Жидкостная хроматография. 
Хроматографические методы анализа веществ

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или жидкостная хроматография высокого давления, основана на тех же принципах, что и ГЖХ, только вместо газа-носителя в качестве ПФ применяется поток жидкости, не смешивающейся с жидкой НФ хроматографической колонки. Таким образом, в ВЭЖХ обе контактирующие фазы — НФ и ПФ — жидкости. Разделение компонентов основано на различии их коэффициентов распределения между НФ и ПФ.

Температура хроматографической колонки может быть комнатной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса разделяемых веществ может достигать ~2000. На рисунке показана принципиальная блок-схема жидкостного хроматографа:

Резервуар 1 для растворителя из нержавеющей стали или другого материала можег иметь в аналитическом варианте обьем около 1 л. Насос 2 служит для подачи жидкой фазы из резервуара 1 под повышенным давлением. Он обеспечивает подачу жидкости со скоростью до 10 мл/мин при высоком давлении на входе в колонку — до 100—500 атм. Между насосом и колонкой устанавливается фильтр с диаметром пор около -10 мкм.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют насос низкого давления — до 10—20 атм.

Для ввода анализируемой пробы служит устройство 3. При давлении жидкости, превышающем ~120 атм, ввод пробы шприцем затруднителен, полому используют специальные многоходовые краны. Объем вводимой пробы может составлять 0,05—50 мкг.

Аналитическую хроматографическую колонку 4 обычно делают из нержавеющей стали или стекла толстостенной, длиной ~10—25 см (может быть и больше), с внутренним диаметром 3−8 мм. Предпочтительны прямые колонки.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют колонки меньшей длины с внутренним диаметром 1—2 мм и даже меньше.

Устройство для ввода пробы и хроматографическая колонка находятся в воздушном или водяном термостате 5, который поддерживает заданную температуру с точностью ±0,1 °С.

Рабочая температура термостатирования лежит между температурами замерзания и кипения жидкой ПФ, чаще всего — в диапазоне от 20 до 50 °C.

Система б включает детектор специального типа. Применяют спектрофотометрические (с постоянной или переменной длиной волны), рефрактометрические, адсорбционно-термометрические, флуориметрические детекторы и некоторые другие.

Детекторы бывают двух типов. Детекторы первого типа реагируют на изменение свойств растворителя (например, показателя преломления). Детекторы второго типа реагируют на свойства растворенного вещества, например, спектрофотометр и чес кие детекторы, обладающие высокой чувствительностью и селективностью.

Сигнал от детектора преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем на бумаге в виде хроматограммы, аналогичной хроматограмме в ГЖХ.

Используют наполненные хроматографические колонки, которые заполняют частицами твердого носителя с нанесенной на их поверхность тонкой пленкой жидкой ПФ. Размер зерен твердого носителя составляет 5—10 мкм. Твердый носитель готовят из поверхностно-пористых материалов — силикагеля с гидроксилированной поверхностью или с привитыми на поверхности различными функциональными группами; алюмогель, пористые стекла, полимерные сорбенты.

Заполнение колонок проводится пол высоким давлением, поэтому упаковка частиц внутри колонки получается плотной, что способствует высокоэффективному разделению компонентов смеси.

Жидкая НФ, наносимая на поверхность частиц твердого носителя, составляет 0,75—1,5% от массы твердого носителя.

Обычно для разделения полярных веществ используют полярные же НФ и относительно малополярные ПФ. Неполярные вещества разделяют на неполярных же НФ — применением полярных ПФ.

В качестве жидких НФ используют различные вещества, например:

в, в'-оксипропионитрил — для разделения фенолов, пероксидов, ароматических аминов, спиртов, а также углеводов, алкалоидов, стероидов; ПФ — циклопентан, гексан, гептан, хлороформ;

триэтиленгликоль — селективен по отношению к разделению спиртов, пероксидов, соединений с ОН-группами; ПФ — та же;

цианоэтилсиликон — для разделения сульфамидных производных, замещенных аминов и др.; ПФ — тетрагидрофуран, изопропанол.

Жидкие НФ несколько, хотя и незначительно, растворяются в ПФ и частично уносятся с ней. При повышенных скоростях движения ПФ механический унос жидкой НФ может стать заметным. Поэтому применяют ПФ, химически связанные с поверхностью частиц твердого носителя, например, твердые носители с химически связанными кремнийорганическими полимерами.

В ВЭЖХ используют как нормально-фазовый, так и обращенно-фазовый варианты. В первом случае полярность НФ больше полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.

В обращенно-фазовом варианте применяют твердый носитель из силикагеля с привитыми гидрофобными группами. В этих случаях в качестве ПФ используют смесь воды с низкомолекулярными спиртами или с ацетонитрилом.

ВЭЖХ очень широко применяется для идентификации, разделения и определения самых различных веществ: оптически активных соединений, белков, нуклеиновых и аминокислот, полисахаридов, красителей, взрывчатых веществ, биологических сред, лекарственных препаратов и т. д. Метод используют для проведения профильного хроматографического анализа медицинско-биологических объектов в случаях патологических отклонений от нормы — так называемый «метод распознавания образов».

При технологическом и фармакопейном контроле качества лекарственных субстанций и лекарственных форм ВЭЖХ стала одним из основных методов определения как самих фармакологически активных веществ, так и вспомогательных компонентов и посторонних примесей.

Так, например, методом ВЭЖХ анализируют лекарственные препараты альдактон, амизол, вальпроат натрия, глиборал, диклофенак натрия, козаар, кофеин, лидокаина гидрохлорид, мелоксикам, месалазик, парацетамол, пилокарпина гидрохлорид, пирацетам, соталола и цетилпиридина гидрохлориды, флуконазол и многие другие.