферментативное брожение, представлены семейством Streptococcaceae, родами Streptococcus и Pediococcus.

Бактерии рода Streptococcus имеют круглые или слегка овальные клетки диаметром 0,5—1 мкм, расположенные одиночно, парами или в цепочках. Глюкозу эти микроорганизмы сбраживают с образованием в основном правовращающей молочной кислоты. Они широко распространены в природе — на растениях, в почве, навозе, молоке и других субстратах, используются в ряде пищевых производств. К данному роду относят виды S. lactis, S. lactis var. diacetilactis, S. cremoris, S. thermophilus.

S. lactis — молочнокислый стрептококк, имеет клетки овальной формы, расположенные в коротких цепочках или соединенные попарно. Кроме моносахаридов, сбраживает лактозу и мальтозу. Оптимальная температура для развития 30—35 °С.

S. cremoris — сливочный стрептококк, отличается от молочнокислого тем, что его клетки располагаются в длинных цепочках. Температурный оптимум для вида составляет 25—30 °С. В процессе брожения образует повышенное количество летучих кислот. S. cremoris, как и S. lactis, используют при производстве кисломолочных продуктов, кислосливочного масла и сыров.

S. lactis var. diacetilactis образует при брожении молока и молочных продуктов повышенное количество летучих кислот и ароматические вещества, основное из последних —диацетил. Микроорганизм обладает способностью сбраживать лимонную кислоту. Температурный оптимум для него 25— 30 °C. Данный стрептококк улучшает вкус и аромат молочных продуктов, поэтому его используют вместе со S. lactis и S. cremoris в заквасках для кисломолочных продуктов, кислосливочного масла и сыров.

S. thermophilus может развиваться при повышенной температуре (около 50 °С). Сходен со S. cremoris. Сбраживает сахарозу. Применяется вместе с болгарской палочкой (Lactobacillus bulgaricus) для приготовления южных простокваш. Играет важную роль в производстве некоторых сыров (швейцарский).

Представители рода Pediococcus — грамположительные неспорообразующие неподвижные кокки, располагающиеся кучками, тетрадами, парами или единично. Осуществляют гомоферментное молочнокислое брожение с образованием DL-молочной кислоты. Оптимальное для видов рода значение pH 5. Бактерии предпочитают анаэробные условия. Обитают в бродящих растительных материалах—квашеных овощах, силосе, а также в сыре, молоке, в пищеварительном тракте животных и т. д. Среди видов рода наиболее интересны Р. damnosus, Р. acidi-lactici, Р. dextrinicus, Р. halophilus.

Палочковидные бактерии, осуществляющие молочнокислое брожение, относятся к сем. Lactobacillaceae, роду Lactobacillus. Характеризуются значительным разнообразием формы от короткой коккообразной до длинной нитевидной. Располагаются единично, парами или цепочками.

Бактерии этого рода обнаруживают в молочных, зерновых и мясных продуктах, пиве, вине, соленьях и маринадах, в воде и сточных водах, а также в ротовой полости и кишечном тракте человека и животных. Сбраживают сахара с образованием главным образом молочной кислоты. Для Lactobacillus оптимум pH 5,5—5,8, но они могут развиваться при pH 5 и ниже.

Среди гомоферментативных молочнокислых палочек можно выделить две группы — Thermobacterium и Streptobacterium. Первая группа представлена организмами, которые, как правило, растут при 45 °C и выше, обычно не развиваются при 20 °C и никогда не растут при 15 °C. При брожении с их участием образуются D-, Lили DL-молочная кислоты. В образовании D (-)-молочной кислоты принимают участие!, delbrueckii, L. leichmannii, L. lactis иL. bulgaricus', DL-молочной кислоты — L. helveticus и L. acidophilus (рис. 37).

По биохимическим особенностям перечисленные виды очень близки между собой. L. bulgaricus обычно выделяют из южных кисломолочных продуктов, L. helveticus — из сыров (швейцарского, советского), L. acidophilus — из кишечника человека. Молоко, сквашенное при участии ацидофильной палочки, служит хорошим лечебным средством при желудочно-кишечных заболеваниях.

Представители второй группы гомоферментативных молочнокислых бактерий при развитии в молоке образуют короткие цепочки. Это группа менее активных молочнокислых палочек. Они хорошо развиваются при 15—38 °С, оптимум для них составляет 30 °C. В молоке, молочных продуктах и на растениях обычно обнаруживают несколько видов бактерий второй группы: L. casei, L. xylosus, как правило, участвуют в образовании L (+)-молочной кислоты, L. plantarum, L. curvatus образуют DL-молочную кислоту. L. casei играет важную роль в созревании сыров. L. plantarum принимает участие в молочнокислом брожении при квашении овощей и силосовании.

Рис. 37. Форма и расположение клеток у трех родов молочнокислых бактерий:

А —Lactobacillus; Б — Streptococcus; В — Pediococcus, Х2180 (по: Р. Стейниер) Гетероферментативное молочнокислое брожение осуществляют представители родов Leuconostoc, Lactobacillus (подрод Betabacteriuni), Bifidobacterium.

Бактерии рода Leuconostoc имеют вид сферических или чаще чечевицеобразных клеток. Клетки располагаются единично, парами или в коротких цепочках, кучкообразных скоплений не обнаружено. Грамположительные. Спор не образуют. Глюкозу сбраживают с образованием Э (-)-молочной кислоты, этилового спирта и С0₂. Факультативные анаэробы, оптимум температуры для них составляет 20—30 °С. На средах с сахарозой у этих организмов появляется толстая наружная оболочка из слизи или декстранов.

Виды рода обнаруживаются главным образом на растительных материалах (иногда в молоке). Сбраживают монои дисахариды, не могут питаться более сложными углеводами. Существует ряд видов рода Leuconostoc, различающихся по морфологическим и физиологическим признакам.

I. mesenteroides и L. dextranicum принимают активное участие в сбраживании углеводов при квашении капусты и силосовании. L. dextranicum и L. cremoris сбраживают лимонную кислоту с образованием диацетила, поэтому они могут быть компонентами заквасок, применяемых в маслои сыроделии.

Гетероферментативные лактобациллы (бета-бактерии) —Lactobacillusfermentum, L. brevis, L. cellobiosus — и другие сбраживают глюкозу с образованием DL-молочной кислоты, С0₂, уксусной кислоты и этилового спирта. Обычно они встречаются на растениях, обнаружены в хлебных заквасках. Это небольшие палочки, имеющие температурный максимум около 45 °C.

К роду Bifidobacterium относятся бактерии, имеющие неподвижные, прямые или разветвленные палочки, клетки раздвоенной V-формы, булавовидной или лопатовидной формы. Не образуют спор, грамположительные. Глюкозу сбраживают главным образом до уксусной и L (+)-молочной кислот. Строгие анаэробы, не переносят присутствия С0₂; оптимум температуры для них составляет 36—38 °С. Известно более 20 видов бифидобактерий; типичный представитель рода — В. bifidum.

Бифидобактерии — обитатели кишечника человека, животных, насекомых и т. п. Установлено, что представители рода Bifidobacterium составляют от 50 до 90% микробного содержимого фекалий человека. Способность молочнокислых бактерий синтезировать органические антибиотики (низин, диплококцин, лактолин, бревин и др.) и продуцировать органические кислоты позволяет предположить, что эти организмы — антагонисты гнилостной и болезнетворной кишечной микрофлоры человека и животных.

Молочнокислые бактерии имеют огромное практическое значение. Их широко используют при изготовлении кисломолочных, квашеных продуктов, сыров, кислосливочного масла и т. п. Молочнокислые бактерии, встречающиеся обычно в молоке, вызывают его сквашивание. В различных климатических зонах земного шара в молоке обитают неодинаковые виды молочнокислых бактерий. Молоко в северной зоне обычно содержит Streptococcus lactis, в южной — палочковидные бактерии L. bulgaricus и др. В связи с этим кислое молоко разных зон неодинаково по вкусовым качествам. В каждой стране существуют свои национальные кисломолочные продукты.

В производственных условиях кисломолочные продукты готовят, заражая пастеризованное молоко соответствующими чистыми культурами бактерий. В этих целях используют молочнокислый стрептококк (S. lactis), болгарскую палочку (L. bulgaricus), ацидофильную палочку (L. acidophilus) и др.

Ряд молочнокислых продуктов готовят, используя закваску, содержащую симбиотические комплексы микроорганизмов. Например, для приготовления кефира в молоко вносят так называемые кефирные зерна, внешне напоминающие миниатюрные головки цветной капусты. Они содержат Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, дрожжи Saccharomyces kefiri, сбраживающие лактозу. Продуктами брожения служат молочная кислота и спирт.

Смешанное брожение лежит также в основе приготовления кумыса из кобыльего молока. В данном случае молочнокислое брожение осуществляют термофильные молочнокислые палочки, близкие к Lactobacillus bulgaricus, и дрожжи рода Torula, сбраживающие лактозу. Сбраживаемое молоко периодически взбалтывают, в результате чего казеиновый сгусток мелко дробится. Йогурт готовят внесением в пастеризованное гомогенизированное молоко чистых культур Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus, а биойогурт получают сквашиванием молока культурами Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus.

Деятельность молочнокислых бактерий лежит в основе изготовления сыров. Процесс сыроделия представляет собой коагуляцию казеина молока под влиянием сычужного фермента, выделяемого из желудка жвачных животных. Получившиеся сгустки отделяют от сыворотки, прессуют, выдерживают в растворе соли, а затем оставляют лежать до созревания. Во время созревания в сырной массе идут сложные процессы, при которых значительная часть казеина под действием ферментов молочнокислых бактерий переходит в аминокислоты. Для изготовления некоторых сыров используют также пропионовокислые бактерии, плесневые грибы и т. д. Для улучшения качества сыров нередко применяют закваски молочнокислых бактерий.

Лактобациллы — Lactobacillus plantarum и L. coryneformis — используют в хлебопечении, лактобациллы и стрептококки — при изготовлении сырокопченых колбас. Молочнокислые бактерии вызывают брожение, продуктом которого служит лактат, они снижают pH среды, тем самым предохраняя от порчи колбасы, которые по технологии не подвергаются варке (салями, сервелат и др.). Квашение овощей и силосование кормов сводятся главным образом к молочнокислому брожению субстратов.