Методика восстановления динитроароматических соединений и токсикологическая оценка их производных

МИНОБРНАУКИ РОССИИ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова»

(ЯрГУ) Кафедра органической и биологической химии Дипломная работа

«Методика восстановления динитроароматических соединений и токсикологическая оценка их производных»

Студент группы Б-51

Лобанов Р.А.

Ярославль 2012

Реферат Объем 84 ст., 22 схемы, 2 диаграммы, 12 таблиц, 5 рисунков, 86 источников Ключевые слова: восстановление, селективность, аминоароматические соединения, ультразвук, сульфат железа (ІІ), 2,4-динитротолуол, 2,4-динитрохлорбензол, биотестирование, Ceriodaphnia affinis, смешанная культура Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda.

Объект исследования: динитроароматические соединения; тест-объекты, используемые для биотестирования: Ceriodaphnia affinis, смешанная культура Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda.

Цель работы: создание эффективного, экологически безопасного и ресурсосберегающего метода селективного восстановления динитроароматических соединений.

Задачи:

Выбор восстанавливающего агента;

Исследование селективности процесса восстановления;

Идентификация продуктов реакций;

Освоение методик проведения токсикологического теста на Ceriodaphnia affinis и на смешанной культуре водорослей (Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda) для оценки степени токсичности исследуемых соединений;

Определение летальной концентрации веществ, вызывающую гибель 50% тест-организмов (LC₅₀).

Краткая аннотация полученных результатов В данной работе были исследованы закономерности селективного восстановления динитроаренов металлами переменной степени окисления в бинарной системе под действием ультразвука.

В качестве восстанавливающих агентов применялись хлорид олова (II), хлорид титана (III), сульфат железа (ІІ) в среде различных растворителей. При этом, при использовании сульфата железа (ІІ) наблюдается наиболее высокий выход продукта.

Установлено, что более реакционно-способной в реакции селективного восстановления динитроароматического соединения хлоридами и сульфатами металлов переменной степени окисления является орто-нитрогруппа.

Предложена методика селективного восстановления динитроаренов в бинарных системах под действием ультразвука.

На примере 2,4-динитрохлорбензола установлено, что при использовании в качестве восстановителя свежеприготовленного сульфата железа (ІІ), в качестве растворителя изо-бутилового спирта под действием ультразвука, выход орто-изомера составил 75,4% (по данным газожидкостной хроматографии).

В результате проведенного токсикологического эксперимента с использованием тест-объектов Ceriodaphnia affinis и на смешанной культуре водорослей (Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda), были установлены закономерности их токсичности от строения химического вещества.

Содержание Введение

1. Литературный обзор

1.1 Существующие подходы к синтезу нитроанилинов

1.2 Селективность процесса восстановления

1.3 Критерии токсичности

1.3.1 Понятие токсичности

1.3.2 Методы определения токсичности веществ

1.3.3 Биотестовый метод определения токсичности веществ

1.3.3.1 Тест-объекты, используемые для биотестирования

1.3.4 Химическое строение и действие токсических веществ

1.3.5 Пути проникновения в организм

1.3.6 Токсичность некоторых нитрои аминоароматических соединений

2. Результаты и обсуждения

2.1 Акустическое воздействие на бинарную систему и селективное восстановление динитроарен

2.2 Токсикологический эксперимент

2.2.1 Экспериментальные данные по биологической активности аминои динитроарен

2.2.1.1 Эксперимент на цериодафниях

2.2.1.2 Эксперимент на водорослях

2.2.2 Значение липофильности для нитросоединений и анилинов

3. Экспериментальная часть

3.1 Методика проведения селективного восстановления динитроароматических соединений под действием ультразвука

3.2 Эксперимент на Ceriodaphnia affinis Цериодафнии как тест-объект для токсикологических исследований

3.2.1 Методика проведения острого опыта на Ceriodaphnia affinis

3.2.2 Обработка и оценка результатов эксперимента на Ceriodaphnia affinis

3.3 Эксперимент на смешанной культуре Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda

3.3.1 Методика проведения острого опыта на смешанной культуре Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda

3.3.2 Обработка и оценка результатов эксперимента на Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda

3.4 Статистическая обработка результатов Приложение Выводы Литература

Введение

В настоящее время для интенсификации и повышения эффективности протекания химических реакций, приводящих к ценным органическим продуктам, используют различные подходы, включая гомои гетерогенный, межфазный, мицеллярный катализ, инициаторы, ультрафиолетовое излучение, высокое давление и многие другие физические воздействия.

Таким образом, наиболее актуальным является поиск новых способов осуществления химических превращений, обладающих рядом преимуществ, а именно: возможность проведения синтеза в более мягких условиях (низкая температура, без использования катализаторов и агрессивных сред), селективность процесса, облегчение выделения продуктов реакции, а так же снижение общего оперативного времени проведения реакций.

В последние годы достигнуты большие успехи в создании разных конструкций эффективных генераторов ультразвука, в связи с чем наблюдается повышенный интерес к использованию ультразвукового излучения для интенсификации различных химических реакций.

Поэтому, цель данной работы — создание эффективного, экологически безопасного и ресурсосберегающего метода селективного восстановления динитроароматических соединений.

В связи с чем были поставлены следующие задачи:

1) Выбор восстанавливающего агента;

2) Исследование селективности процесса восстановления;

3) Идентификация продуктов реакций;

4) Освоение методик проведения токсикологического теста на Ceriodaphnia affinis и на смешанной культуре водорослей (Chlorella vulgaris и Scenedesmus quadricauda) для оценки степени токсичности исследуемых соединений;

5) Определение летальной концентрации веществ, вызывающую гибель 50% тест-организмов (LC₅₀).

Создание экологически безопасного, дешевого, а так же ресурсосберегающего способа проведения селективного восстановления металлами переменной степени окисления нитроароматических веществ является ведущей задачей современной химической промышленности.

токсичность динитроароматический восстановление ультразвук

1. Литературный обзор

1.1 Существующие подходы к синтезу нитроанилинов Процессы получения ароматических соединений, содержащих одновременно нитрои аминогруппы, в том числе нитроанилинов, представляют как теоретический, так и практический интерес.

(1)

Этот класс ароматических соединений включает в себя большой ряд практически ценных продуктов моногоцелевого назначения. Они используются при получении лекарств [70], красителей [71,72] и др. Кроме того, отработка эффективных методологий синтеза соединений, содержащих подобные разнообразные функции (нитро-, аминогруппа, галогены и др.) является весьма актуальной для современного органического синтеза, поскольку служит базисом для инструментария при получении широких рядов заданных структур и их модификации.

На сегодняшний день для синтеза нитроанилинов используется целый набор методов.

Нитрогруппа отличается высокой стабильностью по отношению к электрофильным реагентам и разнообразным окислителям. Большинство нуклеофильных агентов за исключением литийи магнийорганических соединений, а также литийалюминийгидрида не действуют на нитрогруппу. Нитрогруппа относится к числу превосходных нуклеофильных групп в процессах активированного ароматического нуклеофильного замещения (S_NAr). Так, например, нитрогруппа в 1,2,4- тринитробензоле легко замещается под действием гидроксид-, алкоксид-ионов или аминов.

(2)

Наиболее важной реакцией ароматических нитросоединений является восстановление их до первичных аминов. Эта реакция была открыта в 1842 году Н. Н. Зининым, который впервые восстановил нитробензол до анилина действием сульфида аммония.

В настоящее время для восстановления нитрогруппы в аренах до аминогруппы в промышленных условиях применяется каталитическое гидрирование. В качестве катализатора используют медь на силикагеле в качестве носителя. Катализатор готовят нанесением карбоната меди из суспензии в растворе силиката натрия и последующим восстановлением водородом при нагревании. Выход анилина над этим катализатором составляет 98%.

(3)

Иногда в промышленном гидрировании нитробензола до анилина в качестве катализатора используют никель в комбинации с оксидами ванадия и алюминия. Такой катализатор эффективен в интервале 250−300^о и легко регенерируется при окислении воздухом. Выход анилина и других аминов составляет 97−98%. Восстановление нитросоединений до аминов может сопровождаться гидрированием бензольного кольца. По этой причине для получения ароматических аминов избегают использовать в качестве катализаторов платину, палладий или никель Ренея.

Другим методом восстановления нитросоединений является восстановление металлом в кислой или щелочной среде. Восстановление нитрогруппы до аминогруппы происходит в несколько стадий, последовательность которых сильно различается в кислой и щелочной среде. Рассмотрим последовательно процессы, протекающие при восстановлении нитросоединений в кислой и щелочной среде.

В качестве восстановителя применяют железо, олово, цинк и соляную кислоту. Эффективным восстановителем нитрогруппы является хлорид олова (II) в соляной кислоте. Этот реагент особенно эффективен в тех случаях, когда в ароматическом нитросоединений есть другие функциональные группы: CHO, COR, COOR и др., чувствительные к действию других восстановителей.

Восстановление нитросоединений до первичных аминов в кислой среде происходит ступенчато и включает три стадии с переносом двух электронов на каждой стадии.

(4)

В кислой среде каждый из промежуточных продуктов быстро восстанавливается до конечного продукта анилина и их не удается выделить в индивидуальном виде. Однако, в апротонных растворителях в нейтральной среде можно зафиксировать промежуточные продукты восстановления.

При восстановлении нитробензола натрием или калием в ТГФ сначала образуется анион-радикал нитробензола за счет переноса одного электрона от щелочного металла.

(5)

Катион щелочного металла связан в контактную ионную пару с атомом кислорода нитрогруппы анион-радикала. При дальнейшем восстановлении анион-радикал превращается в дианион, который после протонирования дает нитрозобензол.

(6)

Дальнейшее восстановление нитрозосоединений до N-арилгидроксиламина включает две аналогичные стадии одноэлектронного восстановления до анион-радикала и далее до дианиона нитрозосоединения, который при протонировании превращается в N-арилгидроксиламин.

(7)

Последняя стадия восстановления арилгидроксиламина до первичного амина сопровождается гетеролитическим расщеплением связи азот-кислород после протонирования субстрата.

(8)

В нейтральном водном растворе можно получить фенилгидроксиламин в качестве продукта восстановления нитробензола. Фенилгидроксиламин получается при восстановлении нитробензола цинком в водном растворе хлорида аммония.

(9)

Арилгидроксиламины легко восстанавливаются в амины при обработке железом или цинком и соляной кислотой.

(10)

Поскольку фенилгидроксиламин является промежуточным продуктом восстановления, его можно не только восстановить до анилина, но и окислить до нитрозобензола.

(11)

Это, вероятно, один из лучших методов получения ароматических нитрозосоединений, которые не удается иным способом выделить в качестве промежуточного продукта восстановления нитросоединений.

Ароматические нитрозосоединения легко димеризуются в твердом состоянии, причем их димеры бесцветны. В жидком и газообразном состоянии они мономерны и окрашены в зеленый цвет.

(12)

В щелочной среде нитрозобензол быстро взаимодействует со вторым промежуточным продуктом восстановления фенилгидроксиламином с образованием азоксибензола. Эта реакция по существу подобна присоединению азотистых оснований к карбонильной группе альдегидов и кетонов.

(13)

В лабораторных условиях азоксибензол с хорошим выходом получается при восстановлении нитросоединений боргидридом натрия в ДМСО, метилатом натрия в метиловом спирте или старым способом при использовании в качестве восстановителя As₂O₃ или глюкозы.

(14)

Азоксибензол при действии цинка в спиртовом растворе щелочи восстанавливается сначала до азобензола, а при действии избытка цинка далее до гидразобензола.

(15)

В синтетической практике производные азоксибензола могут быть восстановлены до азобензола. Он проявляет свойства жирорастворимого красителя и может быть использован для окраски технических жидкостей. Если в молекулу азобензола ввести аминоили оксигруппы, то цвет таких азокрасителей изменится с оранжево — красного до красного, при введении гидроксигрупп, до красного, при введении аминогрупп до сине-фиолетового.

Азобензол восстанавливается до анилина через гидразобензол, как установлено Н. Н. Зининым в 1845. Замещенные азобензолы обычно получают реакцией азсочетания диазсоединений, полученных диазотированием ароматических аминов и фенолов или ароматических аминов[2], под действием триалкилфосфита в качестве восстановителя. С другой стороны, азобензол легко окисляется до азоксибензола перкислотами.

(16)

Азобензол существует в виде циси трансизомеров. При восстановлении азоксибензола получается более стабильный транс-изомер, который при облучении УФ-светом превращается в цис-изомер.

(17)

Несимметричные производные азобензола получаются при конденсации нитрозосоединений и первичных ароматических аминов.

(18)

Восстановление нитрогруппы до аминогруппы сульфидом и гидросульфидом натрия в настоящее время имеет значение только для частичного восстановления одной из двух нитрогрупп, например, в м-динитробензоле или 2,4-динитроанилине.

(19)

Существует еще пару методов восстановление нитроарен до ароматических аминосоединений, которые в свою очередь применялись в моей работе.

Восстановление хлоридом олова (II) позволяет оказать более сильное и специфическое восстанавливающее действие и часто дает лучшие результаты, чем восстановление металлическим оловом.

Хлорид олова (II) восстанавливает нитрои азосоединения до аминов, избирательно восстанавливает нитрогруппы в полинитро-, гетероциклических и галогеннитросоединениях[3]:

(20)

Наиболее отчетливо избирательность восстановления проявляется в трехзамещенных производных бензола с двумя нитрогруппами в положениях 2 и 4 относительно третьего заместителя. Так, в 2,4-динитротолуоле хлорид олова восстанавливает нитрогруппу в положении 2, практически не затрагивая нитрогруппу в положении 4.

(21)

Метод позволяет вести восстановление в гомогенной среде, т.к. хлорид олова растворяется в воде и в этиловом спирте. Благодаря этому восстановление идет быстро, с хорошими выходами и при низких температурах, хотя реакцию можно вести и при температуре кипения. Проведение восстановления хлоридом олова не вызывает особых затруднений и в основном не отличается от методики восстановления оловом. Порядок загрузки реагентов особой роли не играет. [4]

Регенерацию олова лучше всего осуществлять электрохимическим методом. Этот способ позволяет вернуть в цикл практически все олово. В лабораторной практике иногда пользуются осаждением олова в виде нерастворимого сульфида при пропускании сероводорода через реакционную массу.

(22)

В заключение отметим, что существуют методы прямого введения аминогруппы в ароматическое кольцо — реакции электрофильного аминирования, которые протекают при действии на полиалкилбензолы гидроксиламино-о-сульфокислоты, а также неорганических азидов в присутствии хлороводорода и кислот Льюиса[5]

1.2 Селективность процесса восстановления Указанные методы не являются универсальными и могут применяться для ограниченных рядов структур. Кроме того, их широкому применению препятствует ряд таких недостатков, как применение высокотоксичных агентов, наличие больших количеств ядовитых стоков. Весьма перспективным и интересным с теоретической точки зрения по вопросам региоселективности является селективное восстановление одной из нитрогрупп в полинитросоединениях.

Наиболее распространенными до сих пор агентами при восстановлении одной нитрогруппы в динитросоединениях являются сульфиды, гидросульфиды и дисульфиды металлов [6−7]. Они достаточно широко применяются в промышленности несмотря на целый ряд недостатков (большие объемы токсичных серосодержащих стоков при отсутствии эффективных методов их обезвреживания, некоторые ограничения по структурам восстанавливаемых динитросоединений). Существующие методики позволяют при использовании в качестве восстанавливающего агента сульфида натрия или аммония с достаточно высокими выходами получать нитроанилины различной структуры: м-нитроанилин — выход свыше 75%, 2-амино-4-нитрофенол — 73%, 2-амино-4-нитроанизол — до 80%, пикраминовая кислота — 83%.

Образуются преимущественно о-амины без примеси диаминов. Такая высокая селективность процесса обусловлена тем, что скорость восстановления первой нитрогруппы (в случае м-динитробензола) при использовании сульфидов и гидросульфидов натрия на три порядка выше скорости восстановления второй (r-константа реакции восстановления дисульфидом натрия высока и составляет 3,55).

Достаточно традиционным методом моновосстановления динитропродуктов является реакция с гидразином. В работе при взаимодействии 2,4-динитротолуола с гидразин-гидратом в отсутствии катализатора автору удалось синтезировать 2-амино-4-нитротолуол.

Использование порошка меди в качестве катализатора позволило получить м-нитроанилин с выходом 36,5%, 2-амино-4-нитрофенол — 76,8%, 2-амино-4-нитротолуол — 36,1%, пикраминовую кислоту — 74,8%. Использование в последнем случае железного катализатора повысило выход пикраминовой кислоты до 88,7%. На никелевом катализаторе из 3,5-динитробензойной кислоты с выходом 71% была получена 3-амино-5-нитробензойная кислота.

Применение авторами работы в качестве катализатора восстановления динитроароматических соединений гидразин-гидратом хлорного железа адсорбированного на носителе, привело к образованию м-нитроанилина с выходом 97,4%, 2-амино-4-нитроанизола — с выходом 66%, 2-амино-4-нитрофенола — 89%. Достаточно высокие выхода моновосстановленных продуктах получены и авторами работ [13,14] при использовании разнообразных катализаторов. В последней описано восстановление двух десятков динитроароматических соединений и получен выход м-нитроанилина более 90%.

Ограничением применимости моновосстановления гидразин-гидратом, как и в случае сульфидов, является наличие галогена в бензойном ядре. В ряде случаев происходит замещение последнего на гидразогруппу. Подобные реагенты использованы автором работы также для восстановления одной из двух нитрогрупп, находящихся в различных кольцах бифенила. Наиболее высокий выход — 79% - был получен для гидросульфида натрия.

В справочнике описаны методики разработанные химиками с 20-х годов до средины прошлого века. Тщательная дозировка водорода и применение палладия на угле и платиновой черни позволило авторам некоторых работ получить м-нитроанилин из м-динитробензола. При этом, моновосстановление 2,4-динитротолуола проходило менее гладко. Восстановление 2,4-динитрофенола на никеле позволило получить смесь 2-амино-4-нитрофенола и диаминофенола. Использование в качестве катализатора окиси платины дало образование в заметных количествах 2-амино-6-нитроанизола.

Гетерогенные катализаторы использовали также и для селективного гидрирования несимметричных ароматических динитросоединений, однако удовлетворительные результаты получены лишь в небольшом числе случаев. Так, медь Ренея использовали для восстановления 1-алкил-2,4-динитробензолов в 4-амино-2-нитроаналоги. Авторы отмечали, что селективность возрастает с увеличением стерических затруднений в алкильном заместителе. В работе при гидрировании 2,4-динитротолуола в присутствии палладиевого катализатора отмечется образование двух изомерных нитроанилинов, что свидетельствует об альтернативности процесса моновосстановления.

В патенте описано восстановление о-динитробензола до соответствующего нитроанилина с выходом до 86%. В качестве катализаторов используются комплексные соединения кобальта. Особенностью подхода является дозированная подача водорода, что очевидно и обуславливает восстановление только одной группы. В работах [17−18] авторы исследуют восстановление м-динитробензола. При использовании различных катализаторов м-нитроанилин образуется с различными выходами: Se и Pd/C — 87%, платиновая чернь — 80%, палладиевая чернь — 75%, скелетный Ni — 60%.

Селективность восстановления авторы работ объясняют различной адсорбционной способностью м-динитробензола и м-нитроанилина.

Таким образом, хотя результаты по селективному восстановлению динитросоединений методом каталитического гидрирования весьма ограничены, разрозненны и относятся в основном к незамещенным динитробензолам, это направление развивается весьма активно, т.к. сулит высокую эффективность процессов получения целевых нитроанилинов и выход на их крупнотоннажное производство.

Используют при восстановлении одной из двух нитрогрупп в качестве восстанавливающих агентов металлы и соли переходных металлов. Так, авторы работ [19−21] применяют в реакции с динитроароматическими соединениями железо в кислой среде. В патенте предложен способ моновосстановления динитробензолов железом в водном растворе сернистого газа. При этом удается получить м-нитроанилин с выходом 72,6%, 2-амино-4-нитротолуол — 72,5%, 2-амино-4-нитрофенол — 60%, пикраминовую кислоту — почти 100%.

Применение различных кислот и добавок солей (например, NaCl) позволяет довести выход м-нитроанилина до почти количественного [20−21]. Следует однако отметить, что моновосстановление с использованием железа связано с большим количеством отходов и поэтому малоэкономично.

Одним из старейших и традиционных методов моновосстановления динитропродуктов является использование в реакции хлорида олова (II). В работе 1887 года авторам удалось при взаимодействии 2,4-динитрохлорбензола с SnCl₂ получить 2-хлор-5-нитроанилин. Позднее [23], для моновосстановления 2,4-динитрофторбензола и 2,4-динитробромбензола отмечено образование двух изомерных нитроанилинов. Следует отметить, что справочник Houben-Weyl представляет достаточно широкий набор методик восстановления динитроароматических продуктов хлоридом олова (II), разработанных для различных субстратов до 50-х годов нашего века. Для несимметричных структур наблюдается в основном восстановление о-нитрогруппы.

Используется хлорид олова (II) для восстановления одной нитрогруппы в несимметричных замещенных динитробензолах и современными исследователями.

Так, взаимодействие 2,4-динитрохлорбензола с двухлористым оловом позволяет получить 2-хлор-5-нитроанилин с выходом 60%.

Другим мягким, пригодным для моновосстановления динитропродуктов восстанавливающим агентом является хлорид титана (III). Его применение для этой цели предложено и развито в совместных работах сотрудников ИОХ РАН и ЯрГУ [25−28]. Авторами отмечено образование двух изомерных нитроанилинов при моновосстановлении 1-замещенных-2,4-динитробензолов. Для 2,4-динитрохлорбензола отработана методика восстановления одной из двух нитрогрупп в водно-спиртовых средах с практически количественными выходами и разработан эффективный метод разделения образующихся изомеров. В работах [29,30] было показано, что восстановление солями титана (III) ароматических монои полинитросоединений, в том числе 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ), ускоряется в присутствии ионов двухвалентного железа и двухвалентной меди, например, в присутствии FeSO₄ в концентрации 0,01 и 0,3 моль/л в 2 и 8 раз соответственно. Концентрация солей титана (III) при этом составляла 1 моль/л.

Введение

в реакционную среду солей никеля, хрома, ванадия и щелочноземельных элементов не оказывает заметного влияния на скорость восстановления ТНТ ионами титана (III). Таким образом, влияние ионов железа (II) и меди (II) на данный процесс является специфическим.

Если исходить из допущения, что каталитический эффект ионов железа (II) и меди (II) на восстановление ПНС обусловлен образованием комплексов этих ионов с исходным соединением или его анион-радикалами (АР), генерируемыми после переноса электрона на субстрат, то можно ожидать и изменения региоселективности процесса в присутствии этих ионов.

Такое предположение основано на данных работ [31−33], в которых показано, что региоселективность восстановления ПНС обусловлена распределением заряда и спиновой плотности неспаренного электрона в АР. Это распределение определяет преимущественное направление протонирования и, как следствие, образование того или иного изомера при частичном восстановлении. Аналогичный подход использовался при исследовании региоселективности восстановления ароматических ПНС квантово-химическим методом. Образование комплекса АР с ионами металлов может значительно изменить распределение электронной плотности и направление реакции протонирования АР. Для проверки такого предположения были проведены эксперименты по частичному восстановлению ТНТ ионами титана (III) в присутствии ионов железа (II) и меди (II).

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что небольшие добавки солей железа (II) или меди (II) изменяют региоселективность моновосстановления 2,4,6- тринитротолуола хлоридом титана (III) (в сторону преимущественного образования более труднодоступного 2-амино-4,6-динитротолуола по отношению к 4-амино-2,6-динитротолуолу от 25%, когда восстановление проводится в отсутствие солей железа и меди, до 70% в присутствии этих солей).

Рассмотрен возможный механизм процесса. Достаточно несложный метод регенерации восстанавливающего агента — электролиз (Ti⁴+ + e—-> Ti³+) — позволил разработать малоотходный полупромышленный процесс получения нитроанилинов. Однако, препятствием для развития использования хлорида титана (III) для моновосстановления динитропродуктов стала недостаточная информация о закономерностях этого перспективного процесса.

Весьма распространенным методом моновосстановления динитропродуктов является электровосстановление, проводимое зачастую в присутствии солей переходных металлов. Следует отметить, что электрохимический способ восстановления конкурентоспособен (по сравнению с другими) при небольших объемах производства и весьма экологичен. Его применение для целей моновосстановления динитроароматических соединений известно с начала века. В монографии имеются ссылки на работы 1905, 1907, 1908 г. г., в которых электровосстановлением в присутствии Cu₂Cl₂ и соединений ванадия получены м-нитроанилин, 2-амино-6-нитротолуол, 4-амино-2-нитроанизол. Авторы исследования провели электровосстановление 2,4-динитрохлорбензола и 2,4-динитроанизола в кислой среде в присутствии CuCl₂. Был получен 4-нитро-2-аминоанизол и смесь изомерных нитрохлоранилинов (соотношение 2-хлор-5-нитроанилин/3-нитро-4-хлоранилин = 4).

Современное состояние вопроса электрохимического восстановления динитропроизводных бензола подробно представлено в диссертационной работе (литературный обзор) и, частично, (катализаторы-переносчики в электровосстановлении нитроароматических соединений). Автор подробно исследовал влияние различных факторов (материал электродов, плотности тока, степени конверсии, катализаторов-переносчиков, природы растворителя и др.) на моновосстановление м-динитробензола, 2,4-динитрофенола и 2,4-динитроанизола. Выходы мононитропродуктов составили: для м-динитробензола — до 50%; 2,4-динитрофенола (2-амино-4-нитрофенол) — до 90%; 2,4-динитроанизола (смесь изомерных нитроанилинов) — до 80%, что является весьма высокими показателями. Однако, как отмечалось выше, электровосстановление в чистом виде рентабельно лишь для малотоннажных производств.

Особо следует отметить, как подход последнего времени, применение биохимического моновосстановления.

В работе было рассмотрено восстановление замещенных динитроароматических соединений Х-1,3-(NO₂)₂C₆H₃ действием хлебопекарных дрожжей (вода, 32? С, 1 ч.; ДМСО или горячий спирт, 32? С). В результате получают, в некоторых случаях с высокой селективностью, 2-Х-5-NO₂C₆H₃NH₂, где Х=Ме, Еt, MeO, EtO, MeS, MeS (O) и 2-X-6-NH₂C₆H₃NO₂, соотношение от 1:1 до 5:1, выходы 7−30 и 6−27% соответственно. Было предположено, что стерический фактор влияет на предпочтительное восстановление п-NO₂, электронный фактор (т.е. присутствие неподеленной пары электронов) — на восстановление о-NO₂. Однако применение данного способа еще не нашло широкого применения и дальнейшее совершенствование метода возможно только на базе изучения закономерностей этого процесса, в том числе факторов, влияющих на его региоселективность.

Таким образом, на основании выше изложенного можно сделать вывод, что селективное восстановление одной из нескольких нитрогрупп в производных бензола является одним из наиболее эффективных методов получения нитроанилинов. Весьма перспективные результаты получены при использовании в качестве восстанавливающего агента хлорида титана (III) (высокие выхода продуктов, малоотходность, возможность регенерации восстанавливающего агента).

Препятствием для развития использования данного восстанавливающего агента при моновосстановления динитропродуктов стала недостаточная информация о закономерностях этого перспективного процесса. Поэтому необходимо дальнейшее изучение процесса восстановления одной из двух нитрогрупп в несимметричных динитробензолах и факторов, влияющих на его региоселективность.

1.3 Критерии токсичности В соответствии с п. III «Критериев отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды», утверждённых приказом МПР России от 15.06.2001 № 511 «Об утверждении Критериев отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды» (не нуждается в государственной регистрации согласно заключению Минюста России от 24.07.2001 № 07/7483-ЮД), отнесение опасных отходов к классу опасности для ОПС возможно экспериментальным методом. Экспериментальный метод основан на биотестировании водной вытяжки отходов.

Для определения класса опасности синтезированных азокрасителей методом биотестирования был проведен эксперимент по установлению острого токсического действия по описанной методике в п. В качестве тест-объекта использовали вид Ceriodaphnia affinis (время экспозиции 48 часов). 52]

В связи с быстрыми темпами развития химической промышленности — одной из ведущих отраслей индустрии — растет и уровень загрязнения водных источников органическими веществами. В состав органических отходов входят алифатические, нафтеновые и особенно ароматические углеводороды, оказывающее токсическое и в некоторой степени наркотическое воздействие на организм. Такие вещества изменяют санитарный режим водоемов, ухудшают органолептические свойства воды, снижают газообмен с атмосферой, вызывают заболевания и гибель гидробионтов. [39,40]

Исходя из выше сказанного, одной из главных задач токсикологических исследований является изучение воздействия химических веществ на организмы и экосистемы, а также изучение устойчивости и функционирования биосистем надорганизменного уровня в условиях их токсического загрязнения. 41]

Получение данных о зависимости доза — ответ для данного вещества поможет извлечь информацию о степени опасности вещества для человека и окружающей среды, связанной с его возможным воздействием при конкретном использовании. [42]

1.3.1 Понятие токсичности Токсичность (от греч. toxikon — яд) — способность вещества вызывать нарушения физиологических функций организма, в результате чего возникают симптомы интоксикаций (заболевания), а при тяжелых поражениях — его гибель.

Токсичность химических веществ обусловлена взаимодействием организма, токсического вещества и окружающей внешней среды.

Токсичность ядовитых веществ зависит от таких факторов: дозы или концентрации, физических и химических свойств, путей и скорости проникновения ядов в организм, возраста и пола, индивидуальной предрасположенности к яду и т. д.

Степень токсичности вещества характеризуется величиной токсической дозы — количеством вещества (отнесенным, как правило, к единице массы животного или человека), вызывающим определенный токсический эффект. Чем меньше доза, тем выше токсичность.

Различают среднесмертельные дозы (ЛД₅₀ или LD₅₀), абсолютно смертельные (ЛД₉₀₋₁₀₀, LD₉₀₋₁₀₀), минимально смертельные (ЛД₀₋₁₀, LD₀₋₁₀), среднеэффективные (ED50) -вызывающие определенные токсич. эффекты, пороговые (ПД50, РD50) и др. (цифры в индексевероятность в % появления определенного токсич. эффекта-смерти, порогового действия и др.). [43]

В настоящее время в России для отходов в соответствии с приказом Министерства природных ресурсов РФ от 15.06.2001 года № 511 установлено 5 классов опасности.

Таблица 1. Классификация химических веществ по степени воздействия на человека

Величина токсической дозы зависит от способа введения вещества или от путей его поступления в организм, от вида животного, возрастных, половых и индивидуальных различий, а так же от конкретных условий воздействия. При ее определении экспериментально исследуют зависимость «эффект — доза», которую затем анализируют с помощью статистических методов. [43]

1.3.2 Методы определения токсичности веществ Многообразные загрязняющие вещества (ЗВ), попадая в окружающую среду (ОС), могут претерпевать в ней различные изменения, усиливая при этом свое токсическое действие. Это приводит к необходимости разработки комплексных, интегральных методов контроля качества ряда объектов окружающей природной среды (ОПС), в том числе воды, почвы и воздуха, позволяющих оценить их качество и возможную опасность различных источников загрязнения.

Традиционная эколого-гигиеническая оценка химического загрязнения водных объектов (поверхностных и подземных водоисточников, питьевой воды, сточных вод и др.), основанная на санитарно-химических анализах, нашедшая широкое применение в практике надзорных служб и при производственном контроле, полностью себя оправдывающая, тем не менее, не даёт полного представления о биологической опасности воды того или иного водного объекта. Это связано с тем, что в силу технических и финансовых причин в воде контролируется и определяется только часть вероятных тех или иных загрязнителей. Многие химические вещества, присутствующие в водных объектах, особенно в местах размещения химических, металлургических, машиностроительных и др. предприятий, остаются не идентифицированными. В то же время поверхностные и подземные воды могут загрязняться вредными веществами вследствие миграции их из атмосферного воздуха, талых вод, почвы, производственных отходов, а также при сбросе сточных вод.

В связи с этим представляется необходимым иметь данные о возможном неблагоприятном токсическом действии как обнаруженных, так и неидентифицированных вредных веществ, присутствующих в водных объектах. С этой целью распространяется практика биотестирования воды на тест-объектах для характеристики и оценки её токсического эффекта. Наиболее эффективными инструментами аналитического контроля при этом являются методы биотестирования и биоиндикации.

Биоиндикация (bioindication) — обнаружение и определение экологически значимых природных и антропогенных нагрузок на основе реакций на них живых организмов непосредственно в среде их обитания. Биологические индикаторы обладают признаками, свойственными системе или процессу, на основании которых производится качественная или количественная оценка тенденций изменений, определение или оценочная классификация состояния экологических систем, процессов и явлений.

В настоящее время можно считать общепринятым, что основным индикатором устойчивого развития в конечном итоге является качество среды обитания.

Биотестирование (bioassay) — процедура установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов. Для оценки параметров среды используются стандартизованные реакции живых организмов (отдельных органов, тканей, клеток или молекул).

В организме, пребывающем контрольное время в условиях загрязнения, происходят изменения физиологических, биохимических, генетических, морфологических или иммунных систем. Объект извлекается из среды обитания, и в лабораторных условиях проводится необходимый анализ.

Живой организм может тестироваться также в специальных камерах или на стендах, где создаются условия изучаемого загрязнения (что очень важно для выявления реакций организма на то или иное доминирующее загрязнение или целый комплекс известных загрязняющих веществ на данной территории обитания).

1.3.3 Биотестовый метод определения токсичности веществ С помощью метода биотестирования определяют предельно допустимые концентрации (ПДК) новых химических соединений, проводят биохимический и генотоксический мониторинг водных экосистем. Известны способы определения микроколичеств фосфороорганических пестицидов в воде биотестированием относительно дафний. Биотестирование относительно рыб широко применяют для определения следовых и ультраследовых количеств пестицидов и их метаболитов в водных экосистемах.

Биотестирование является дополнительным экспериментальным приемом для проверки необходимости корректировки величин предельно допустимого сброса (ПДС) по показателю «токсичность воды». Это позволяет учесть ряд существенных факторов: наличие в сточной воде токсических веществ, не учитываемых при установлении ПДС, вновь образовавшихся соединений — метаболитов, различные виды взаимодействий химических веществ — синергизм, антагонизм, аддитивность и т. д. Необходимость корректировки величин ПДС возникает в том случае, если при биотестировании воды из контрольного створа водного объекта установлено несоответствие её качества требуемому нормативу: вода в контрольном створе водного объекта не должна оказывать хронического токсического действия на тест-объекты.

Результаты биотестирования устанавливают интегральную токсичность, обусловленную совокупностью всех присутствующих в пробе опасных химических веществ и их метаболитов. Конечной целью биотестов является оценка безопасности или иных свойств исследуемого объекта на организмах-моделях и на основании полученных результатов прогнозирование реакции организма человека и/или животных.

Самым сложным при таком подходе к оценке безопасности является получение прогноза с достаточным уровнем достоверности, так как любые модели, в том числе и биологические, имеют разную степень приближения к организму, который моделируют. Часто о качестве биологической модели (насколько она близка к моделируемому организму) можно судить только после накопления большого количества результатов исследований и последующего статистического анализа.

В соответствии с п. III «Критериев отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды», утверждённых приказом МПР России от 15.06.2001 № 511 «Об утверждении Критериев отнесения опасных отходов к классу опасности для окружающей природной среды» (не нуждается в государственной регистрации согласно заключению Минюста России от 24.07.2001 № 07/7483-ЮД) отнесение опасных отходов к классу опасности для ОПС возможно экспериментальным методом.

Экспериментальный метод основан на биотестировании водной вытяжки отходов. В случае присутствия в составе отхода органических или биогенных веществ, проводится тест на устойчивость к биодеградации для решения вопроса о возможности отнесения отхода к классу меньшей опасности. Устойчивостью отхода к биодеградации является способность отхода или отдельных его компонентов подвергаться разложению под воздействием микроорганизмов. При определении класса опасности отхода для ОПС с помощью метода биотестирования водной вытяжки применяется не менее двух тест-объектов из разных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли и т. п.). Таким образом, для биотестирования отходов используются различные гидробионты — водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные и рыбы. Наиболее популярные объекты — ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтров Daphnia magna и Ceriodaphnia affinis. За окончательный результат принимается класс опасности, выявленный на тест-объекте, проявившем более высокую чувствительность к анализируемому отходу.

Для подтверждения отнесения отходов к V классу опасности для ОПС, установленного расчётным методом, определяется воздействие только одной вытяжки отхода без её разведения.

Класс опасности устанавливается по кратности разведения водной вытяжки, при которой не выявлено воздействие на гидробионтов в соответствии со следующими диапазонами кратности разведения, приведенными в табл. 2.

Таблица 2. Определение класса опасности.

Экспериментальный метод используется в следующих случаях:

— для подтверждения отнесения отходов к V классу опасности, установленного расчётным методом;

— при отнесении к классу опасности отходов, у которых невозможно определить их качественный и количественный состав;

— при уточнении по желанию и за счёт заинтересованной стороны класса опасности отходов, полученного в соответствии с расчётным методом.

В соответствии с требованиями нормативных документов МПР (поскольку в 2001 г. МПР России являлось специально уполномоченным органом в сфере экологически безопасного обращения с отходами) исследования качества природных сред должны проводиться на базе аттестованных лабораторий, обладающих необходимым набором поверенных приборов, реактивов и квалифицированным персоналом. Поэтому если класс опасности отходов установлен экспериментальным путём, то в состав материалов, обосновывающих отнесение отхода к классу опасности для окружающей среды (которые направляются в Управление по технологическому и экологическому надзору для рассмотрения и принятия решения о регистрации отхода в Федеральном классификационном каталоге отходов с соответствующим данному виду отходов кодом), должны входить протоколы биотестирования в лаборатории, аккредитованной на биотестирование водных вытяжек отходов, а также копия аттестата аккредитации такой лаборатории с приложением, в котором указана соответствующая область аккредитации.

1.3.3.1 Тест-объекты, используемые для биотестирования Основная задача любого токсикологического опыта — определение максимальной недействующей (или безвредной, пороговой, неэффективной) концентрации веществ, при которой не обнаруживается изменений в организмах. При проведении опытов с различными тест-объектами (рыбами, беспозвоночными и т. д.) устанавливают безвредную концентрацию вещества для наиболее чувствительного организма, которая служит отправной точкой для определения допустимой концентрации этого вещества.

Тест-организмы — это высокочувствительные организмы, широко представленные в определенных географических зонах, доступные для сбора, удобные для содержания и культивирования в лаборатории и хорошо изученные.

Например, для биотестирования водных объектов используют различных гидробионтов — водорослей, микроорганизмов, беспозвоночных, рыб. Наиболее популярные объекты — ювенильные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Важное условие правильного проведения биотестирования — использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность к токсическим веществам.

В биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды используют критерий токсичности (toxicity criterion) — тест-функцию. Тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:

— для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых — выживаемость (смертность) тест-организмов;

— для ракообразных, рыб, моллюсков — плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток;

— для культур одноклеточных водорослей и инфузорий — гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры;

— для растений — энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.

Начальное, оценочное тестирование токсичности различных химикатов — это, как правило, острые опыты с высокими концентрациями добавок продолжительностью до 5 суток. Такие опыты необходимы, так как они демонстрируют возможную вредность меньших доз вещества при более длительном воздействии. Следовательно, при определении подпороговой концентрации вещества главное внимание в острых токсикологических опытах должно быть уделено поиску наиболее чувствительных организмов.

Основным методом оценки чувствительности тест-организмов к токсикантам является регистрация их смертности. Основная (классическая) продолжительность теста — 96 часов. Как отмечают А. Н. Тюрин и Н. К. Христофорова (Биология моря, 1995), причина «классической» длительности токсикологических тестов в 96 часов, скорее, социальная, чем фундаментальная, и имеет корни в исторически сложившейся продолжительности рабочей недели ученых разных стран — 5 суток.

В начале XX века основным методом оценки токсичности среды был метод определения выживания рыб — так называемый метод «рыбной пробы». Основоположники метода — российские ученые Гримм, Арнольд, Чермак, Долгов, Никитинский. Метод получил широкое распространение и за рубежом; благодаря простоте и удобству его применяют до сих пор. Недостаток метода заключается в необходимости длительного периода адаптации рыб к лабораторному содержанию (15−20 сут.), которое само по себе является стрессом. Дальнейшее развитие метод «рыбной пробы» получил в США после разработки систем для бесконтактной регистрации двигательной активности и некоторых поведенческих реакций рыб, по изменению которых определяли наличие токсикантов в среде[53].

По чувствительности и степени изученности среди тест-организмов, используемых для биотестирования водных объектов, выделяют дафний (Daphnia magna, Daphnia рulex), несколько видов микроскопических одноклеточных зелёных водорослей из класса протококковых (сценедесмус Scenedesmus quadricauda, хлорелла Chlorella sp.) и пять-шесть видов рыб как аквариумных (гуппи, данио-рерио), так и мелких аборигенных (голец, гольян). Кроме того, для биотестового анализа можно использовать инфузорию туфельку — Paramecium caudatum. Каждый из этих объектов имеет свои преимущества и ограничения при использовании, и ни один из организмов не может служить универсальным «тестером», одинаково чувствительным ко всем ЗВ. Однако опыт токсикологического нормирования показывает, что при использовании этих видов методом биотестирования может быть охвачено более 80% подлежащих контролю загрязняющих воду веществ.

1.3.4 Химическое строение и действие токсических веществ При оценке токсичности промышленных ядов особый интерес представляют сведения о характере биологического действия в связи с изменением химической структуры. Однако закономерности этой зависимости для ряда веществ еще не установлены. Показано, что токсичность химических веществ обусловлена наличием в их молекулах определенных функциональных групп или двойных связей.

Многие ненасыщенные соединения являются более токсичными, чем близкие к ним по составу насыщенные вещества. Так, аллиловый спирт (СН₂=СН—СН₂ОН), принадлежащий к ненасыщенным соединениям, более токсичен, чем близкий к нему по составу насыщенный пропиловый спирт (СН₃—СН₂—СН₂ОН).

Токсичными являются вещества, в молекулах которых содержатся следующие группы атомов: =С=О, S=, =С=С, —N=C, —NO ₂ и др.

Токсичность некоторых органических веществ обусловлена введением в их молекулы атомов хлора, мышьяка, ртути др. Определенные группы атомов (—С=С—, —С ₆ Н ₅, —СН ₂ —, —NH ₂ и др.), содержащиеся в молекулах токсических веществ, усиливают их токсичность.

Токсичность химических соединений зависит от их положения в соответствующих гомологических рядах. С увеличением молекулярной массы токсичность гомологов возрастает. Например: пропионовая кислота более токсична, чем уксусная, а маслянная кислота более токсична, чем пропионовая.

Алифатические спирты имеют более выраженное токсическое действие, чем их изомеры с разветвленной цепью атомов. Подтверждением этому является более высокая токсичность пропи-лового и бутилового спиртов, чем их изомеров (изопропилового, изобутилового спиртов).