Аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения не ниже второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24 104.

Колориметр фотоэлектрический лабораторный (фотоэлектроколориметр) по ГОСТ 12 083, обеспечивающий измерения в интервалах длин волн 434−450 нм и 630−670 нм с погрешностью ± 1% абс (по коэффициенту пропускания) или 0,01 Д (по оптической плотности) или спектрофотометр.

Прибор для измерения рН среды в диапазоне 0 — 14 с погрешностью ± 0,1 рН.

Термостат или ультратермостат, обеспечивающий температуру нагрева (30,0 ± 0,2)°С.

Баня водяная.

Мешалка магнитная.

Термометры по ГОСТ 215 с пределами измерений 0 — 100 °C и ценой деления не более 0,01°С.

Холодильник бытовой.

Сухожаровой шкаф.

Стаканчики для взвешивания по ГОСТ 25 336.

Стаканы вместимостью от 100 до 2000 типа Кн по ГОСТ 25 336.

Колбы типа Кн вместимостью от 100 до 2000 мл по ГОСТ 25 336.

Колбы мерные наливные 1 или 2 исполнения вместимостью 100, 200, 250 и 1000 см³ по ГОСТ 1770.

Колба мерная с притертой крышкой вместимостью 200 мл.

Бюкс с притертой крышкой, Воронки типа В по ГОСТ 25 336.

Пипетки 1,2 и 3-го исполнения вместимостью от 0,5 до 20 мл по ГОСТ 20 292.

Пипетки автоматические вместимостью от 0,01 до 1 мл Пробирки П1−21−200, или П1−16−150, или П2−19−180, или П2−16−1501(180) по ГОСТ 25 336.

Бюретка типа № 1; 1,2 или 3 го исполнения по ГОСТ 20 292.

Эксикатор по ГОСТ 25 336.

Секундомер по ГОСТ 5072.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12 026.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10 163.

Кислота лимонная, раствор молярной концентрацией вещества эквивалента 0,1 моль/л .

Натрий фосфорнокислый вузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрацией 1/15 моль/л .

Калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4172, раствор молярной концентрации 1/15моль/л.

К-та соляная по ГОСТ 3118, раствор молярной концентрацией вещества эквивалента 0,1 моль/л. Приготовленный по ГОСТ 4232.

Йод.

Йодистый калий.

Вода дистиллированная.

Примечания:

• 1 Все реактивы должны быть квалификации ч.(чистый), х.ч.(химически чистый) или ч.д.а.(чистый для анализа).
• 2 Допускается использование импортной посуды и приборов с метрологическими характеристиками и реактивов с квалификацией не ниже отечественных.

Подготовка к анализу.

Приготовление растворов крахмала с концентрацией 1%(субстрата) (100 ± 0,01)г. 1,18 г. крахмала, взятого с учетом влажности помещения, засыпают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды, помещают в колбу в кипящую водяную баню не менее чем на 10−15минут, непрерывно перемешивая содержимое до полного растворения крахмала. После этого содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 мл ацетатного буферного раствора (для препаратов грибного происхождения), фосфатного буферного раствора (для препаратов из дрожжевых микроорганизмов). Объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой и содержимое колбы перемешивают, раствор должен быть прозрачный. Раствор крахмала готовят в день проведения анализа.

Приготовление фосфатного буферного раствора.

Смешивают растворы фосфорнокислого натрия и фосфорнокислого калия. Измеряют величину рН. В случае отклонения рН буфера от требуемого, соответствующими растворами доводят его до нормы.

Приготовление основного йода.

0,50 г йода и 5,00 г йодистого калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в небольшом количестве воды, содержимое перемешивают на магнитной мешалке при плотно закрытой крышке бюксы.

Раствор после полного растворения йода переносят в мерную колбу с притертой крышкой вместимостью 200 мл и объем доводят дистиллированной водой до метки Основной раствор йода хранят в течение одного месяца в склянке из темного стекла с притертой пробкой Приготовление рабочего раствора йода.

2 см основного раствора йода разводят раствором соляной кислоты с концентрацией 0.1 моль/л при анализе препаратов грибного происхождения и концентрацией 0.5 моль/л для препаратов бактериального происхождения с предполагаемой активностью больше 50 ед/мл в мерной колбе вместимостью 100 мл, перед употреблением рабочего раствора проверяют его оптическую плотность в диапазоне волн 434 — 450 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Оптическая плотность рабочего раствора йода должна быть равна (0,220 ± 0,01) в случае отклонения в рабочий раствор добавляют несколько капель соляной кислоты или йода Приготовление основного раствора очищенного ферментногопрепарата 0,1 — 1,00 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) растворяют в небольшом количестве воды, при необходимости тщательно растирая стеклянной палочкой, количество переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Препараты с нерастворимыми наполнителями фильтруют. Раствор хранят в течение суток при температуре от двух до 6 °C.

Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов.

Рабочий раствор готовят в соответствии с таблицей 1 из основного раствора для навески 0.1 г, разбавляя его дистиллированной водой так, что бы в 5 мл рабочего раствора содержалось масса ферментов, обеспечивающая в принятых условиях гидролиз крахмала от 20 до 60%.

Таблица 1. Приготовление рабочего раствора очищенных ферментных препаратов.

Для анализа две параллельные навески препарата и из каждой делают одно разведение, которое анализирует не мене трех раз. Рабочий раствор ферментного препарата непосредственно перед определением Приготовление основного раствора из воздушно-сухой культуры гриба 5 г исследуемой воздушно сухой культуры гриба, предварительно растертой в ступке, переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл, добавляют 90 мл дистиллированной воды и 10 мл ацетатного буфера буферного раствора с Ph4,7. Смесь выдерживают в течение одного часа в термостате при температуре (30.0±0.2) периодически перемешивая и затем фильтруют. Фильтрат используют в качестве основного раствора. Фильтрат хранят в течение суток при температуре от 2 до 6 °C.

Приготовление рабочего раствора из воздушно сухой культуры гриба.

Рабочий раствор готовят из основного раствора, разбавляя его в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2. Приготовление рабочего раствора из воздушно сухой культуры гриба.

Приготовление основного раствора культуральной жидкости бактериального происхождения: в мерную колбу вместимостью 100 мл наливают 90 мл дистиллированной воды и вносят 1 см испытуемой культуральной жидкости, объем доводят до метки дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 100 мл в соответствии с таблицей 3.

Таблица3. Приготовление основного раствора культуральной жидкости бактериального происхождения.

При анализе культур бактериального происхождения предполагаемой активностью 50 — 159 ед/см³ берут разведение фермента обеспечивающие гидролиз крахмала от 0,02 до 0,04 г. 4].

Проведение анализа. Берут две пробирки, наливают в каждую по 10 мл раствора крахмала (субстрата) и ставят в термостат или водяную баню с температурой (30 ± 0,2°С) на 5−10 минут, затем не вынимая пробирок из термостата наливают в первую 10 мл дистиллированной воды (контрольная пробирка), во вторую 10 мл рабочего раствора анализируемого продукта (опытная). Смеси быстро перемешивают в термостате в течение 10 мин.

Затем из каждой пробирки отбирают по 0,1 мл раствора, переносят в колбы с предварительно налитыми 10 мл рабочего раствора йода. Содержимое колб перемешивают, полученные растворы получают следующую окраску: контрольный раствор — синий цвет, опытный — фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизированного крахмала, через 5−10минут после смешивания определяют оптическую плотность растворов фотоэлектрическим колориметром в диапазоне длин волн 630−670 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм контрольным раствором является дистиллированная вода[4].