Подготовка биологического материала для биохимических исследований

Принцип метода. Метод основан на поэтапном осаждении отдельных клеточных фракций, сравнительно мало отличающихся по удельному весу, но резко различных по размеру.

Выделение ядерной фракции (диаметр частиц 3000−8000ммк; плотность 1,286−1,328г/см³).

10 мл 10% гомогената (вес:объем) центрифугируют при 600g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) сливают; осадок же, содержащий ядра, неразрушенные печеночные клетки и эритроциты, дважды промывают, суспендируя каждый раз в 2,5 мл 0,25 М сахарозы в трис-НС1 буфере рН 7,4 и центрифугируя при 600g 10 мин. Смывы объединяют. Промытый осадок суспендируют в сахарозе (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как ядерную фракцию (разведение в 2,5 раза в расчете на исходную ткань).

Выделение митохондриальной фракции (диаметр частиц 300−1000ммк; плотность 1,188−1,221 г/см³).

Объединенные надосадочную жидкость и смывы центрифугируют при 8500g в течение 10 мин. Супернатант сливают, а осадок дважды промывают 0,25 М сахарозой в 0,01 М трис-HCl буфере рН 7,4 (по 2,5 мл), центрифугируют каждый раз при 8500g 10 мин. Полученный осадок суспендируют (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как митохондриальную фракцию (разведение в 2,5 раза).

Выделение микросомной фракции (диаметр частиц 15−300 ммк; плотность 1,040−1,180 г/см³).

Данная фракция объединяет разнородные по морфологическому и биохимическому составу частицы. К ним относятся подфракция рибонуклеопротеидных частиц, участвующих в рибосомальном синтезе белка. Вторая подфракция содержит, главным образом, микросомальные мембраны, образующиеся из мембран эндоплазматического ретикулума.

Объединенный супернатант и промывные жидкости центрифугируют при 18000g в течение 60 мин. Полученный супернатант сливают, осадок суспендируют в 2,5 мл сахарозы и вновь центрифугируют при 18000g 60 мин. Осадок суспендируют в сахарозе (конечный объем 2,5 мл) и обозначают как микросомную фракцию (разведение в 2,5 раза).

Фракция супернатанта, или надосадочной жидкости Полученный супернатант объединяют со смывом и доводят до объема 25 мл (разведение в 25 раз).

Реактивы

1. 0,05 М трис-HCl буфер, рН 7,4.

Готовят 0,2 М трис — 24,2 г/л Смешивают 25 мл 0,2 М трис с 42,5 мл 0,1 М НС1 и доводят до 100 мл водой; 0,05 М трис-HCl буфер разводят в 5 раз.

2. Среда выделения: 0,25 М сахароза в 0,01 М трис-HCl буфере рН 7,4. 85,58 г сахарозы растворяют в 1л 0,01 М трис-HCl буфера.

• 1. Современные методы в биохимии /под ред. Ореховича В. Н. М: Медицина, 1968. С.5−59.
• 2. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest, 1968, V.21.S.97. -P.77−89.
• 3. Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. Санкт-Петербург, 2000. — С.22−23.