Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учреждение образования

«Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет Кафедра фтизиопульмонологии Молекулярно-генетические методы исследования и дифференциальная диагностика туберкулеза Дипломная работа Исполнитель:

студент группы Д-603 Гореньков Р.Ю.

Руководители:

К.м.н., Заведующий кафедры фтизиопульмонологии Буйневич И.В.

Зав. клинико-диагностической лаборатории УЗ «Гомельская областная туберкулезная клиническая больница» Золотухина Л.В.

ГОМЕЛЬ, 2013 г Реферат Дипломная работа содержит 31 страницу, 5 рисунков, 4 таблицы, 15 источников.

Ключевые слова: Микобактерии туберкулеза, ПЦР диагностика, Дифференциальная диагностика туберкулеза, лекарственная чувствительность, DNA-Strip метод.

Объект исследования:

46 проб для ПЦР исследования культур взятых с плотных и жидких (BACTEС MGIT 960) питательных сред.

30 проб для определения лекарственной чувствительности одних и тех же пациентов по данным ПЦР и BACTEC MGIT 960

Цель работы: изучить информативность DNA-Strip метода в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Область применения: микробиологическая лабораторная диагностика, фтизиатрия, организация здравоохранения.

Перечень сокращений

Глава 1. Основы проведения метода ПЦР

1.1 основной принцип ПЦР

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР

1.3 Разновидность ПЦР

1.4 ПЦР диагностика туберкулеза легких

1.5 ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза

1.6 Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Предварительная обработка мокроты

2.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

2.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видомикобактерий из культурального материала

2.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам

Глава 3. Результаты собственных исследований

3.1 Обнаружение и видовая идентификация МБТ

3.2 Продолжительность молекулярно-генетического метода исследования

3.3 Определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам Заключение

Перечень сокращений молекулярный генетический туберкулез диагностика ПЦР — полимеразно-цепная реакция МБТ — микобактерии туберкулеза

dNTP — дезоксинуклеозидтрифосфатов

PBS-буфер — натрий-фосфатный буфер

ПТП — противотуберкулезные препараты ППС — плотные питательные среды ЛУ — лекарственная устойчивость Введение ДНК-диагностика — это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них — метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) .

На сегодняшний день ПЦР — анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов и пациентов.

Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэри Мюллисом в 1983 г. Открытие ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние 20 лет, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.

Особое место метод ПЦР нашел в диагностике туберкулеза. Традиционные микробиологические методы выявления возбудителя не всегда позволяют подтвердить диагноз туберкулез. Метод люминесцентной бактериоскопии и посева на питательные среды обладают низкой чувствительностью и обнаруживают М. tuberculosis в среднем лишь у 50−60% больных активным туберкулезом легких. В связи с этим внедрение в практику новых молекулярно-генетических методов исследования способствует проведению диагностики туберкулеза в максимально короткие сроки и с наибольшей чувствительностью.

Цель работы: изучить информативность DNA-Strip метода в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Задачи:

Изучить возможность метода ПЦР в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза.

Оценить возможности DNA-Strip метода в в диагностике и дифференциальной диагностикетуберкулеза.

Сравнить возможности ПЦР и Bactec MGIT960 при видовой идентификации туберкулеза и их лекарственной чувствительности к ПТП.

Глава 1. Основы проведения метода ПЦР.

1.1 Основной принцип ПЦР Любой метод ДНК-диагностики основан на специфической гибридизации двух нитей ДНК, комплементарных (структурно дополняющих) одна другой. Примерной (хотя и весьма приблизительной) аналогией может служить серологическая реакция, основанная на специфической реакции белка-антитела с соответствующим антигеном. Специфичность связывания нитей в спирали ДНК основана на связях А-Т и Г-Ц. Праймеры комплементарны искомым участкам ДНК, и поэтому они способны связываться с конкретными участками гена. Достройка нитей ДНК, начиная с добавленных праймеров, требует наличия в реакционной смеси пурин-и пиримидинтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ), а также присутствия ДНК-полимеразы, которая соединяет их в цепочку согласно последовательности второй нити ДНК.

1.2 Осуществление рутинных методик ПЦР Исследуемым материалом для ПЦР могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, околоплодная, суставная жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, сок простаты, слюна, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты.

Забор материала производится в условиях процедурного кабинета соответствующего профиля. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР-диагностическую лабораторию.

Забор образцов необходимо производить при помощи стерильного, желательно одноразового, инструментария только в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150 °C в течение 1 часа[4].

1. Выделение ДНК из клинического образца производится любым способом. Основное требование — достаточно стандартный выход продукта и интактность, сохранение двухнитевой структуры.

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее — природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов[5].

2. Амплификация. Полимеразная цепная реакция ДНК проводится в специальном приборе (термоциклере (рис 1.) или амплификаторе), который, согласно введенной программе, изменяет температуру в рабочих ячейках, держит ее в течение заданного времени и переходит к следующему этапу.

Рисунок 1 — Термоциклер Каждый цикл ПЦР обычно состоит из трех температурных режимов.

а) Нагрев до 95 °C в течение 30−40 сек. При этом выделенные молекулы ДНК подвергаются денатурации, т. е. происходит разделение ДНК на две нити.

б) Охлаждение до оптимальной температуры (обычно 48−66 °С). При этом разделенные нити ДНК могут обратно воссоединиться по комплементарным участкам. Однако, при наличии в образце целевых участков ДНК, синтетические ДНК-зонды (праймеры, длиной 15−30 п.н.) специфически связываются (гибридизуются) с комплементарными участками ДНК, например хламидии или герпесвируса. Тем самым ограничиваются искомые участки генов, определяя точки начала и окончания предполагаемого продукта ПЦР. Время отжига 20−60 сек.

в) После завершения гибридизации праймеров с искомыми участками ДНК, температуру смеси повышают до 72 °C. Эта температура оптимальна для фермента Таq ДНК-полимеразы, которая начинает быстро достраивать одну и другую цепочку ПЦР-продукта, начиная с места фиксации, соответственно, одного и второго ДНК-зонда. Этот процесс называется элонгацией (т. е. удлинением) ПЦР-продукта, сами же продукты ПЦР именуют ампликонами. Время протекания синтеза — 20−40 сек.

При первом цикле ПЦР получается некоторое число ампликонов различной длины, которые служат субстратом во втором цикле реакции, где количество специфических продуктов удваивается еще раз. В каждом из последующих циклов (всего до 35−40) происходит двукратное возрастание числа целевых продуктов ПЦР-ампликонов.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения.

3. Детекция.

Способы учета результатов ПЦР:

Качественная оценка (электрофоретический метод) Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ «да» или «нет», как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным — в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.

Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.

В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На медицинских рынках предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа. 6]

Количественная оценка результатов ПЦР В ряде клинических ситуаций возникает вопрос о динамике патологического процесса и/или эффективности проводимой терапии. Эти вопросы наиболее актуальны при обследовании пациентов с хроническими инфекциями (гепатиты В и С, МБТ, вирус иммунодефицита человека и др.). При диагностике исходят из того, что накопление продуктов ПЦР (ампликонов) пропорционально содержанию копий искомого гена в исследуемой пробе.

Естественно, учет результатов количественной ПЦР можно проводить и с помощью гель-электрофореза с анализом интенсивности специфических сигналов ПЦР. Обязательным условием правильной количественной оценки результатов ПЦР являются надежные положительные контрольные пробы с известным содержанием копий искомого гена (например, 1000 копий гена МБТ на одну ПЦР-реакцию). Ряд последовательных разведений количественного контроля дает возможность построить калибровочные кривые, по которым можно оценивать содержание генокопий в клинических образцах .

Ключевым достижением в проведении количественной ПЦР стала разработка флуоресцентных ДНК-зондов, которые добавляются в реакционную смесь наряду с «обычными» праимерами и дают возможность отслеживания хода ПЦР во времени (так называемая real-timе-ПЦР), которая в 1993;1994 гг. была внедрена в соответствующих приборах и диагностических системах (принцип ТаqМаn). Существует еще несколько методов конструирования ДНК-зондов для количественной ПЦР.

Методология ТаqМаn предусматривает синтез флуоресцентных ДНК-зондов, специфичных к средней части ампликона (между праймерами) и имеющих на концах две метки. Одна из них — флуоресцентная молекула, другая — молекула-гаситель этой флуоресценции. Таq-полимераза в ходе ПЦР не только достраивает нуклеотидную цепочку, но и разрушает связанный флуоресцентный зонд. При этом флуоресцирующая метка выходит в свободное состояние, освобождаясь от влияния гасителя. Поэтому интенсивность флуоресценции по мере амплификации продуктов ПЦР возрастает пропорционально числу ампликонов и, соответственно, числу копий исходной ДНК. Специальный прибор, являющийся гибридом термоблока-амплификатора и флуориметра, осуществляет регулярные замеры флуоресценции в каждой пробирке (принцип real-time-ПЦР). В результате после 20−40 циклов ПЦР для каждого образца получают индивидуальные кривые. По калибровочным кривым с контрольными образцами возможно вычислить, сколько копий искомого гена содержится в изучаемом образце.

Важная особенность проведения ПЦР флуоресцентным методом состоит в том, что пробирки с ПЦР-смесью не нужно открывать при учете результатов. Благодаря этому уменьшается вероятность загрязнения помещений продуктами амплификации и отпадает необходимость в выделении специальных рабочих зон для проведения электрофореза. 7]

1.3 Разновидности ПЦР Вложенная ПЦР (Nested PCR (англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

Инвертированная ПЦР (Inverse PCR (англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНКрестриктазами последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

ПЦР с обратной транскрипцией Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную к ДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является (англ). Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой концентрацией подбирается с высокой (температурой плавления), чем праймер с высокой концентрацией. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов.

Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (но лучше использовать SYTO 13), который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный).

Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72−75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60−65°С.

Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony — PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.

RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

Групп-специфическая ПЦР (англ. group-specific PCR) — ПЦР для родственных последовательностях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последовательностям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является — уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.

ПЦР с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие антитела небольшими молекулами типа Affibody, то есть в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 °C в течение 10 минут.

Виртуальная ПЦР (англ. in silico PCR, цифровая ПЦР, электронная ПЦР, е-ПЦР) — математический метод компьютерного анализа теоретической полимеразной цепной реакции c использованием списка последовательностей праймеров (или ДНК-зондов) для предсказания потенциальной амплификации ДНК исследуемого генома, хромосомы, кольцевой ДНКили любого другого участка ДНК.

DNA-STRIP технология — на ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой)[8].

Методология Тест GenoType Mycobacterium AS (Additional Species) основан на технологии DNA*STRIP® и обеспечивает идентификацию следующих видов бактерий: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense,

M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, и M. shimoidei.

Процедура проведения теста подразделяется на три этапа: Выделение ДНК из культур (выросших на плотной или жидкой среде; необходимые для этого реагенты в наборе не поставляются), мультиплексная амплификация с биотинилированными праймерами (необходимая термостабильная ДНК полимераза не поставляется), реверс-гибридизация. Гибридизация включает следующие этапы: химическая денатурация продуктов амплификации, гибридизация одноцепочечных ампликонов, меченых биотином, на мембраносвязанных зондах, тщательная отмывка, добавление конъюгата стрептовидина/щелочной фосфатазы (АР) и опосредованная щелочной фосфатазой, реакция окрашивания. Простая и быстрая оценка полученных результатов проводится с помощью прилагаемого шаблона.

Оценка и интерпретация результатов Подклеиваются стрипы и храняися в защищенном от света месте. Эталон для оценки поставляется в наборе. При использовании этого эталона оценки, наклеивается окрашенные стрипы в предназначенные для этого поля, причем полоски СС и UC должны совпадать с соответствующими линиями на эталоне. Отмечаются положительные сигналы в предпоследней колонке, определяется вид при помощи таблицы интерпретации и записывается название вида в последней колонке. Поставляемый шаблон так же предназначен для оценки результатов и должен совпадать с полосками стрипов СС и UС. На каждом стрипе всего 17 зон реакции (Рис 2.)

Рисунок 2 — Стрип Контроль коньюгата (CC)

Линия в этой зоне должна быть хорошо проявлена, подтверждая эффективность связывания коньюгата и правильность субстратной реакции Универсальный Контроль (UC)

Эта зона улавливает все известные микобактерии и представителей группы грам-положительных бактерий с высоким содержание G+C. Если эта зона и зона Контроля Конъюгата становятся положительными, но остальные полоски не указывают на специфическую микобактерию, для идентификации соответствующего вида бактерии нужны дополнительные методы.

Учитываются только те полоски, интенсивность которых такая же или выше, чем у зоны Универсального Контроля.

Контроль Рода (GC)

Окрашивание этой зоны документирует присутствие представителя рода Mycobacterium. Интенсивность этой полоски варьирует в зависимости от вида микобактерии. Полоска Контроля Рода может выпасть, несмотря на присутствие микобактериальной ДНК; если специфическая полоска присутствует, реакция амплификации проведена правильно, результат теста действителен.

Другие полоски Специфические пробы для оценки смотрите в таблице интерпретации. Не все полоски на стрипе могут показывать одинаковую силу сигнала. Если нет видоспецифичных полосок, область показывающая присутствие грам-положительных бактерий с высоким содержанием G+C, в редких случаях происходящих от микобактерий, которые нельзя определить на этом наборе и для идентификации соответствующих видов бактерий нужно использовать дополнительные методы. Если добавить слишком большое количество ампликонов, можно получить дополнительные полосы.

1.4 ПЦР диагностика туберкулеза легких Особенности метода Высокая специфичность Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР аналогична росту бактерий на искусственных питательных средах (процессу биологической амплификации), при которой одна микробная клетка, образуя видимую колонию, амплифицируется в 105−106 раз, давая возможность определить свойства бактерии, манипулируя уже с целой колонией. Как и питательные среды, которые могут быть селективными, поддерживающими рост только одного микроорганизма, или обогатительными, дающими возможность размножаться широкому кругу микроорганизмов, так и праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые рода или семейства микроорганизмов[10].

Высокая чувствительность.

Метод ПЦР обладает высокой чувствительностью, дающей возможность обнаружить единичные бактериальные клетки. Но это преимущество ПЦР уместно рассматривать при сравнении с другими молекулярно-генетическими или иммунологическими методами диагностики. Использование ПЦР позволяет определять инфекционный агент непосредственно в биологическом материале с исключительно высокой чувствительностью — порядка 1−10 микроорганизмов при высокой специфичности, обеспечиваемой последовательностью нуклеотидов синтезируемого фрагмента ДНК.

Однако высочайшая чувствительность ПЦР обычно достигается при работе с чистой культурой микроорганизма или, что еще лучше, с очищенной нуклеиновой кислотой. Эта чувствительность автоматически не трансформируется в чувствительность метода при работе с клиническим материалом. На успех определения при работе с этим материалам влияют такие факторы, как методика приготовления образца, возможное присутствие ингибитора фермента, осуществляющего амплификацию, объем образца при низких концентрациях тестируемых молекул.

Высокая скорость получения результата анализа Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, занимающее большое количество времени. Унифицированный метод обработки материала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4−4,5 часа. Этим он выгодно отличается от других лабораторных методов, которые дают замедленные результаты[11].

1.5 ПЦР диагностика внелегочных форм туберкулеза Туберкулез поражает практически любой орган. По локализации различают: костно-суставный (встречается у 47% всех больных внелегочным туберкулезом); мочеполовых органов (37%); глаз (5,5%); мозговых оболочек (менингит — 4%); лимфатических узлов (2,5%); брюшины (1,5%); кожи (1,5%).

Совсем редко встречается туберкулез других органов: перикарда, надпочечников, кишечника и т. д. Внелегочными формами туберкулеза чаще болеют взрослые (79%) и реже — дети и подростки (соответственно 16% и 5%).

Независимо от места поражения цикл воспаления везде одинаков: очаг (гранулема) — расплавление его (казеоз) — образование полости распада (каверна) — возникновение при санировании фиброза (склерозирование). Начальные проявления заболевания при минимальных поражениях дают картину интоксикации организма. По мере распространения процесса его симптоматика зависит от нарушений, присущих пораженному органу.

Рекомендуемый для исследования материал:

— при гинекологическом туберкулезе — ткань эндометрия или биоптаты маточных труб;

— при туберкулезе костей у детей — фрагменты костей;

— при туберкулезе костей у взрослых — гной, некротические массы;

— при туберкулезе суставов — параллельное исследование синовиальной жидкости и синовиальной оболочки.

— при туберкулезном менингите — менингеальная жидкость

— при других внелегочных локализациях туберкулеза — биоптаты из очагов поражения (слизистая кишечника, биоптат надпочечников и т. д.).

Чувствительность и специфичность метода ПЦР для диагностики внелегочного туберкулеза ничуть не отличается от легочного туберкулеза. Можно сказать, что независимо от формы туберкулеза эффективность ПЦР диагностики остается самой высокой[12].

1.6 Роль метода ПЦР в дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания Заболеваний органов дыхания существует огромное количество, но мы разберем лишь часть из них, как показательный пример роли метода ПЦР в их дифференциальной диагностике с туберкулезом легких (см. табл. 1).

Таблица 1 — Основные дифференциально-диагностические признаки Туберкулеза легких и сходных заболеваний.

Основываясь на данные таблицы 1 можно сказать, что для дифференциальной диагностики органов дыхания нужно учитывать множество факторов, но метод ПЦР ставит окончательную «жирную точку» на постановке диагноза туберкулеза. Единственным значительным минусом этого метода является его дороговизна.

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа проводилась на базе бактериологической лаборатории Гомельской областной туберкулёзной клинической больницы (ГОТКБ).

2.1 Материалы исследования Исследованы культуры МБТ, полученные на ППС Левенштейна-Йенсена и жидкой (BACTEC MGIT 960).

Для обнаружения микобактерий туберкулеза проведено 46 исследований методом ПЦР.

19 проб взято после проведения исследования с помощью BACTEС MGIT 960

27 проб взято после проведения посева на плотные питательные среды Для определения лекарственной чувствительности взяты культуры, полученные на ППС Левенштейна-Йенсена и жидкой (BACTEC MGIT 960) у 30 пациентов.

2.2 Методы исследования Применялись следующие методы исследования:

DNA-STRIP-технологии и проведение молекулярно-генетической идентификации комплекса Mycobacterium tuberculosis и его устойчивости к ПТП.

Метод абсолютных концентраций для определения лекарственной чувствительности штаммов МБТ к противотуберкулезным препаратам. Определение лекарственной чувствительности МБТ к препаратам основного ряда с использованием автоматизированных систем (BACTEC MGIT 960) среды и ПЦР метод исследования.

2.2.1 Предварительная обработка мокроты Обработка мокроты 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na3PO4) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2−3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

Обработку материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия производят следующим образом:

Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе, заливают равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18−20 часов — в термостат при 37 °C. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10−15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0,8−1,0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Обработка с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NаOH).

Применение муколитического препарата N-ацетил-L-цистеина (NALC), используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1% при смешивании с пробой. Этот метод повышает высеваемость микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств. Ацетилцистеин в растворе быстро теряет активность, поэтому раствор нужно готовить ежедневно. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина.

Обработку материала NALC-NаOH производят следующим образом:

К 10 мл или меньше диагностического материала добавляют равный объем раствора NALC-NаOH, встряхивают в течение 10−20 секунд для перемешивания пробы, затем оставляют на 15 минут при комнатной температуре. Если необходима более эффективная деконтаминация, можно повысить концентрацию NaOH до 5−6%, не увеличивая время экспозиции пробы с деконтаминирующим раствором.

После 15-минутной экспозиции доводят объем пробы до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и центрифугируют при 3000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирают. Осадок немедленно засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

2.2.2 Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

Пробирка MGIT 960 содержит модифицированную бульонную основу 7H9. Примерная формула содержит следующие компоненты на 1000 мл дистиллированной воды:

— модифицированная бульонная основа Мидлбрук 7H9 — 5,9 г

— казеиновый пептон — 1, 25 г.

Формула корректируется с возможным внесением добавок в зависимости от функциональных требований. На дне пробирки имеется помещенный в силикон флуоресцентный датчик. Пробирку во время наполнения промывают 10% CO2, затем закрывают полипропиленовой завинчивающейся крышкой. Крышку открывать следует только в случае необходимости внесения каких-либо веществ в среду.

Для системы BACTEC MGIT 960 предусмотрена ростовая добавка MGIT (MGIT Growth Supplement. Добавку необходимо добавлять в пробирку MGIT до инокуляции пробы. В состав ростовой добавки MGIT на 1 000 мл дистиллированной воды входят:

— бычий альбумин 50,0 г

— декстроза 20,0 г

— каталаза 0,03 г

— олеиновая кислота 0,1 г

— полиоксиэтилена стеарат 1,1 г Для снижения риска контаминации используется смесь антибиотиков PANTA, которая вносится в пробирку MGIT до инокуляции проб вместе с обогатительной добавкой. Каждый флакон MGIT PANTA (для MGIT 960) содержит лиофилизированную смесь антибактериальных препаратов со следующей концентрацией на момент изготовления:

— полимиксин B 6,000 ед.

— амфотерицин B 600 мг

— налидиксовая кислота 2,400 мг

— триметоприм 600 мг

— азлоциллин 600 мг Процедура подготовки пробирок MGIT и посев образца.

a. Разведение лиофилизированной добавки PANTA

* Растворить PANTA (добавку с антибиотиками для подавления роста посторонней флоры) в 15 мл обогатительной добавки MGIT Growth Supplement, добавив ее во флакон с PANTA. Оставить на 15 минут.

* Добавить 0,8 мл полученного раствора в каждую пробирку MGIT непосредственно перед посевом материала.

* Все манипуляции проводить в ламинарном боксе IIкласса защиты.

b. Посев в пробирку MGIT

Все этапы работы должны выполняться только в ламинарном боксе IIкласса защиты.

* Внимательно осмотреть пробирку MGIT и убедиться, что она пригодна для работы (наличие силиконового кольца на дне пробирки, объем жидкости — 7 мл, крышка плотно закрыта).

* Написать на пробирках идентификационные лабораторные номера.

* С помощью стерильной одноразовой пипетки внести 0,5 мл ресуспендированного осадка в подготовленною пробирку MGIT и 0,1−0,25 мл в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена.

* Закрыть немедленно после внесения плотно крышку пробирки и аккуратно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы перемешать содержимое.

* Обработать снаружи пробирки и пробки дезсредством, поместить пробирки в штатив и оставить на 30 минут при комнатной температуре.

* Для исключения перекрестной контаминации и поддержания оптимальной концентрации углекислого газа в пробирках, всегда необходимо открывать только одну пробирку на минимально возможное время.

с. Меры предосторожности Основным источником контаминации среды MGIT являются микроорганизмы из окружающей среды, попавшие в пробирку во время внесения добавок и материала, поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

1. Все добавки вносить только в ламинарном боксе II-класса защиты.

2. Не открывать несколько пробирок одновременно.

3. Открывать пробирку MGIT на максимально короткое время.

4. При внесении ростовой добавки рекомендуется пользоваться дозатором.

5. Всегда плотно закручивать крышку. Если она сидит неплотно, могут возникнуть сложности с детекцией флуоресценции.

6. Проба, внесенная в пробирку объемом более 0,5 мл, может повлиять на показатель pH среды и вызвать ложную флуоресценцию, а также может усилить контаминацию.

d. Инкубация Все засеянные пробирки MGIT необходимо поместить в прибор. Протокол исследования на автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 -6 недель.

Температура инкубации для микобактерий туберкулеза + 37 °C, допустимые колебания температуры от + 35 °C до +38°С. В процессе инкубации встряхивание и перемещение пробирок запрещено.

е. Детекция положительного роста О появлении положительной пробирки прибор сообщает появлением красной индикации на наружной панели соответствующего ящика и значка «+», а также звуковым сигналом.

При наличии индикации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик; нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки»; извлечь пробирку из указанной прибором ячейки; считать штрих-код извлеченной пробирки.

Следует просмотреть пробирку и визуально определить наличие роста микобактерий. Обычно в жидкой среде микобактерии растут в виде своеобразной «зернистости» или белых хлопьев, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Как правило, рост микобактерий сосредоточен на дне пробирки. Сильное помутнение среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой.

Максимальное время инкубации пробирок в приборе MGIT — 42 дня. Пробирки, в которых размножение микобактерий не зафиксировано прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. В этом случае прибор сообщает появлением зеленой индикации на наружной панели соответствующего ящика и звуковым сигналом.

Для того чтобы извлечь «отрицательные» пробирки, необходимо открыть соответствующий ящик и нажать клавишу под иконкой «извлечь положительные пробирки» — прибор укажет зеленым световым сигналом на те пробирки, которые необходимо удалить. Необходимо извлечь пробирку из ячейки и отсканировать штрих-код, а также просмотреть пробирку, пытаясь визуально определить наличие возможного роста микобактерий и контаминации (мутность, дисперсность и т. д.)[13].

2.2.3 Молекулярно-генетическое исследование для идентификации видо микобактерий из культурального материала Выделение ДНК Исходным материалом для теста могут быть бактерии, выросшие как на плотной среде (Левенштайна-Йенсена, Миддлбрук), так и в жидкой (например, BACTEC, MB-check). Тест не подходит для детекции микобактерий из прямого материала пациентов. Рабочая площадь должна быть чистой от амплифицированной ДНК. Решающим моментом является нагревание образцов до 95 °C в течение 20 минут, чтобы обеспечить полный лизис клеток и инактивировать вегетативные бактерии. Можно применять любые методы выделения ДНК, позволяющие получить амплифицируемую ДНК из бактерий. Следующий краткий протокол позволяет получить ДНК, подходящую для амплификации:

1а. При работе с бактериями, выросшими на плотной среде, петлей отобрать бактерии и суспендировать в примерно 300 мкл воды (вода должна быть пригодна для молекулярно-биологических исследований).

1б. При работе с бактериями, выросшими на жидкой среде, в работу берётся 1 мл. Бактерии осаждают при центрифугировании в течение 15 мин при 10000g в стандартной настольной центрифуге с аэрозоль-непроницаемым ротором в ламинарном боксе II класса. Супернатант слить, а бактерии ресуспендировать на вортексе в 100−300 мкл воды.

2. Инкубировать бактерии из пп. 1а и 1б на водяной бане 20 минут при 95 °C.

3. Обработать пробу в ультразвуковой бане в течение 15 мин

4. Центрифугировать пробу на максимальной скорости 5 мин, и использовать 5 мкл супернатанта для ПЦР. Если предполагается более длительное хранение, то раствор ДНК необходимо перенести в новую пробирку.

Амплификация Подготовить амплификационную смесь (по 45 мкл) в чистой от ДНК комнате. Образцы ДНК следует вносить в пробирки в отдельном помещении.

Микс на одну пробирку:

— 35 мкл PNM — поставляется в наборе

— 5 мкл 10-кратного полимеразного буфера для инкубации — не поставляется

— х мкл раствора MgCl21) — не поставляется

— 1−2 единицы термостабильной ДНК-полимеразы (см. данные изготовителя) — не поставляется

— у мкл воды для доведения объёма до 45 мкл (без учета объема фермента) — не поставляется

— Добавить 5 мкл раствора ДНК (20−100 нг ДНК) для получения конечного объема 50 мкл (без учета объема фермента)

1) В зависимости от используемой системы фермент/буфер, оптимальная концентрация MgCl2. может варьировать между 1.5 и 2.5 мМ.

Обратите внимание, что некоторые инкубационные буферы уже содержат MgCl2. Конечная концентрация MgCl2 в этой амплификационной смеси составляет 2.5 мM.

Определяется количество образцов для амплификации (количество анализируемых проб + контрольные образцы). Проба контроля контаминации, например, содержит 5 мкл воды вместо раствора ДНК. Подготовить мастер-микс, содержащий все реактивы, за исключением раствора ДНК, и хорошо перемешать (не на вортексе). Аликвотировать по 45 мкл в каждую подготовленную ПЦР-пробирку.

Программа амплификации2:

15 мин 95 °C 1 цикл

30 сек 95°C

2 мин 58°C

25 сек 95°C

40 сек 53 °C 20 циклов

40 сек 70°C

8 мин 70 °C 1 цикл

2) Относительно Taq полимеразы, использованной для валидации: если применяется определённая hot start ДНК-полимераза, время, необходимое для первого этапа нужно сократить. Продукты амплификации могут храниться при температуре от +4 до -20°C. Для проверки реакции амплификации, можно нанести 5 мкл каждого образца прямо на 2% агарозный гель без добавления буфера.

Длина ампликонов составляет примерно 230 пар оснований (Контроль Рода) и до 200 пар оснований (Универсальный Контроль/видоспецифичный фрагмент) соответственно[14].

Гибридизация Подготовка Предварительно прогреть водяную баню с шейкером (рис. 3) до 45 °C. Максимально допустимое отклонение температуры ±1°C. Растворы HYB м STR нужно предварительно прогреть до 37−45°C. В реагентах не должно быть осадка (при этом обратите внимание, что раствор CON-D опалесцирует). При необходимости перемешать растворы. За исключением CON-C и SUB-C, довести остальные растворы до комнатной температуры. В подходящей пробирке разведите концентрат коньюгата (CON-C — оранжевый) и концентрат субстрата (SUB-C — жёлтый) в соотношении 1:100 с соответствующим буфером (CON-C с CON-D, SUB-C с SUB-D) в необходимом количестве. Хорошо перемешайте и доведите до комнатной температуры. Из рассчёта на каждый стрип: добавьте 10 мкл концентрата к 1 мл соответствующего буфера. CON-C разводится перед каждым использованием. Разведенный SUB-C можно хранить 4 недели в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Рис. 3 — Термошейкер .

1 Внесите по 20 мкл денатурирующего раствора (DEN, голубого цвета) в угол каждой ячейки.

2. Добавьте в раствор по 20 мкл продукта амплификации, перемешайте пипетированием и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. В это время пинцетом выньте стрипы из тубы и подпишите их карандащом под цветной полосой. Со стрипами работать только в перчатках!

3. Осторожно добавьте в каждую ячейку 1 мл предварительно нагретого гибридизационного буфера (HYB, зеленого цвета). Аккуратно покачивайте ванночку до получения гомогенного окрашивания. Следите, чтобы раствор не попал в соседние ячейки.

4. Поместите стрипы в ячейки.

Стрипы должны быть полностью погружены, а рабочая сторона (определяемая по цветной полосе на нижнем конце) должна быть лицом вверх. Если стрип перевернулся, его нужно поправить пинцетом. Во избежание контаминации тщательно мойте пинцет после каждого применения. Это важно и на всех последующих этапах теста.

5. Поместите ванночку на водяную баню с шейкером и инкубируйте 30 мин при температуре 45 °C. Установите скорость встряхивания водяной бани так, чтобы жидкость постоянно перемешивалась, но не попадала в соседние ячейки. Чтобы установить равномерное распределение температуры, ванночку погружают на 1/3 высоты.

6. Полностью аспирируйте Гибридизационный Буфер. К примеру, можно использовать пастеровскую пипетку, соединенную с вакуумным насосом.

7. Добавьте 1 мл Раствора для Жесткой Промывки (STR, красного цвета) в каждый стрип и инкубируйте 15 мин при 45 °C в водяной бане с шейкером.

8. Далее работайте при комнатной температуре.

Полностью удалите раствор для жесткой промывки. Вылейте моющий раствор в контейнер для отходов, а остатки жидкости удалите похлопыванием ванночки по фильтровальной бумаге. Таким же образом поступайте и при следующих этапах отмывки.

9. Отмойте каждый стрип в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) в течение 1 мин на платформе шейкера (слейте RIN после инкубации).

10. Добавьте по1 мл разведенного конъюгата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте 30 мин на платформе шейкера.

11. Удалите раствор и промойте каждый стрип дважды по 1 мин в 1 мл промывающего раствора (RIN) и один раз 1 мин примерно в 1 мл дистиллированной воды (используйте флакон для промывки) на платформе шейкера. После последней промывки тщательно удалите все остатки воды.

12. Добавьте 1 мл разведенного субстрата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте без встряхивания, защищая от света. В зависимости от условий теста (например, температуры в комнате), время субстратной инкубации может варьировать от 3 до 20 мин. Слишком длительная инкубация может привести к избыточному развитию окраски фона, и, тем самым может способствовать неправильной интерпретации результатов.

13. Остановите реакцию кратким двукратным промыванием дистиллированной водой.

14. Пинцетом удалите стрипы из ванночки и высушите их между двумя слоями фильтровальной бумаги[15].

2.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к Противотуберкулезным препаратам.

Проведение исследования происходит идентично вышеупомянутому. Меняется только набор стрип.

ГЛАВА 3

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Обнаружение и видовая идентификация МБТ