Практикум по энзимологии

В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин

ПРАКТИКУМ ПО ЭНЗИМОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

ПЕНЗА

Печатается по решению редакционно-издательского совета Пензенского государственного педагогического университета им. В. Г. Белинского УДК 577.1

Соловьев В. Б. Практикум по энзимологии: учебно-методическое пособие / В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин. — Пенза, 2007. — 52 с.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия».

© Соловьев В. Б., 2007

© Генгин М. Т., 2007

© ПГПУ им. В. Г. Белинского, 2007

Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:

1. Методы определения активности ферментов.

2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.

3. Методы выделения и очистки ферментов.

4. Изучение субклеточной локализации ферментов.

5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.

Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.

Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.

Все замечания и пожелания будут приняты авторами с благодарностью.

Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы

Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10%); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2−3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):

Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:

5H₂O₂ + 2KMnO₄ + 3H₂SO₄ > 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 5O₂ + 8H₂O,

согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.

Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 — 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7•1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить = 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин — (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.

Содержание отчета

1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.

2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

Работа 2. Фотометрическое определение активности трипсина

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, паранитроанилин, 100 мкМ раствор бензоил-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА) в фосфатном буфере *, раствор трипсина (10 мкг/мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl, ацетон.

* Приготовление раствора БАПНА. 43,5 мг препарата суспендируют в 1 мл ацетона, после этого прибавляют примерно 80 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6). Смесь нагревают в водяной бане при температуре 75−80°С до полного растворения препарата, затем доводят объем до 100 мл. Раствор можно хранить в течение месяца в темном месте.

** Приготовление раствора трипсина. 3 мг фермента растворяют в 3 мл 0,0025 н HCl, получается маточный раствор. Рабочий раствор готовят путем стократного разведения маточного раствора дистиллированной водой (500 мкл маточного раствора трипсина помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят дистиллированной водой до метки).

1. Для расчета удельной активности препарата фермента строят калибровочный график по пара-нитроанилину (п-НА). Для этого в 11 пробирках готовят растворы п-НА разных концентраций путем смешивания 100 мкМ раствора п-НА и дистиллированной воды по следующей схеме.

В пробах определяют величину оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-3 (или КФК-2) при 364 нм и строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации п-НА.

2. Для определения активности препарата трипсина берут 6 пробирок — 3 опытных и 3 контрольных. Активность фермента определяют по следующей схеме.

Реакционную смесь переливают в кюветы и измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п_НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой.

Содержание отчета

1. Калибровочный график по пара-нитроанилину:

2. Рассчитайте активность фермента.

3. Напишите рекомендуемое систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.

Работа 3. Флюориметрическое определение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы

Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ_КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ*, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR)**, 1 н HCl, хлороформ, печень животного, реактив Фолина, реактивы, А и В для метода Лоури.

* Приготовление раствора ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ растворяют в 5 мл дважды перегнанного этилового спирта.

** Приготовление раствора DNS-FLR: К 1 мг DNS-FLR дозатором прибавляют 50 мкл метанола, а затем — 7,5 мл натрий-ацетатного буфера рН=5,6.

200 мг печени гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат хранят на льду. Пробирки каждой параллели (3 опытных и 3 контрольных) помещают, предварительно подписав, в один штатив. Раскапывают реактивы по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течении 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (л_ех=360 нм, л_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури (см. примечание 1) Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =

Содержание отчета

1. Рассчитайте активность фермента в исследуемом материале.

2. Опишите фермент и его предполагаемую биологическую роль. Напишите предполагаемый систематический код фермента.

Работа 4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза трипсином бензоил-аргинин-пара-нитроанилида методами Лайнуйвера-Бэрка и Эйзенталя-Корниш-Боудена. Определение типа ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, растворы БАПНА следующих концентраций: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, раствор трипсина (10 мкг/мл), раствор ингибитора трипсина* (10 мкг/мл), 1 н HCl.

* Приготовление раствора ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Рабочий раствор готовят непосредственно перед опытом путем стократного разведения исходного раствора дистиллированной водой.

Для определения V_max и К_м данной реакции, а также типа ингибирования трипсина строят график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора (в системах координат Лайнуйвера-Берка и Эйзенталя-Корниш-Боудена). Для каждой концентрации субстрата выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.

Активность фермента в присутствии ингибитора определяют по схеме.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости строят на миллиметровой бумаге.

Содержание отчета

1. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Лайнуйвера-Бэрка.

2. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Эйзенталя и Корниш-Боудена.

Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.

1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами БАПНА с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.

2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:

а) при комнатной температуре;

б) при 4 °C (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);

в) на водяной бане при t=55 °С;

г) на водяной бане при t=75 °С.

Содержание отчета

1. График зависимости активности трипсина от рН среды.

2. График зависимости активности трипсина от температуры.

Работа 6. Определение константы ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого методом Диксона

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, 1 мМ раствор БАПНА, раствор трипсина (10 мкг/мл), растворы ингибитора трипсина следующих концентраций:10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл*, 1 н HCl.

* Приготовление растворов ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Получают маточный раствор с концентрацией 1 мг/мл. Рабочие растворы готовят непосредственно перед опытом путем разведения маточного раствора в необходимом соотношении дистиллированной водой.

Определяют активность трипсина при различных концентрациях субстрата и ингибитора. Для каждой концентрации ингибитора выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости обратной скорости от концентрации ингибитора и зависимости s/v от концентрации ингибитора строят на миллиметровой бумаге.

Содержание отчета

1. Определите константу ингибирования методом Диксона.

Работа 7. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс фракционированием сульфатом аммония

Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ_КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, кристаллический сульфат аммония, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.

4 г печени животного гомогенизируют на льду в 20 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.

Все дальнейшие операции производят на льду. Измеряют объем оставшегося центрифугированного гомогената. Добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 10% концентрации и тщательно перемешивают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течении 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают и измеряют объем. К осадку добавляют исходный буфер до полного растворения, затем разводят этим же буфером в 10 раз и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка.

К надосадочной жидкости добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 20% концентрации, центрифугируют, отделяют осадок, растворяют его в буфере, разводят в два раза буфером и помещают на лед. Повторяют операцию по высаливанию, добавляя сульфат аммония к надосадочной жидкости до достижения 60% концентрации. Осадок, отделенный центрифугированием ресуспендируют в исходном буфере и разбавляют в десять раз. Во всех фракциях, гомогенате и конечном супернатанте определяют активность по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (л_ех=360 нм, л_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют методом Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ, и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =

Содержание отчета

1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.

Работа 8. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс методом гель-фильтрации

Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, колонка для гель-фильтрации высотой 15 см, шприц, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ_КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекс G₇₅, 0,9% раствор NaCl, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.

Сефадекс G-75 суспендируют в 5−10 кратном объеме дистиллированной воды и оставляют для набухания на 3 часа. Затем перемешивают до однородной массы, дают отстояться. После оседания основной массы геля осторожно декантируют надосадочную жидкость с неосевшими обломками гранул. Суспендирование и последующую декантацию (отмучивание) повторяют 3−4 раза.

Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора NaCl, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию геля. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию геля прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 1 объемом NаС1.

100 мг печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. Центрифугированный гомогенат помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.

Открывают зажим колонки и сливают столб раствора NaCl, находящийся над сефадексом. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя, снова дают впитаться. Затем заполняют колонку раствором NaCl, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. С момента нанесения образца на колонку собирают 10 фракций объемом 1 мл.

Во 2, 4, 5, 6, 7, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (л_ех=360 нм, л_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури.

Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =

Содержание отчета

1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.

Работа 9. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на карбоксиметилцеллюлозе)

Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ_КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,5 и 6,0; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.

Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию КМЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию КМЦ прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5.

2 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.

Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 3,5, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.

Затем фермент элюируют 0,05 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 6,0. С момента нанесения этого буфера на колонку собирают 10 фракций объемом 3 мл.

Во 2, 3, 4, 5, 6, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (л_ех=360 нм, л_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =

Содержание отчета

1. Определите степень очистки ФМСФ-КП

Работа 10. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на диэтиламиноэтилцеллюлозе)

Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ_КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl (рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 6,0; 1 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH 3,7; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.

Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию ДЭАЭЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию ДЭАЭЦ прибавляют до тех пор, пока ее высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0.

4 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 100 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 4,9 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.

Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH 6,0, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.

Затем фермент элюируют 1 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH 3,7. С момента этого буфера на колонку собирают 12 фракций объемом 2 мл.

Во 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.

После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (л_ех=360 нм, л_ем=530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:

а =

Содержание отчета

1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.

Работа 11. Изучение субклеточного распределения ДНКазы (фермента-маркера ядерной фракции) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга с охлаждением; ФЭК; гомогенизатор; печень животного; пипетки; ДНК; 0,1 М NaOH; 0,01% раствор крезолового красного; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 мМ MgCl₂•6H₂O рН 5,0 (среда Б); набор растворов для определения белка по Лоури.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по следующей схеме.

Ресуспендирование проводят гомогенизированием полученных осадков в 4−6 мл среды гомогенизации (б), затем полученную суспензию переносят количественно в мерный цилиндр на 20 мл и объем суспензии доводят до 18 мл; таким образом, концентрация субклеточных структур достигает исходной (как в гомогенате) концентрации.

Активность ДНКазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

Смесь быстро переливают в фотометрическую кювету (L=1 см) и измеряют оптическую плотность на ФЭК при 590 нм против буфера А. После измерения смесь немедленно переливают в исходную пробирку и инкубируют 20 мин при 37 °C. Измеряют оптическую плотность системы после инкубации. Количество белка определяют по Лоури.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 12. Изучение субклеточного распределения кислых протеаз (ферментов-маркеров лизосом) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 мМ MgCl₂•6H₂O рН 5,0 (среда Б).

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 мМ MgCl₂•6H₂O рН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.

* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:

а) кинетическая схема определения активности.

Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l = 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.

Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.

б) стационарная схема определения активности.

Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.

Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.

Содержание отчета

1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.

Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях

Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5•10^-5 М)***.

* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.

** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na₂SO₃ приливают 11,3 мл 1 н HCl и 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН₂РО₄ растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.

**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.

Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.

Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.

Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.

Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.

Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.

Содержание отчета

1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.

2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:

Работа 15. Определение глюкозы в крови человека с использованием ферментных электродов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматический анализатор Roche Omni S 6**.

*Для работы используется капиллярную кровь из пальца. Палец обработать ватой, смоченной медицинским спиртом, произвести прокол скарификатором с помощью автоматической ручки-прокалывателя. Кровь собирать в стеклянный капилляр Roche.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

В ферментных электродах фермент и электрод образуют единую конструкцию, не требующую для функционирования дополнительных реагентов, кроме буферных растворов. Такие электроды получили название «безреагентных» датчиков, а основанные на их использовании методы анализа называются «безреагентными». Для определения глюкозы используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная ковалентным связыванием с полупроницаемой поликарбонатной мембраной. Измерение осуществляется с помощью амперометрии. Операционные характеристики электрода остаются стабильными на протяжении двух-четырех недель.

Проведите измерение трех разных образцов крови. Переведите прибор в режим работы с капиллярной кровью. Снимите верхнюю крышку с анализатора для ознакомления с ходом распределения образца крови во время анализа. Поместите капилляр с образцом в диск-приемник (Fill Port). Активируйте всасывание образца. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Изучите распределение образца крови и прохождение буферных и промывающих растворов. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений глюкозы в крови.

2. Зарисуйте схемы устройства ферментного электрода и автоматического анализатора.

Работа 16. Определение мочевины в крови человека с использованием ферментных реагентов

Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматическая пипетка с наконечниками, биохимический анализатор Рефлотрон +.

*Забор крови осуществляется в капилляр, как описано в работе № 14.

** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.

Биохимический анализатор Рефлотрон предназначен для экспресс-анализа образцов свежей крови и сыворотки человека. Прибор не требует для работы никаких реактивов, кроме тест-полосок для однократного определения исследуемых веществ. Тест-полоска для определения мочевины содержит лиофилизированный фермент уреазу и индикатор в лейко-форме. Образец нагревают, и мочевина, содержащаяся в образце, при 37?°С расщепляется с образованием аммиака и оксида углерода. Это ведет к частичной смене окраски индикатором на зелено-голубую, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству мочевины в пробе:

(NH₂)₂CO + H₂O = 2 NH₃ + CO₂

NH₃ + индикатор (бесцветный) = NH₄⁺ + индикатор (сине-зеленый).

После 3 минут, необходимых для инкубации образца, измеряется оптическая плотность по принципу рефлексионной фотометрии. На тест-полоске имеется магнитная лента с информацией об анализе. Прибор считывает информацию об анализе и пересчитывает оптическую плотность в концентрацию.

Приготовьте тест-полоску для анализа. Удалите с ее поверхности защитную алюминиевую полоску. Дозатором отмерьте 32 мкл образца и нанесите его в центр зоны аппликации, не касаясь наконечником тест-полоски. Откройте крышку прибора и поместите тест-полоску в анализируемую зону. Закройте крышку. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.

Содержание отчета

1. Запишите результаты определений мочевины в крови.

Работа 17. Иммуноферментное определение тестостерона в сыворотке крови

Оборудование и реактивы: сыворотка крови человека, автоматическая пипетка с наконечниками, набор стандартных растворов тестостерона с известными концентрациями, иммуноферментный коньюгат, субстратный раствор, стоп-раствор, стрипы с иммобилизованными моноклональными антителами к тестостерону, инкубатор для планшет, вошер для планшет, иммуноферментный ридер планшет.

Тест-система ИФА для определения тестостерона основана на принципе конкурентного связывания. Лунки микротитра покрыты антителом к уникальному антигенному сайту на молекуле тестостерона. Эндогенный тестостерон в пробе конкурирует с конъюгатом тестостерона и пероксидазы хрена за связывание с антителом, которое сорбировано на микропанелях. После инкубации несвязавшийся конъюгат смывается. Количество связавшегося конъюгата обратно пропорционально концентрации тестостерона в образце. При добавлении субстратного раствора интенсивность полученного окрашивания обратно пропорциональна концентрации тестостерона в сыворотке.

Общие замечания к проведению анализа

? Все пробы и реагенты перед проведением анализа должны быть доведены до комнатной температуры. Смешивание реагентов надо осуществлять, избегая вспенивания.

? После начала проведения теста следует осуществлять все этапы последовательно без прерывания.

? Для каждого реагента используйте новые чистые пластиковые наконечники микропипеток для исключения перекрестной контаминации. Для раскапывания субстрата и останавливающего раствора не следует использовать пипетки с металлическими частями.

? Вносите стандарты и пробы в нижнюю часть лунки с помощью микропипетки. Что касается внесения Иммуноферментного Конъюгата и Стоп-раствора, рекомендуется держать пипетку вертикально и направлять падающую каплю строго в центр лунки для осуществления полного перемешивания указанных компонентов.

? Перед постановкой теста рекомендуется подготовить все реагенты, снять крышки, закрепить в держателе необходимое количество полосок с лунками. Это обеспечит равные затраты времени на все необходимые этапы ИФА и предотвратит задержки пипетирования.

? В целом ферментативная реакция обычно линейно пропорциональна времени проведения и температуре. Это делает возможной интерполяцию для физико-химических условий реакции. В частности, если величина абсорбции нулевого стандарта ниже 1,0 или же превышает верхний уровень возможного измерения для используемого ридера, можно изменить время инкубации с субстратом до 30 мин, или же до 10 мин, соответственно этим наблюдениям.

? Поскольку калибрующие стандарты проставляются в каждом тесте, флюктуации абсолютных величин абсорбции не отражаются на конечном результате ИФА.

? Раствор субстрата перед использованием должен быть бесцветным или иметь чуть различимый голубовато-зеленоватый оттенок. Наличие выраженного голубого окрашивания указывает на непригодность субстрата. Его следует заменить!

? Во время инкубации с Субстратом следует защитить микротитровальные панели от света.

ЗАБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ АНАЛИЗА

1. Для исследования надо использовать сыворотки, или же плазму после обработки EDTA. Не требуется какой-либо дополнительной подготовки проб. Пробы для анализа можно хранить при 2 — 8 °C до 5 дней, при необходимости более длительного хранения пробы необходимо замораживать и хранить при — 20 °C или более низкой температуре. Не используйте пробы с выраженным гемолизом или с повышенным содержанием липидов.