Производство Амилосубтилина — амилолитического ферментного препарата Aspergillus Niger на послеспиртовой барде

Производство Амилосубтилина — амилолитического ферментного препарата Aspergillus Niger на послеспиртовой барде Производство собственного Амилосубтилина (альфа-амилазы) на послеспиртовой барде — амилолитического ферментного препарата Aspergillus Niger — очень выгодно для любого спиртового завода.

Всем известно, что стоимость импортных концентрированных ферментных препаратов для осахаривания зернового сусла на спиртовом заводе составляет 20 Евро за 1 литр фермента. Таким образом, для завода с производительностью 3000 Дал спирта в сутки расходы на приобретение импортных концентрированных ферментных препаратов составляют несколько десятков миллионов в год.

В этой статье показана возможность получения активной по амилолитическим ферментам грибной культуры, выращиваемой глубинным способом на послеспиртовой зерновой барде и применяемой для осахаривания крахмалистых сред взамен солода, непосредственно на спиртовом заводе. Это позволит сохранить немалые средства и получить конкурентное преимущество.

На схеме производства спирта из зерна можно видеть, что для разжижения крахмала в зерновом замесе достаточно применить лишь a-Амилазу (т.е. Амилосубтилин), а для осахаривания крахмала — Глюкоамилазу (т.е. Глюкавоморин) послеспиртовый барда фермент грибной.

В связи с тем, что многие спиртовые заводы, перерабатывающие зерно и картофель, переходят на совместную переработку зерна и патоки, также представляло интерес проверить возможность развития плесневых грибов на смешанной барде и определить активность образующихся амилолитических ферментов.

Как пишет А. П. Смирнова, для получения смешанной зерновой и паточной барды на опытном заводе ЦНИИСПа было проведено совместное сбраживание зерна и патоки. Патока была получена с Московского дрожжевого завода, содержала 48% Сахаров и имела слабощелочную реакцию. На переработку было взято 200 кг нормальной ржи и 100 кг патоки. Патоку разбавляли до концентрации 28% и. подкисляли серной кислотой до О, Г. В период главного брожения зернового сусла в него при непрерывном продувании воздуха открывали приток сусла. Температуру брожения поддерживали на уровне 30°. Брожение заканчивалось через 48 часов. Смешанная бражка имела видимый отброд 2,9%, истинный 5,3% и кислотность 0,35 .

Одновременно в дрожжанке было проведено брожение той же партии патоки, отогнан спирт и получена паточная барда.

Паточная бражка имела видимый отброд 6,0°, истинный 9,2° и кислотность 0,35°.

Из ржаной бражки также была получена барда. Отброд ржаной бражки был равен 1,3%, истинный 3,8% и кислотность 0,25°. На полученных образцах барды, характеристика которых дана в табл. 1, был выращен глубинным способом гриб Aspergillus Niger, полученный методом вегетативной гибридизации [5]. Посев был проведен мицелиальной культурой, выращенной на смешанной барде в течение суток. На посев взято 10% культуры к объему среды. Культивирование гриба проводилось на лабораторной качалке при температуре 30°. Срок роста культуры — трое суток. К барде добавляли 0,2% магнезита. Как показали исследования, добавление к питательной среде магниевых солей создает оптимальную для роста гриба реакцию среды и повышает активность ферментов [2].

Таблица 1 Характеристика барды.

Ежедневные наблюдения за ростом гриба позволили отметить замедленное развитие его на паточной барде. Так, через 24 часа роста во всех опытных колбах наблюдалось хорошее развитие мицелия, в то время как на паточной среде рост только намечался.

Как видно из данных табл. 2, активность амилолитических ферментов, получаемая при выращивании Aspergillus Niger S4 на ржаной барде смешанной и паточной, различается в основном по мальтазе (МС). МС у гриба, выращенного на паточной барде, значительно ниже, чем у выращенного на зерновой барде. Активность культуры гриба, полученной на смешанной барде, по мальтазе занимает среднее положение между культурами, выращенными на зерновой и паточной барде. Добавление 2% муки к субстрату резко повышает активность амилазы и декстриназы, однако активность мальтазы при выращивании на паточной барде вдвое ниже, но сравнению с зерновой.

Таблица 2. Влияние состава среды на активность грибной культуры ASPERGILLUS NIGER S4.

Следующий опыт был проведен с выращиванием ASPERGILLUS NIGER S4 на субстратах, составленных смешиванием различных количеств ржаной и паточной барды.

Культуру гриба анализировали через трое и четверо суток роста. Как видно из данных табл. 3, по мере снижения в субстрате количества зерновой барды и увеличения паточной активность мальтазы грибной культуры резко падает, а в варианте, где паточная барда составляет 70%, и на чисто паточной барде активность мальтазы вовсе отсутствует. Значительно ниже в этих вариантах и активность декстриназы.

Таблица 3 Влияние состава среды на активность амилолитических ферментов гриба Aspergillus Niger S4.

В данном опыте среда была засеяна суспензией конидий, что, видимо, отразилось на общей активности амилолитических ферментов полученной культуры.

Мицелий гриба, окрашенный нейтральным красным, просматривали под микроскопом. Окрашивание мицелия дает возможность наблюдать за структурными изменениями, происходящими в клетках гриба.

Отмечено, что при больших дозировках паточной барды в субстрате мицелий имеет укороченные гифы. Клетки мицелия более толстые, а вакуоли прокрашиваются в розовый и густо розовый цвет. Многие вакуоли плазмолизированы. Это явление характерно при недостатке кислорода в среде. Такое состояние мицелия наблюдалось нами ранее при выращивании гриба на упаренной барде [3]. В данном случае, видимо, растворимость кислорода в паточной барде, содержащей большое количество органических и солевых растворимых веществ, недостаточна. Следует отметить, что на одной барде без добавления муки срок роста гриба не должен быть выше трех суток. На четвертые сутки наступает автолиз мицелия, а в связи с этим повышение реакции среды (рН 7—8) и инактивация ферментов.

В следующем опыте в течение трех суток на различных вариантах смеси ржаной и паточной послеспиртовой барды выращивалась культура гриба ASPERGILLUS USAMII штамм 3. Этот штамм гриба был получен в нашей лаборатории облучением ASPERGILLUS USAMII ультрафиолетом и показал высокую активность амилолитических ферментов. В настоящее время он применяется для осахаривания сред на Гадовском спиртовом заводе. В смесь послеспиртовой барды добавляли магнезит и муку. Посев проводили суточной культурой мицелия, выращенной на ржаной спиртовой барде. Как видно из данных табл. 4, на всех вариантах среды была получена грибная культура с высокой активностью амилолитических ферментов. Особенно следует отметить наиболее высокую в варианте активность мальтазы на чисто паточной барде (с добавлением муки). Видимо, гриб ASPERGILLUS USAMII иначе реагирует на состав барды, чем штамм гриба Aspergillus Niger S4, так как при выращивании последнего на паточной барде получается либо культура с очень низкой активностью мальтазы, либо эта активность вовсе отсутствует. Полученные культуры гриба были использованы на осахаривание ржаных сред, которые готовили из 50 г муки.

Таблица 4 Влияние различных количеств паточной барды на активность амилолитических ферментов грибаASPERGILLUS USAMII штамм 3.

На осахаривание применяли 4 и 8% культуры к объему среды. Брожение велось в течение трех суток. В качестве антисептика применяли раствор SO2 из расчета 250 мг/л среды.

В бражке определяли количество несброженных Сахаров и крахмала. Содержание, спирта определяли погружным рефрактометром и количество его рассчитывали на содержимое всей колбы, в которой подвергалось брожению 50 г муки.

Исходя из данных табл. 5 и судя по содержанию в бражке несброженных Сахаров и крахмала, можно видеть, что для полного осахаривания и брожения достаточно внесения 4% грибной культуры, полученной на всех указанных вариантах среды. Однако при внесении на осахаривание 8% грибной культуры выход спирта получается выше. Естественно, что в этом случае происходит более полный гидролиз других составных частей муки, помимо крахмала, и в первую очередь — гемицеллюлез.

Таблица 5 Качество брожения зерновых заторов при осахаривании грибной культурой Aspergillus USAMII 3, выращенной на зерно-паточной барде.

Таким образом, следует отметить, что на барде, полученной при совместном сбраживании зерна и патоки, а также на паточной барде можно получать грибную культуру, по активности амилазы и декстриназы равную культуре, выращенной на чисто зерновой барде. Активность грибной культуры резко возрастает при добавлении к барде 2% муки. Мальтазная активность плесневого гриба ASPERGILLUS NIGER S4 при культивировании его на паточной послеспиртовой барде и смешанной (зерно-паточной) низка или вовсе отсутствует.

Гриб Aspergillus UAMII штамм 3 выделяет активный комплекс амилолитических ферментов как на смешанной, так и на паточной барде, с добавлением муки и магнезита.

Выводы.

1. Гриб Aspergillus Niger S4 нормально развивается на смешанной зерно-паточной барде, образуя ферменты амилазу и декстриназу, равные по активности грибной культуре, выращенной на зерновой барде.

На паточной барде обнаруживается задержка в развитии гриба.

• 2. Активность мальтазы у Aspergillus Niger S4, выращенного на смешанной барде, очень низка, на паточной барде она отсутствует вовсе.
• 3. При добавлении в смешанную барду муки активность ферментов грибной культуры возрастает как на чисто зерновой, так и паточной барде, однако активность мальтазы гриба, выращенного на паточной барде с добавлением муки, вдвое ниже по сравнению с культурой, выращиваемой на зерновой барде.
• 4. Гриб Aspergillus USAMII штамм 3 образует активный комплекс ферментов как на смешанной послеспиртовой барде, так и на паточной при добавлении 2% муки и 0,15% магнезита. 4% такой культуры достаточно для полного осахаривания зерновых сред.

Подробнее о выращивании см. нормы технологического проектирования здесь: ВНТП 34−93.

Технологический процесс производства ферментов оптимизирован на базе НИИ Физиологии и биохимии микроорганизмов, г. Пущино.

Проектная и рабочая документация разработана Открытым акционерным обществом «Тамбовский завод „Комсомолец“ имени Н. С. Артемова». .